李佳鍇，戴鵬秀，陳奕靜，張露文，王璟璐，張翊華

(西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院，楊凌 712100)

糖尿病(diabetes mellitus)是一種以高血糖為特征的代謝性疾病，長期的血糖增高，會引起微血管病變、心血管疾病和腎功能衰竭等一系列并發(fā)癥[1-2]。2019年，全球糖尿病患病率估計為9.3%(4.63億)，到2030年預計上升至10.2%(5.78億)，到2045年預計上升至10.9%(7億)[1,3]。糖尿病分為I型糖尿病和II型糖尿病，I型糖尿病是由于胰島β細胞被破壞而導致胰島素分泌絕對不足，II型糖尿病是由于外周胰島素耐受而導致胰島素分泌相對不足[4-6]。

目前，對大鼠、倉鼠等小型糖尿病動物模型研究較多[7-10]，造模技術(shù)已較為成熟[11-14]，但對犬等大型糖尿病動物模型研究較少[15-18]。小型糖尿病動物模型雖廣泛用于糖尿病藥物或技術(shù)的研發(fā)，但因其體型、壽命等局限性，對糖尿病的臨床治療試驗參考意義有限[19]。為對糖尿病的發(fā)病機制和治療做進一步研究，亟需建立合適的大型動物的糖尿病模型。目前，已有在豬、猴、犬等大型動物中建立糖尿病模型的記錄[19-24]。犬自發(fā)性糖尿病以I型糖尿病為主，患病率約為0.005%～1.5%，尤其老年犬和母犬易發(fā)[25]。絕大多數(shù)犬糖尿病屬于胰島素依賴性糖尿病，類似于人的I型糖尿病，是人的I型糖尿病治療研究的良好動物模型[26]。Black等[15]、Issekutz等[18]和Anderson等[27]曾在上世紀用鏈脲佐菌素或四氧嘧啶素建立犬糖尿病模型，但均未研究不同濃度藥物對犬肝腎毒性的影響，以及探索兩者聯(lián)合注射的最佳建模劑量。因此，本試驗選取犬作為實驗動物，采用鏈脲佐菌素和四氧嘧啶聯(lián)合注射建立I型糖尿病模型，旨在探索建模的最佳注射劑量，為糖尿病藥物或技術(shù)的研發(fā)提供一種合適的動物疾病模型。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與試驗材料

健康的9～12月齡中華田園犬18只，平均體重為(5.09±0.30)kg，均購自西北農(nóng)林科技大學實驗動物中心。鏈脲佐菌素、四氧嘧啶、檸檬酸鈉緩沖液和0.22 μm一次性過濾器均購自索萊寶生物科技公司；血糖儀和血糖試紙購自上海羅氏血糖健康醫(yī)護公司；舒泰購自法國維克公司；鹽酸賽拉嗪注射液購自吉林省華牧公司。

1.2 試驗設計

18只中華田園犬每天9：00和18:00各飼喂一次，自由飲水，飼養(yǎng)7 d后開始試驗。將18只中華田園犬隨機分成6組，每組設3個重復，每個重復1只犬。禁食12 h，按鏈脲佐菌素和四氧嘧啶不同劑量混合分組，其中Ⅰ組(20 mg·kg-1/ 40 mg·kg-1)、 Ⅱ組(30 mg·kg-1/50 mg· kg-1)和Ⅲ組(40 mg·kg-1/60 mg·kg-1)進行單次經(jīng)頭靜脈注射；Ⅳ組(10 mg·kg-1/20 mg·kg-1)、Ⅴ組(15 mg·kg-1/25 mg·kg-1)和Ⅵ組(20 mg·kg-1/30 mg·kg-1)進行兩次靜脈注射，兩次注射間隔為24 h。注射后12 h內(nèi)，每隔2 h檢測1次血糖，在此期間，若血糖低于4 mmol · L-1，可按0.5 g·kg-1劑量靜脈注射20%葡萄糖解救。本試驗在西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院實驗動物飼養(yǎng)管理和使用委員會的批準下執(zhí)行。

1.3 空腹血糖含量測定和靜脈葡萄糖耐量試驗(IVGTT)

給藥后，每天早上8點測定空腹血糖含量，連續(xù)7 d。試驗前和試驗后第7天分別進行靜脈葡萄糖耐量試驗。犬禁食12 h，20%葡萄糖按0.5 g · kg-1的劑量經(jīng)頭靜脈注射。分別在注射后15、30、45、60、75、90、105和120 min測定血糖值。

