張文華，聞雙全，王 莉，徐明暢，馬勇剛，鄒 輝，顧建紅，劉學(xué)忠，卞建春，劉宗平，袁 燕*

(1. 揚州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，揚州 225009； 2.江蘇高校動物重要疫病與人畜共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚州 225009)

根據(jù)有毒物質(zhì)和疾病登記局(ATDSR)排名，鎘(cadmium，Cd)作為毒性排名第7的重金屬，廣泛存在于自然環(huán)境中，可通過多種途徑進入人體。并因其極長的生物學(xué)半衰期和很低的排泄速率，可在機體多種器官組織內(nèi)長期蓄積，誘發(fā)肝毒性、腎毒性以及神經(jīng)毒性等[1]。越來越多的證據(jù)表明，鎘暴露可能是某些神經(jīng)系統(tǒng)疾病(包括嗅覺障礙、記憶障礙和阿爾茨海默病)的重要誘因之一[2]，雖然鎘所致神經(jīng)毒性的具體機制尚不清楚，但有研究表明，氧化應(yīng)激及炎癥與其密切相關(guān)。作為氧化應(yīng)激敏感的轉(zhuǎn)錄因子之一，核因子 NF-E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid-2 related factor 2，Nrf2)能夠在機體對抗氧化應(yīng)激的過程中發(fā)揮重要作用。在生理條件下，大部分 Nrf2 在細胞質(zhì)中處于非活動狀態(tài)；但當受到氧化應(yīng)激刺激時，Nrf2可發(fā)生核轉(zhuǎn)位(由細胞質(zhì)進入細胞核)并調(diào)節(jié)相關(guān)抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄[3]。炎癥反應(yīng)一般由炎癥因子介導(dǎo)，研究表明，鎘能顯著上調(diào)炎癥調(diào)節(jié)因子和炎癥因子，呈現(xiàn)出明顯的致炎特性[4]，但對于鎘導(dǎo)致炎癥的具體機制尚不清楚。

褪黑素(N-acetyl-5-methoxytryptamine，melatonin)是一種吲哚類激素，除了人體松果體之外，視網(wǎng)膜、小腸和皮膚也能大量合成褪黑素。最近研究表明，褪黑素除了具有調(diào)節(jié)生物節(jié)律功能之外，還具有多種生物學(xué)功能，包括抗氧化、抗炎和抗凋亡等[5]。研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素在鎘誘導(dǎo)的肝損傷[6]、骨損傷[7]、卵巢損傷[8]中都有顯著的保護作用，但目前關(guān)于褪黑素對鎘毒性的影響研究主要集中在哺乳動物上，而對禽類研究報道較少。本試驗以鴨大腦皮質(zhì)為研究對象，從氧化損傷和炎癥角度研究鎘對鴨腦的毒性作用機制及褪黑素的保護效應(yīng)，為進一步提高對鎘毒性作用的認識，以及預(yù)防和治療鎘中毒提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

20日齡高郵鴨16只，由江蘇省蘇郵鴨場提供。

1.2 主要試劑

褪黑素購自上海麥克林生化科技有限公司；丙二醛(MDA)、總抗氧化能力(T-AOC)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；腫瘤壞死因子(TNF-α)、白細胞介素1β(IL-1β)檢測試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；抗Nrf2抗體購自日本MBL公司，抗β-actin、HO-1、Histone H3單克隆抗體購自CST公司；二抗購自美國Jackson公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒、胞漿與核蛋白抽提試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司；氯化鎘(CdCl2)購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.3 動物分組與處理

將16只20日齡高郵鴨隨機分為4組，分別為對照組(Con)、褪黑素組(Mel)、鎘組(Cd)、鎘與褪黑素共處理組(Cd+Mel)，每組4只。各組鴨按以下方式進行處理：對照組鴨自由采食飲水；褪黑素組鴨自由采食，同時每天自由飲用含有0.2 mg·L-1褪黑素的水；鎘組鴨自由飲水，同時每天自由采食拌有2 mg·kg-1氯化鎘的飼料；鎘與褪黑素共處理組鴨每天自由飲用含有0.2 mg·L-1褪黑素的水，同時自由采食拌有2 mg·kg-1氯化鎘的飼料，持續(xù)60 d。試驗結(jié)束后，頸動脈放血處死并摘取鴨大腦皮質(zhì)，部分固定于4%多聚甲醛內(nèi)用于制作石蠟切片，其余部分置于凍存管內(nèi)，標記，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 試驗方法

