趙文星，吳可欣，郭梓豫，張?jiān)脐唬汽愝x，劉奕伶，莫重輝，趙寶玉，路 浩*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，楊凌 712100； 2.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，西寧 810016)

披針葉黃華(Thermopsislanceolata)，又名“黃花苦豆”“野決明”“牧馬豆”，蒙古語(yǔ) “他日巴干-希日”，為豆科(leguminoseae)野決明屬(Thermopsis)植物[1]。披針葉黃華為多年生草本植物，資源相當(dāng)豐富[2-4]，廣泛分布于我國(guó)東北、華北和西北各省區(qū)[5]。披針葉黃華多生長(zhǎng)于草原沙丘、河岸礫灘、林下灌叢，在河谷、溝渠等地也可零星生長(zhǎng)，偶見(jiàn)農(nóng)田及路旁，一般散生，條件合適時(shí)也能形成小群落[6,7]。該植物憑借其發(fā)達(dá)的根系、超強(qiáng)的抗逆性等特性，分布范圍和分布強(qiáng)度逐步擴(kuò)大[8]，能耐-37 ℃的低溫，在東北、青藏高原等高寒地域亦可良好越冬，同時(shí)也能在退化鹽堿化的土壤中較好生長(zhǎng)[9]。披針葉黃華可做藥用[10]，具有興奮呼吸、祛痰、止咳、止痛、抗炎等功效[11-12]。新鮮狀態(tài)下具有特殊的苦味，牲畜一般不采食，若誤食其種子或全草后則會(huì)發(fā)生慢性中毒，干枯后毒性減弱[13]。林源等[14]研究發(fā)現(xiàn)，引起披針葉黃華中毒的主要成分是喹諾里西啶生物堿(Quinolizidine)類[15]，其中廣泛存在的有黃花堿(Thermopsine)、金雀花堿(Cytisine)[16]等。

植物內(nèi)生真菌(endophytic fungi)是指生活史部分或者全部寄存在植物體內(nèi)的各個(gè)組織或者器官內(nèi)，生存狀況良好，并且沒(méi)有引起任何感染的真菌[17]。這些內(nèi)生真菌具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育，提高植物抗逆性的作用[18]，其次生代謝產(chǎn)物擁有多種結(jié)構(gòu)類型(如生物堿、聚酮、萜類等)[19]，有抗腫瘤、抗氧化性、抗菌等功能[20]，在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、環(huán)境保護(hù)等方面廣泛應(yīng)用[21]。因而，植物內(nèi)生真菌中的活性代謝產(chǎn)物為抗生素、抗癌藥物及農(nóng)藥的研究與開(kāi)發(fā)提供了重要研究方向，同時(shí)也具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[22]。劉建利等[23]從苦豆子植物中分離出多種內(nèi)生真菌，其葉最多，莖次之，根最少，優(yōu)勢(shì)菌屬為鏈格孢屬(Alternariasp.)、枝梗莖點(diǎn)霉屬(Dendrophomasp.)。孫璐等[24]從毛序棘豆中分離的內(nèi)生真菌中莖最高，根次之，葉最少，鏈格孢屬(Alternariasp.)、鐮孢霉屬(Fusariumsp.)為優(yōu)勢(shì)菌屬。但目前有關(guān)披針葉黃華內(nèi)生真菌的種類及種群分布情況尚不清楚。

鑒于此，本試驗(yàn)采用表面消毒法分離披針葉黃華內(nèi)生真菌，運(yùn)用形態(tài)學(xué)和5.8S rDNA-ITS序列分析進(jìn)行內(nèi)生真菌種屬鑒定，探討披針葉黃華內(nèi)生真菌的種類及種群分布特點(diǎn)，可為披針葉黃華內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物的開(kāi)發(fā)與利用提供重要參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 試驗(yàn)所用的披針葉黃華新鮮植物樣本(包含根、莖、葉和種子)，于2020年7月在青海省湟中縣(東經(jīng)101°17′18″，北緯37°16′26″，海拔3216.6 m)采集，干燥處理后，實(shí)驗(yàn)室保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑 2%NaClO、葡萄糖(廣東光華)；無(wú)水乙醇(成都克隆)；瓊脂粉、苯酚(北京索萊寶)；氯仿(西隴科學(xué))；中性樹膠(國(guó)藥集團(tuán))；植物基因組DNA提取試劑盒(北京天根)；真菌通用引物ITS 1和ITS 4(西安熱默爾)；75%乙醇(山東安捷)；巰基乙醇；Hieff Canace?Gold高保真DNA聚合酶；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)：瓊脂(20 g·L-1)，馬鈴薯(200 g·L-1)，葡萄糖(20 g·L-1)和無(wú)菌去離子水等。