1.4 血液生理和生化指標的測定

試驗前和試驗后第7天從頭靜脈或隱靜脈采血，進行生理和生化指標的測定。采用海力孚HF-3800動物血常規(guī)分析儀測定白細胞(WBC)、紅細胞(RBC)、血紅蛋白(HGB)、紅細胞壓積(HCT)、血小板(PLT)、中性粒細胞、淋巴細胞和單核細胞；采用PA8000V動物免疫分析儀測定C反應蛋白(CRP)；采用庫貝爾IChem-735全自動生化分析儀測定丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、肌酐(CREA)、尿素(UREA)和淀粉酶(AMY)。

1.5 胰腺組織HE染色

試驗后第7天，舒泰和鹽酸賽拉嗪注射液1∶1比例混合，按0.1 ml·kg-1劑量進行肌肉注射麻醉。沿腹中線切開，找到并充分暴露胰腺，切除胰腺并浸泡于4%多聚甲醛組織固定液中，縫合。胰腺組織經(jīng)脫水透明和石蠟包埋后制成5 μm的切片。用二甲苯和梯度乙醇脫蠟后進行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin staining，HE)染色，中性樹脂封片，顯微鏡觀察并拍照。

1.6 數(shù)據(jù)整理和統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2010進行整理，利用SPSS 22.0進行統(tǒng)計和分析。Graphpad Prism繪制血糖變化曲線圖。用配對樣本t檢驗給藥前后差異，P<0.01表示差異極顯著，P<0.05表示差異顯著，P>0.05表示差異不顯著，結(jié)果均以“平均值±標準差”表示。

2 結(jié) 果

2.1 血糖變化

如圖1所示，Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組按各組藥物劑量注射6 h后，均出現(xiàn)血糖下降。注射24 h后，Ⅰ組血糖處于正常生理水平(3.89～6.11 mmol·L-1)，含量為(5.53±0.85)mmol·L-1，Ⅱ組和Ⅲ組血糖嚴重升高，含量分別為(20.50±3.03)mmol·L-1和(27.37±3.60)mmol·L-1。之后連續(xù)7 d，Ⅰ組空腹血糖始終處于正常水平，Ⅱ組和Ⅲ組空腹血糖持續(xù)高于15 mmol·L-1。

圖1 注射藥物后Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組連續(xù)7 d的血糖變化Fig.1 Changes of blood glucose in group I, II, and III for 7 consecutive days after drug injection

如圖2所示，Ⅳ組、Ⅴ組和Ⅵ組按各組藥物劑量注射兩次后，Ⅳ組空腹血糖始終處于正常生理水平，Ⅴ組和Ⅵ組雖有上升，但在試驗期間均未超過10 mmol·L-1。

圖2 注射藥物后Ⅳ組、Ⅴ組和Ⅵ組連續(xù)7 d血糖變化Fig.2 Changes of blood glucose in group IV, V, and VI after injection for 7 consecutive days

2.2 IVGTT結(jié)果

如圖3所示，試驗前對各組犬的靜脈注射葡萄糖，各組的血糖變化趨勢一致。注射15 min后，各組血糖均升高至峰值，其中Ⅳ組最高，可達(18.87±1.62)mmol·L-1。隨后各組血糖逐漸開始下降，并在注射后75 min恢復至正常生理水平(約5 mmol·L-1)。此結(jié)果說明各組均表現(xiàn)良好的葡萄糖耐受能力。

圖3 試驗前靜脈注射葡萄糖后各組120 min內(nèi)血糖變化Fig.3 Changes of blood glucose in each group within 120 minutes after intravenous glucose injection before the experiment

如圖4所示，試驗后對各組犬的靜脈注射葡萄糖，15 min后，各組血糖均升高至峰值。之后Ⅰ組和Ⅳ組在90 min恢復至注射前水平；Ⅴ組的血糖雖逐漸下降，但120 min仍未達到注射前水平；Ⅱ組、Ⅲ組和Ⅵ組持續(xù)保持高血糖狀態(tài)(18 mmol·L-1以上)，在120 min時仍未見明顯下降。

圖4 試驗后靜脈注射葡萄糖后各組120 min內(nèi)血糖變化Fig.4 Changes of blood glucose in each group within 120 minutes after intravenous glucose injection after the experiment

2.3 血液生理和生化指標檢測

血常規(guī)結(jié)果表明，各組試驗前后各項指標均處于正常生理范圍內(nèi)，C反應蛋白值小于5 mg·L-1，未有炎癥反應(數(shù)據(jù)未顯示)。