1.4.1 測定氧化損傷相關(guān)指標 按照南京建成生物工程研究所提供的試劑盒說明書測定鴨大腦皮質(zhì)中MDA和T-AOC的水平。

1.4.2 測定炎癥相關(guān)指標 按照上海酶聯(lián)生物提供的ELISA試劑盒說明書檢測鴨大腦皮質(zhì)中TNF-α、IL-1β的含量。

1.4.3 免疫組化染色 石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟、乙醇復(fù)水后，在檸檬酸鹽緩沖液中煮沸，用抗原修復(fù)緩沖液處理。然后用3% H2O2孵育，去除內(nèi)源過氧化物酶，在室溫下用山羊血清封閉1 h，抗Nrf2抗體(1∶200稀釋)4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育2 h，然后用DAB顯色液處理，正置熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.4.4 Western blot法檢測Nrf2和HO-1蛋白表達量 稱取鴨大腦皮質(zhì)并加入適量的裂解液和蛋白酶抑制劑，然后用電動研磨器在冰上充分研磨制備成勻漿，置于冰上30 min后超聲使其進一步裂解，然后4 ℃，12 000 r·min-1離心10 min，取上清，即為總蛋白。按照碧云天生物技術(shù)有限公司提供的胞漿與核蛋白抽提試劑盒說明書提取核蛋白。BCA法測定蛋白濃度并調(diào)整至相同濃度后加SDS-PAGE Loading Buffer，沸水煮10 min。用10% SDS-PAGE膠100 V恒壓電泳90 min，250 mA恒流90 min轉(zhuǎn)印至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，一抗4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育2 h，ECL發(fā)光顯色。用Image J軟件進行灰度值分析，以Histone H3為內(nèi)參計算核Nrf2相對蛋白表達量，以β-actin為內(nèi)參計算HO-1相對蛋白表達量。

1.5 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用SPSS 26.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行顯著性t檢驗和單因素方差(one-way ANOVA)分析，結(jié)果以“平均值±標準差”表示。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 鎘與褪黑素對鴨大腦皮質(zhì)中MDA含量的影響

結(jié)果如圖1所示，與對照組相比，鎘組鴨大腦皮質(zhì)MDA含量極顯著升高(P<0.01)；與鎘組相比，鎘與褪黑素共處理組鴨大腦皮質(zhì)MDA含量顯著降低(P<0.05)；對照組、褪黑素組、鎘與褪黑素共處理組之間鴨大腦皮質(zhì)MDA含量無顯著差異(P>0.05)。

標有不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，標有不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，標有相同小寫字母表示無顯著差異(P>0.05)，下同Results marked with different uppercase letters indicate extremely significant difference (P<0.01), different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05)， while same lowercase letters indicate no significant difference (P>0.05). The same as below圖1 鎘與褪黑素對鴨大腦皮質(zhì)中MDA含量的影響Fig.1 Effect of cadmium and melatonin on MDA content in cerebral cortex of duck

2.2 鎘與褪黑素對鴨大腦皮質(zhì)中T-AOC水平的影響

結(jié)果如圖2所示，與對照組相比，鎘組鴨大腦皮質(zhì)T-AOC水平極顯著降低(P<0.01)；與鎘組相比，鎘與褪黑素共處理組鴨大腦皮質(zhì)T-AOC水平顯著升高(P<0.05)；對照組、褪黑素組、鎘與褪黑素共處理組之間鴨大腦皮質(zhì)T-AOC水平無顯著差異(P>0.05)。

圖2 鎘與褪黑素對鴨大腦皮質(zhì)中T-AOC水平的影響Fig.2 Effect of cadmium and melatonin on T-AOC level in cerebral cortex of duck

2.3 鎘與褪黑素對鴨大腦皮質(zhì)中TNF-α含量的影響

結(jié)果如圖3所示，與對照組相比，鎘組鴨大腦皮質(zhì)TNF-α含量極顯著升高(P<0.01)；與鎘組相比，鎘與褪黑素共處理組鴨大腦皮質(zhì)TNF-α含量極顯著降低(P<0.01)；對照組、褪黑素組、鎘與褪黑素共處理組之間鴨大腦皮質(zhì)TNF-α含量無顯著差異(P>0.05)。