1.1.3 主要儀器 恒溫培養(yǎng)箱(中儀國(guó)科)；冷凍離心機(jī)(德國(guó)Sigma)；TG16A臺(tái)式高速離心機(jī)(上海盧湘)；BGP Power 600通用電泳儀(北京天誠(chéng))；超凈臺(tái)(蘇州凈化)；高壓蒸汽滅菌鍋(上海博訊)；PCR基因擴(kuò)增儀(美國(guó)Biorad)；冰箱(TCL)；光學(xué)顯微鏡(廈門麥克奧迪)；水浴鍋(天津泰斯特)。

1.2 方法

1.2.1 植物樣品的表面消毒 首先將洗凈的披針葉黃華植物組織剪成3 cm左右的小段，用無(wú)菌去離子水浸泡2～3 h，在超凈臺(tái)中按照以下步驟進(jìn)行表面消毒處理：75%乙醇消毒30 s，無(wú)菌水漂洗1 min，2%NaClO消毒2 min(NaClO為消毒作用較強(qiáng)的試劑，其消毒時(shí)間需要根據(jù)不同組織性質(zhì)作適度調(diào)整，并通過(guò)試驗(yàn)篩選出最適的消毒時(shí)間)，無(wú)菌水漂洗1 min， 重復(fù)操作4次。

1.2.2 披針葉黃華內(nèi)生真菌的分離與純化 用菌絲尖端切割法[25]對(duì)披針葉黃華植物內(nèi)生真菌進(jìn)行分離純化，并將純化菌株培養(yǎng)、編號(hào)并計(jì)算分離率(isolation rate，IR)，用于判斷披針葉黃華各組織部位(根、莖、葉和種子)內(nèi)生真菌浸染的程度。

1.2.3 披針葉黃華內(nèi)生真菌的形態(tài)學(xué)鑒定 參考孫璐等[24]對(duì)植物內(nèi)生真菌的形態(tài)學(xué)鑒定的方法，對(duì)該植物進(jìn)行鑒定。

1.2.4 披針葉黃華內(nèi)生真菌的基因組DNA提取與5.8S rDNA-ITS序列分析 按照植物基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明，提取分離純化的披針葉黃華菌絲DNA。然后利用PCR擴(kuò)增技術(shù)對(duì)提取到的披針葉黃華內(nèi)生真菌的5.8S rDNA-ITS片段進(jìn)行擴(kuò)增。采用20 μL反應(yīng)體系：真菌通用引物ITS 1和ITS 4各1 μL，DNA模板1 μL， Hieff Canace?Gold高保真DNA聚合酶10 μL，ddH2O 7 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性20 s，55 ℃ 退火20 s，72 ℃延伸1 min，重復(fù)上述操作33次；72 ℃終延伸10 min；最后4 ℃保溫。反應(yīng)結(jié)束后，將純化的產(chǎn)物送至楊凌奧科公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.5 內(nèi)生真菌的系統(tǒng)進(jìn)化分析 將內(nèi)生真菌對(duì)應(yīng)的序列輸入NCBI的DNA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)，挑選出吻合度最高的序列，在MEGA 7.0軟件中構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(所用方法為鄰接法，自展次數(shù)為1 000次)，根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹中組群親緣關(guān)系對(duì)菌株進(jìn)行分類。

2 結(jié) 果

2.1 內(nèi)生真菌分離

以2%NaClO的消毒時(shí)間為時(shí)間梯度，對(duì)披針葉黃華植物組織進(jìn)行表面消毒，得出以下結(jié)果：披針葉黃華不同組織適宜的消毒時(shí)間有所不同，根的消毒時(shí)間主要集中在2和2.25 min；莖的消毒時(shí)間在1.50、1.75和2.00 min；葉的消毒時(shí)間在1.50、1.75和2.00 min； 種子的消毒時(shí)間在2.00和2.25 min。而印記對(duì)照平板中，消毒時(shí)間為1.00和1.25 min的均被污染；消毒時(shí)間為1.75和2.00 min的分離到的內(nèi)生真菌菌落總數(shù)最多。