由表1可知，與試驗前相比，試驗后Ⅰ組的ALT和ALP顯著升高(P<0.05)；Ⅱ組和Ⅲ組的ALT極顯著升高(P<0.01)，AST和ALP顯著升高(P<0.05)；Ⅵ組的AST和ALP顯著升高(P<0.05)。其中Ⅲ組的ALT、AST和ALP均超過正常生理范圍(ALT：10～100 U·L-1；AST：0～50 U·L-1；ALP：23～212 U·L-1)，此結(jié)果說明，試驗后Ⅲ組的肝功能嚴重受損。其余各組試驗后的ALT、AST或ALP雖出現(xiàn)顯著性變化，但均處于正常生理范圍內(nèi)。

表1 各組藥物對肝功能相關(guān)指標的影響

由表2可知，與試驗前相比，試驗后Ⅱ組、Ⅲ組和Ⅵ組的UREA顯著升高(P<0.05)；Ⅲ組和Ⅴ組的CREA顯著升高(P<0.05)。其中Ⅲ組的UREA和CREA均超過正常生理范圍(UREA：2.5～9.6 mmol·L-1；CREA：44～159 μmol·L-1)，此結(jié)果說明，試驗后Ⅲ組的腎功能受到損傷。其余各組試驗后的UREA和CREA雖出現(xiàn)顯著性變化，但均處于正常生理范圍內(nèi)。

表2 各組藥物對腎功能相關(guān)指標的影響

由表3可知，試驗前后各組的AMY均無顯著性差異(P>0.05)，且處于正常生理范圍(500～1 000 U·L-1)，表明各組胰腺外分泌部均未受到明顯損傷。

表3 各組藥物對胰功能相關(guān)指標的影響

2.4 胰腺組織形態(tài)學變化

如圖5所示，試驗后Ⅰ組胰島邊緣整齊，形態(tài)正常(圖5A)；Ⅱ組胰島萎縮，結(jié)構(gòu)松散，中央出現(xiàn)空泡，部分胰島細胞核濃染、固縮(圖5B)；Ⅲ組胰島結(jié)構(gòu)嚴重受損，其形態(tài)不規(guī)則，邊緣不整齊，胰島內(nèi)部出現(xiàn)大片空泡化(圖5C)；Ⅳ組和Ⅴ組胰島輪廓圓潤，形態(tài)正常(圖5D、E)；Ⅵ組胰島結(jié)構(gòu)松散，但內(nèi)部細胞未被嚴重破壞(圖5F)；各組除胰島外，其它部位沒有明顯的病理學變化。

3 討 論

目前犬糖尿病模型的判定標準不一，空腹血糖、葡萄糖耐量、胰島素水平和C肽水平等都可以作為評價標準。朱愉和多秀瀛[28]認為，若犬連續(xù)2 d空腹血糖值大于11.1 mmol·L-1或IVGTT效果顯著，則成功建立犬糖尿病模型。但僅以2 d的空腹血糖測量值作為建模標準，犬后期存在轉(zhuǎn)歸的可能。

A. Ⅰ組胰島形態(tài)正常；B. Ⅱ組胰島中央出現(xiàn)空泡；C. Ⅲ組胰島空泡化嚴重；D. Ⅳ組胰島形態(tài)正常；E. Ⅴ組胰島形態(tài)正常；F. Ⅵ組胰島結(jié)構(gòu)松散A. Islets in group I are normal; B. Vacuoles appear in the center of the islets in group Ⅱ; C. Iislets with severe vacuolation in group Ⅲ; D. Islets in group IV are normal; E. Islets in group V are normal; F. Loose islet structure in group VI圖5 試驗后各組胰腺組織HE染色Fig.5 HE staining of pancreatic tissue in each group after the experiment

同時，本研究發(fā)現(xiàn)，Ⅵ組犬試驗期間空腹血糖值未超過10 mmol·L-1，但試驗后糖耐量受損，故認為不能僅以IVGTT效果作為建模標準。I型糖尿病動物的胰腺會有明顯的病理變化，最常見的是胰島形態(tài)萎縮，表現(xiàn)為細胞皺縮，呈條束狀，核致密，胞漿少。極少部分病例胰島增生肥大，表現(xiàn)為細胞較大，外形規(guī)則清晰，核較大。急性糖尿病常見胰島細胞空泡變性，特點為細胞漿變空甚至細胞凋亡。本試驗將連續(xù)7 d空腹血糖值大于15 mmol·L-1作為成功建立犬I型糖尿病的標準，同時通過IVGTT檢測犬調(diào)控高血糖能力，并根據(jù)生理和生化指標的測定判定不同劑量藥物對犬的肝、腎、胰毒性，通過胰腺組織切片觀察胰島結(jié)構(gòu)變化，最終確定鏈脲佐菌素和四氧嘧啶聯(lián)合注射建立犬I型糖尿病模型的最佳劑量。

