于寶海 王亞軍 賈洪男 趙俊國 孫奎倉 張 婷

（1承德市土壤肥料工作站 河北 承德 067000；2豐寧縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局 河北 承德 067000；3承德市農(nóng)林科學院 河北 承德 067000）

隨著農(nóng)業(yè)科技的發(fā)展，農(nóng)藥和化學肥料被廣泛應用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，但藥物殘留對農(nóng)產(chǎn)品和環(huán)境造成嚴重影響。為保證糧食和環(huán)境安全，農(nóng)家肥和有機肥的施用顯得尤為重要。研究表明，增施有機肥不僅能為作物生長提供營養(yǎng)，提高作物抗病能力，而且還能夠提高土壤肥力，改善土壤環(huán)境，為綠色農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供有利條件[1]。

豐寧滿族自治縣位于河北省北部，地處北緯40°35′～42°0′，東經(jīng)115°14′～117°24′，海拔400～1 500 m，屬冀北山區(qū)。近年來，由于氣候不斷惡化，降水量明顯減少。而谷子作為一種重要的谷類作物，具有耐干旱、耐貧瘠和抗逆性強等特點，是該縣具有發(fā)展前景的農(nóng)作物。早在2015年豐寧縣委縣政府就把有機農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)作為主導產(chǎn)業(yè)發(fā)展，并把有機谷子的生產(chǎn)作為重點項目來抓。有機谷子生產(chǎn)過程中不得使用任何化學肥料，必須使用有機肥。本試驗旨在探究增施商品有機肥對谷子耕地土壤微生物的影響，分析施肥前后土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化，為豐寧滿族自治縣有機谷子種植過程中合理施肥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況。試驗地位于豐寧縣黃旗鎮(zhèn)有機農(nóng)業(yè)土壤培肥改良利用技術(shù)示范區(qū)，土壤類型為棕壤。試驗耕地已連續(xù)3年施用農(nóng)家肥(腐熟牛糞)，有機質(zhì)含量為55.5%，氮含量為1.57%，磷含量為0.085%，鉀含量為0.32%，施用量為1 800 kg/畝。有機肥為商品有機肥，有機質(zhì)含量≥45%，氮磷鉀含量≥5%。種植谷子品種為山西紅谷。

1.2 試驗設(shè)計。根據(jù)地區(qū)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的施肥水平及土肥站測土配方要求，在有機谷子生產(chǎn)過程中進行農(nóng)家肥和商品有機肥的配施，以改善土壤結(jié)構(gòu)，提高土壤肥力。試驗設(shè)4個處理：對照組(gz1)，只施農(nóng)家肥、不施商品有機肥，用量1 800 kg/畝；處理組(gz2)，施商品有機肥350 kg/畝+對照等用量農(nóng)家肥；處理組(gz3)，施商品有機肥700 kg/畝+對照等用量農(nóng)家肥；處理組(gz4)，施商品有機肥1 000 kg/畝+對照等用量農(nóng)家肥。播種前以農(nóng)家肥作底肥，中耕前追施商品有機肥。小區(qū)面積30 m2，播種行距45 cm，采用隨機區(qū)組排列。各處理除施肥水平不同外，田間管理一致。

1.3 土壤樣品采集及預處理。于谷子成熟期，以五點取樣法采集各處理組土壤樣品，放于密封袋中，帶回實驗室，備用。稱取200～500 mg的樣品，放入滅菌離心管中，加入1xPBS溶液，震蕩混勻后置于室溫下，10000r/min離心3min，棄上清，將離心管倒置于吸水紙上1 min，直至沒有液體流出。采用E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit試劑盒提取土壤樣品DNA。