2.2 披針葉黃華內(nèi)生真菌形態(tài)學(xué)鑒定

將純化菌珠的菌落特征與菌絲特性的觀察結(jié)果與《真菌鑒定手冊(cè)》[26]進(jìn)行比較，初步鑒定試驗(yàn)中從披針葉黃華各組織樣品分離出的內(nèi)生真菌。

青霉屬(Penicilliumsp.)是披針葉黃華的優(yōu)勢(shì)菌屬，其菌落特征為菌落形狀規(guī)則，背面黃色，表面顏色由外向里依次為白色、淡黃色、墨綠色，該菌生長(zhǎng)速度為2.4 mm·d-1。菌絲特征為菌絲淡黃色，頂端尖細(xì)，有隔膜，分支(圖1A1、A2)；彎孢霉屬(Curvulariasp.)是生長(zhǎng)速度最快的菌屬，其菌落特征為菌落灰綠色，邊緣呈白色毛絮狀整齊，背面墨綠色，疏松菌絲氣生生長(zhǎng)，生長(zhǎng)速度為17.5 mm·d-1。菌絲特征為菌絲灰綠色，分支，有隔膜(圖1B1、B2)。

A.青霉屬；B.彎孢霉屬A. Penicillium sp.; B. Curvularia sp.圖1 披針葉黃華典型內(nèi)生真菌菌落及菌絲形態(tài)Fig.1 Typical colonies and mycelium morphology of endophytic fungi in Thermopsis lanceolata

2.3 內(nèi)生真菌種屬鑒定

將分離到的菌株序列在NCBI的DNA數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)，得出的結(jié)果在《真菌鑒定手冊(cè)》中查詢從而確定種屬，具體結(jié)果如表1所示。從披針葉黃華各組織中共分離獲得29種內(nèi)生真菌，分屬于7綱、9目、11科、12屬，其中6種未定屬。

表1 披針葉黃華內(nèi)生真菌鑒定結(jié)果

2.4 內(nèi)生真菌在不同組織分布特點(diǎn)

將鑒定的結(jié)果整理并計(jì)算出不同菌屬在不同組織的相對(duì)分離頻率(表2)。結(jié)果顯示，披針葉黃華內(nèi)生真菌總相對(duì)分離頻率為79.31%，葉的內(nèi)生真菌分離率最高(41.38%)，莖次之(37.93%)，然后為種子(13.79%)，根的最少(6.90%)。不同植物優(yōu)勢(shì)菌屬亦有不同，葉內(nèi)青霉屬(Penicilliumsp.)較常見(jiàn)；莖內(nèi)鏈格孢屬(Alternariasp.)和節(jié)孢霉屬(Arthriniumsp.)較多；種子中曲霉屬(Aspergillussp.)為主；根內(nèi)則僅有鐮孢霉屬(Fusariumsp.)。

2.5 披針葉黃華內(nèi)生真菌的5.8S rDNA-ITS序列分析

使用MEGA7.0軟件，將披針葉黃華內(nèi)生真菌的5.8S rDNA-ITS序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，具體見(jiàn)圖2所示。由圖2可以看出，分離得到的29種菌株(含有 6種未命名菌株)，根據(jù)組群親緣關(guān)系可以將除去裂褶菌屬(Schizophyllumsp.)剩余的菌株，分成種群Ⅰ(自檢支持率76%)和種群Ⅱ(自檢支持率98%)。細(xì)化又可將種群Ⅰ分為種群A(自檢支持率58%)、種群B(自檢支持率100%)，將種群Ⅱ分為種群C(自檢支持率83%)和種群D(自檢支持率98%)。

圖2 基于5.8S rDNA-ITS序列由鄰近法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree constructed with the program Neighbor-joining (NJ) based on 5.8S rDNA-ITS sequences