手術(shù)切除胰腺可建立犬糖尿病模型，但存在風險大、技術(shù)要求高和不易操作等缺點[16-17,29-31]。因此，可考慮通過一些損傷胰腺的藥物建立糖尿病模型，研究最多的藥物是鏈脲佐菌素和四氧嘧啶[32]。鏈脲佐菌素和四氧嘧啶均可通過II型葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白(GLUT2)在胰島β細胞積累[33]，鏈脲佐菌素主要通過烷基化對β細胞造成損傷[34-35]，四氧嘧啶則主要通過形成活性氧選擇性損傷β細胞[36-37]。由于不同物種β細胞的GLUT2表達存在差異，鏈脲佐菌素和四氧嘧啶對β細胞的毒性存在種間差異[38-39]。50 mg·kg-1的鏈脲佐菌素即可在大鼠中造成不可逆的糖尿病，但在食蟹猴、豬中需要150 mg·kg-1的劑量[40-41]。鏈脲佐菌素在犬中的建模劑量一般在40～50 mg·kg-1之間，接近或稍微超過半數(shù)致死量，而四氧嘧啶一般為50～75 mg·kg-1。Black等[15]選擇30 mg·kg-1鏈脲佐菌素和50 mg·kg-1四氧嘧啶，Anderson等[27]則使用35 mg·kg-1鏈脲佐菌和40 mg·kg-1四氧嘧啶聯(lián)合注射，均取得了不錯的效果，但都未研究不同劑量藥物的造模效果和對犬肝腎毒性的影響。Anderson 等[27]還發(fā)現(xiàn)，幼犬比成年犬更易造模成功，因此，本試驗選取9～12月齡的犬作為試驗對象。四氧嘧啶價格便宜但肝腎毒性較大，且鏈脲佐菌素和四氧嘧啶對β細胞破壞作用的原理不同，因此，本研究采用聯(lián)合注射鏈脲佐菌素和四氧嘧啶，在降低藥物劑量和減輕肝腎毒性的同時，提高對β細胞特異破壞作用。

本試驗設置3個鏈脲佐菌素和四氧嘧啶(20 mg· kg-1/40 mg·kg-1；30 mg·kg-1/50 mg·kg-1；40 mg·kg-1/60 mg·kg-1)單次聯(lián)合注射梯度。低劑量組空腹血糖未顯著升高，試驗后糖耐量正常，胰腺組織形態(tài)正常(圖5 A)，同時藥物未造成肝腎損傷。中劑量組和高劑量組空腹血糖值均連續(xù)7 d大于15 mmol·L-1，同時糖耐量受損嚴重，胰島受到嚴重破壞(圖5B、C)，但高劑量組對犬肝腎造成嚴重損傷。

大劑量藥物單次注射可迅速破壞β細胞造成永久的胰島損傷，但可能存在嚴重的肝腎毒性。與大劑量單次注射方式比，小劑量多次注射可不斷刺激自身免疫反應，破壞免疫機制，形成更加穩(wěn)定的糖尿病模型。因此，本試驗同時設置3個鏈脲佐菌素和四氧嘧啶(10 mg·kg-1/20 mg·kg-1；15 mg·kg-1/25 mg·kg-1；20 mg·kg-1/30 mg·kg-1)兩次聯(lián)合注射梯度。3組空腹血糖均達到造模標準，藥物也均未造成肝腎損傷，但高劑量組的糖耐量受損，胰島雖未被破壞但結(jié)構(gòu)松散(圖5F)。后續(xù)可繼續(xù)改進小劑量多次注射方案，如加大注射劑量、縮小時間間隔和增加注射次數(shù)等，摸索小劑量多次注射建立犬I型糖尿病模型的可能性。

4 結(jié) 論

30 mg·kg-1鏈脲佐菌素和50 mg·kg-1四氧嘧啶對犬聯(lián)合單次靜脈注射，血糖值連續(xù)7 d大于15 mmol·L-1，糖耐量受損，未造成嚴重的肝腎毒性，可有效建立I型糖尿病模型。