1.4 土壤微生物分類檢測。DNA樣品質(zhì)檢合格后，利用細菌16SV3-V4區(qū)通用引物341F(5’-CCTACGGGNGGCWGCAG-3’)和805R(5’-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3’)進行PCR擴增。反應體系：2×HieffRobust PCR Master Mix 15μL，Bar-PCRprimer F 1μL，Primer R 1μL，PCRproducts 10～20ng，加水補足至30μL。反應條件：94℃3min，94℃30 s，45℃20 s，65℃30 s，5個循環(huán)；94℃20s，55℃20s，72℃30s，20個循環(huán)；72℃5min。第2輪擴增，引入Illumina橋式PCR兼容引物。反應體系：2×Hieff○R Robust PCR Master Mix 15 ° L，Primer F 1μL，Index-PCRPrimer R 1μL，PCRproducts 20～30 ng，加水補足至30μL。反應條件：95℃3 min，94℃20s，55℃20s，72℃30s，5個循環(huán)；72℃5min。利用Qubit3.0熒光定量儀進行文庫濃度測定，應用Illumina Miseq平臺進行微生物分類測序，測序工作由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 門水平土壤細菌群落差異。高通量測序結(jié)果分析顯示，4處理在門水平上，除去未鑒定類群和其他(將相對豐度＜1%的類群歸為其他)，共獲得11個細菌門(圖1)。變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidetes)為主要優(yōu)勢細菌門。由圖1可知，施商品有機肥對土壤細菌門水平相對豐度產(chǎn)生了影響。變形菌門和放線菌門在對照處理中相對豐度最小，說明增施商品有機肥能夠增加土壤中變形菌門和放線菌門的數(shù)量，且施肥量越多相對豐度越大。酸桿菌門在對照處理中相對豐度最大，說明增施商品有機肥降低了土壤中酸桿菌門的數(shù)量，這與武曉森[2]等人的研究結(jié)果相一致，未施肥處理中放線菌門、變形菌門豐度明顯低于施肥處理，但酸桿菌門在對照處理中比例較高。研究表明，酸桿菌門生長速度較慢，當土壤營養(yǎng)或結(jié)構(gòu)發(fā)生變化時，生長較快的微生物將取代生長較慢的酸桿菌門，從而使酸桿菌門豐度降低[3]。另外，非優(yōu)勢菌門中藍細菌門(Cyanobacteria)相對豐度表現(xiàn)為對照處理中最高，說明增施商品有機肥降低了藍細菌門的相對豐度。研究表明，藍細菌在貧瘠土壤固氮、固碳中發(fā)揮作用[4]，商品有機肥中含有氮磷鉀和有機質(zhì)，施肥后土壤肥力增加，從而使土壤中藍細菌相對豐度降低。

圖1 細菌門水平分布圖

2.2 屬水平土壤細菌群落差異。高通量測序共獲得細菌屬水平類群25個，包括未鑒定類群和其他(相對豐度＜1%)，4個處理中主要優(yōu)勢菌屬種類并無差異，但各優(yōu)勢菌屬相對豐度存在差異(圖3)。主要優(yōu)勢類群有鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、Gp6、Gp4、芽單胞菌 屬(Gemmatimonas)、溶 桿 菌 屬(Lysobacter)、WPS-1_genera_incertae_sedis、Aridibacter、Gp3、Gp16、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、戴沃斯菌屬(Devosia)等11個細菌屬。由圖3可知，溶桿菌屬、Gp16和戴沃斯菌屬在增施商品有機肥后相對豐度增加，其中Gp16的相對豐度隨著商品有機肥的增加而增加，溶桿菌屬在gz2中相對豐度最大，戴沃斯菌屬在gz3中相對豐度最大。而Aridibacter和Gp3在施商品有機肥后相對豐度降低。研究表明，溶桿菌屬可以產(chǎn)生具有抗菌和裂解活性的次級代謝產(chǎn)物，在植物病蟲害防治及增強土壤抵抗力上具有重要作用[5]，戴沃斯菌屬可以與水生豆科類植物Neptunia natans(L.F.)Druce共生形成獨特的固氮結(jié)節(jié)[6]。

圖3 細菌屬水平分布圖

3 結(jié)論與討論

本試驗結(jié)果顯示，4個處理土壤細菌優(yōu)勢門和優(yōu)勢屬相同，只是在相對豐度上存在差異，說明增施商品有機肥盡管增加或降低了一些細菌的相對豐度，但并未引起土壤細菌群落結(jié)構(gòu)的差異。與只施農(nóng)家肥相比，在門水平上，增施商品有機肥能夠明顯增加土壤中變形菌門和放線菌門的相對豐度，降低酸桿菌門和藍細菌門的相對豐度；在屬水平上，增施商品有機肥增加了土壤中溶桿菌屬、Gp16、戴沃斯菌屬、WPS-1_genera_incertae_sedis等細菌屬的相對豐度，降低了Aridibacter和Gp3的相對豐度。但細菌門屬的相對豐度增加或降低與施肥量并未表現(xiàn)出明顯的線性關(guān)系，推測可能由于施肥時間相對較短，而土壤微生物的演變需要一定的時間。

施肥是土壤微生物演變的重要驅(qū)動因子之一。與化肥相比，有機肥的時效性和持久性更好。一方面，有機肥中含有氮磷鉀和有機質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)，能直接增加土壤養(yǎng)分，促進谷子生長；另一方面，有機肥增加了外部碳源的輸入，有助于土壤微生物的生長繁殖，增強了微生物的代謝活動[7]，改善了土壤結(jié)構(gòu)，從而進一步促進谷子根系營養(yǎng)的吸收和地上部分的生長。因此，在實際生產(chǎn)中，科學合理施用有機肥和農(nóng)家肥，有利于調(diào)節(jié)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，改善土壤環(huán)境，促進農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展。