3 討 論

本試驗(yàn)采用植物表面消毒法和PDA培養(yǎng)基對(duì)披針葉黃華組織樣品進(jìn)行消毒，能夠確保分離到的真菌是內(nèi)生真菌，但同時(shí)也可能對(duì)組織中的真菌造成一定的影響[27]。消毒過(guò)程中，時(shí)間過(guò)短會(huì)因達(dá)不到消毒目的而導(dǎo)致污染，消毒時(shí)間過(guò)長(zhǎng)則影響內(nèi)生真菌分離的種類和數(shù)量，由此可見(jiàn)篩選最佳消毒時(shí)間尤為重要[28]。本試驗(yàn)將2%NaClO的消毒設(shè)定幾個(gè)時(shí)間梯度進(jìn)行篩選，結(jié)果顯示，披針葉黃華根的最佳消毒時(shí)間為2 min，葉的最佳消毒時(shí)間為1.75 min，種子的最佳消毒時(shí)間為2.25 min，莖的最佳消毒時(shí)間為2 min。由此可見(jiàn)，同一植物不同部位的最佳消毒時(shí)間有所不同。

本試驗(yàn)表明，披針葉黃華中葉的內(nèi)生真菌分離率最高，莖次之，種子和根較少。這可能是因?yàn)槿~較薄且相對(duì)表面積較大而最易受到浸染，而種子硬度較高、試驗(yàn)中創(chuàng)造出的新鮮創(chuàng)面不足等因素造成分離率較低。關(guān)于披針葉黃華種子特性，王進(jìn)等[29]研究表明，苦豆子與披針葉黃華種子的健壯度和硬實(shí)率都很高，含水量都很低且差異不顯著；同時(shí)，兩種豆類在寬度、厚度和相對(duì)密度上沒(méi)有顯著差異，故可推測(cè)兩種植物的種子特性可能差異不大。余永濤[30]等從苦豆子中共分離到27株真菌，主要分布于葉、莖部位，花中較少，而種子和根部組織中始終未分離到真菌，這與本試驗(yàn)結(jié)果基本相似。另外，黃恩霞等[31]對(duì)藏沙蒿內(nèi)生真菌分離過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，花內(nèi)分離到的真菌種類最多，其次是根，然后是莖，葉內(nèi)分離率最低；而陳青青等[32]發(fā)現(xiàn)，在白芨各組織內(nèi)生真菌的分離中根的分離率最高，莖次之，葉最低。以上結(jié)果與本試驗(yàn)中披針葉黃華內(nèi)生真菌分離情況有差異，由此說(shuō)明不同植物受內(nèi)生真菌侵染的程度也不同。

本試驗(yàn)共分離出29種菌株，屬于7綱、9目、11科、12屬，其中，6株未定屬。青霉屬(Penicilliumsp.)在莖和葉中均分離出，而曲霉屬(Aspergillussp.)在莖和種子中均分離出，由此可見(jiàn)這兩種菌在披針葉黃華中定植比較廣泛。披針葉黃華優(yōu)勢(shì)菌屬—青霉屬(Penicilliumsp.)屬于腐生類真菌，是自然界中一類重要的分解者，可以產(chǎn)生結(jié)構(gòu)類型豐富的活性次級(jí)代謝產(chǎn)物，這些次級(jí)代謝產(chǎn)物在抗菌、抗氧化、抗腫瘤等藥物開(kāi)發(fā)中發(fā)揮重要作用[33-34]，而莖中發(fā)現(xiàn)的鏈格孢菌屬(Alternariasp.)其發(fā)酵產(chǎn)物具有一定抗氧化和細(xì)胞毒的潛力，表明披針葉黃華內(nèi)生真菌能產(chǎn)多種具有藥理活性的化合物[35-36]。除此之外，在披針葉黃華中分離出的諸如小雙胞腔菌屬(Didymellasp.)、蛇孢腔菌屬(Ophiobolussp.)、彎孢霉屬(Curvulariasp.)、多尾孢菌屬(Podosporasp.)等內(nèi)生真菌的次生代謝產(chǎn)物成分及是否有藥理活性化合物還需進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié) 論

經(jīng)過(guò)對(duì)披針葉黃華各組織內(nèi)生真菌的分離與鑒定，共發(fā)現(xiàn)12屬29種內(nèi)生真菌；在披針葉黃華各組織中，葉中分離到的內(nèi)生菌種類最多，莖次之，之后為種子和根；披針葉黃華植株葉中的優(yōu)勢(shì)菌屬為青霉屬(Penicilliumsp.)，其在葉和莖中均有分布。