圖3 鎘與褪黑素對鴨大腦皮質(zhì)中TNF-α含量的影響Fig.3 Effect of cadmium and melatonin on TNF-α content in cerebral cortex of duck

2.4 鎘與褪黑素對鴨大腦皮質(zhì)中IL-1β含量的影響

結(jié)果如圖4所示，與對照組相比，鎘組鴨大腦皮質(zhì)IL-1β含量極顯著升高(P<0.01)；與鎘組相比，鎘與褪黑素共處理組鴨大腦皮質(zhì)IL-1β含量極顯著降低(P<0.01)；對照組、褪黑素組、鎘與褪黑素共處理組之間鴨大腦皮質(zhì)IL-1β含量無顯著差異(P>0.05)。

圖4 鎘與褪黑素對鴨大腦皮質(zhì)中IL-1β含量的影響Fig.4 Effect of cadmium and melatonin on IL-1β content in cerebral cortex of duck

2.5 鎘與褪黑素對鴨大腦皮質(zhì)中Nrf2核轉(zhuǎn)位的影響

結(jié)果如圖5所示，對照組、褪黑素組鴨大腦皮質(zhì)細胞Nrf2無明顯核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象，鎘組鴨大腦皮質(zhì)細胞發(fā)生明顯Nrf2核轉(zhuǎn)位(藍色箭頭)，鎘與褪黑素共處理組鴨Nrf2核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象有所減少。

圖5 鎘與褪黑素對鴨大腦皮質(zhì)中Nrf2核轉(zhuǎn)位的影響(1 000×)Fig.5 Effect of cadmium and melatonin on Nrf2 nuclear translocation in cerebral cortex of duck(1 000×)

2.6 鎘與褪黑素對鴨大腦皮質(zhì)中Nrf2及HO-1蛋白表達量的影響

結(jié)果如圖6所示，與對照組相比，鎘組鴨大腦皮質(zhì)Nrf2及HO-1蛋白表達量均極顯著升高(P<0.01)；與鎘組相比，鎘與褪黑素共處理組鴨大腦皮質(zhì)Nrf2及HO-1蛋白表達量均極顯著降低(P<0.01)；對照組、褪黑素組、鎘與褪黑素共處理組之間鴨大腦皮質(zhì)Nrf2及HO-1蛋白表達量無顯著差異(P>0.05)。

圖6 鎘與褪黑素對鴨大腦皮質(zhì)中Nrf2和HO-1蛋白表達量的影響Fig.6 Effect of cadmium and melatonin on Nrf2 and HO-1 protein expression in cerebral cortex of duck

3 討 論

許多研究已經(jīng)闡明了鎘誘導(dǎo)的組織或細胞毒性的機制。其中，由過量的活性氧(ROS)或活性氮導(dǎo)致的抗氧化系統(tǒng)損傷被認為是鎘導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)損傷最重要的機制。ROS具有高反應(yīng)活性，并在其附近攻擊各種類型的生物分子，包括蛋白質(zhì)、DNA和脂質(zhì)，ROS與脂質(zhì)的特殊反應(yīng)通常稱為“脂質(zhì)過氧化”。MDA是公認的氧化應(yīng)激(即脂質(zhì)過氧化)標志物，測定 MDA的量常常可反映機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，間接地反映出細胞損傷的程度[9]。T-AOC可間接反映機體清除氧自由基的能力，從而判斷機體的綜合抗氧化能力。聞雙全等[10]研究發(fā)現(xiàn)，鎘暴露可使大鼠大腦皮質(zhì)中MDA含量升高，T-AOC水平降低；張萌萌[11]研究發(fā)現(xiàn)，鴨采食添加4 mg·kg-1鎘的日糧120 d，其脾中MDA含量升高，脾發(fā)生明顯病理組織學(xué)變化。本研究發(fā)現(xiàn)，自由采食含2 mg·kg-1CdCl2飼料60 d可使鴨大腦皮質(zhì)中MDA含量升高，T-AOC水平降低，與上述結(jié)果一致，說明鎘可導(dǎo)致鴨大腦皮質(zhì)氧化損傷，降低其抗氧化能力，但本試驗鴨大腦皮質(zhì)HE染色切片并未發(fā)現(xiàn)明顯病理學(xué)損傷(結(jié)果未展示)，可能與所用鎘濃度較低及試驗周期較短有關(guān)。據(jù)報道，Nrf2與氧化應(yīng)激密切相關(guān)，在正常狀態(tài)下，Nrf2 以 Keap1-Nrf2 異二聚體的形式存在于細胞質(zhì)中，同時 Keap1 與泛素化連接酶結(jié)合，對 Nrf2 的泛素化與降解產(chǎn)生促進作用[12]。當 ROS 刺激機體時，Nrf2與 Keap1解離，并迅速進入細胞核發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄激活因子的功能，啟動下游靶基因的轉(zhuǎn)錄表達[13-14]。HO-1 是Nrf2的下游靶基因之一，也是一個限速酶，由于它能降低血紅素中的一氧化碳、鐵元素、膽紅素的衍生物，使得它能夠參與氧化應(yīng)激的保護過程[15]。Tang等[16]用CdCl2給SD大鼠染毒8周后取其腦組織進行試驗，發(fā)現(xiàn)鎘暴露可使腦組織Nrf2由細胞漿向細胞核轉(zhuǎn)移，其蛋白表達量顯著升高；何劉等[17]發(fā)現(xiàn)，用鎘給大鼠灌胃30 d后，其睪丸中Nrf2 mRNA水平顯著升高。本研究發(fā)現(xiàn)，鎘暴露可使鴨大腦皮質(zhì)Nrf2發(fā)生核轉(zhuǎn)位，使核Nrf2蛋白表達量升高并上調(diào)HO-1蛋白表達量，說明鎘暴露可激活Nrf2信號通路，使機體進行應(yīng)激性的抗氧化反應(yīng)。

炎癥是機體對致炎刺激的一種防御反應(yīng)，鎘雖不是感染性因素，但研究表明，其可導(dǎo)致多組織器官炎癥。TNF-α、IL-1β是典型的促炎細胞因子，可誘發(fā)慢性炎癥。Almeer等[18]研究發(fā)現(xiàn)，小鼠腹腔注射CdCl27 d后，大腦皮質(zhì)中TNF-α、IL-1β含量均升高；Li等[19]研究發(fā)現(xiàn)，采食含有CdCl2的日糧可導(dǎo)致雞肝中TNF-α、IL-1β mRNA水平升高。本試驗發(fā)現(xiàn)，鎘暴露可使鴨大腦皮質(zhì)中TNF-α、IL-1β含量升高，說明鎘可誘導(dǎo)鴨大腦皮質(zhì)中炎癥因子的釋放。

褪黑素作為機體的一種內(nèi)源性神經(jīng)激素，除了調(diào)節(jié)人體生物鐘外，其在機體的多個系統(tǒng)中有重要作用。很多研究表明，褪黑素對鎘暴露所致的多器官毒性具有保護作用，Shagirtha等[20]發(fā)現(xiàn)，褪黑素可緩解氧化應(yīng)激從而減輕鎘所致的大鼠神經(jīng)毒性；Eybl等[21]研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素預(yù)處理可緩解鎘暴露所致的大鼠肝氧化損傷；Li等[22]發(fā)現(xiàn)，褪黑素對急性鎘暴露所致的小鼠睪丸氧化應(yīng)激和炎癥具有保護作用。本研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素不僅可顯著抑制鎘暴露所致的大腦皮質(zhì)組織中MDA含量升高、T-AOC水平降低，而且還可抑制Nrf2核轉(zhuǎn)位及因核轉(zhuǎn)位所致的核Nrf2與HO-1蛋白表達量的升高，說明褪黑素可減輕鎘所致的脂質(zhì)過氧化作用，緩解大腦皮質(zhì)氧化損傷；此外，褪黑素還緩解了鎘導(dǎo)致的鴨大腦皮質(zhì)中TNF-α和IL-1β含量升高，說明褪黑素減輕了鎘誘導(dǎo)的鴨大腦皮質(zhì)中炎癥因子的釋放。

4 結(jié) 論

綜上所述，本研究表明鎘暴露可使鴨大腦皮質(zhì)中MDA、TNF-α、IL-1β含量升高，T-AOC水平降低，而且可使Nrf2核轉(zhuǎn)位并上調(diào)核Nrf2與HO-1蛋白表達量，導(dǎo)致大腦皮質(zhì)發(fā)生氧化損傷并誘導(dǎo)炎癥因子的釋放；褪黑素對鎘所致的鴨大腦皮質(zhì)毒性損傷有一定保護作用。