劉連超，王靈靈，張雨晴，李金輝，趙興華，何 欣

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，保定 071001)

氟苯尼考(florfenicol，F(xiàn)F，圖1a)是甲砜霉素的氟化衍生物，是一種酰胺醇類動(dòng)物專用廣譜抗生素，其結(jié)晶粉末無臭味苦，呈白色或類白色[1]。FF抗菌范圍廣泛，對(duì)革蘭陰性菌和陽性菌均有抑制作用，臨床用于治療牛、豬、雞和水產(chǎn)動(dòng)物的各種細(xì)菌感染性疾病[2-3]。但FF水溶性差，常溫下在水中的溶解度僅為1.05～1.35 mg·mL-1，溶出度低，極大地限制了其臨床應(yīng)用[4-6]。固體分散體是以一種或幾種高分子聚合物作為載體，將難溶性藥物分散在其中形成的分散體系[7-8]。通過固體分散技術(shù)，制備無定形給藥系統(tǒng)，可以有效提高難溶性藥物的溶解度以及溶出速率[9]。制備固體分散體最常用的方法是噴霧干燥法(spray drying)和熱熔擠出法(hot-melt extrusion)等。本研究基于溶劑-反溶劑原理，利用共沉淀技術(shù)制備氟苯尼考固體分散體，旨在制備出穩(wěn)定的無定形氟苯尼考固體分散體，有效提高氟苯尼考的溶解度和生物利用度，擴(kuò)大其臨床應(yīng)用。

圖1 FF(a)和HPMCAS(b)的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structural formula of FF (a) and HPMCAS (b)

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與動(dòng)物

氟苯尼考對(duì)照品購自上海源葉生物科技有限公司；氟苯尼考原料藥由保定冀中藥業(yè)有限公司贈(zèng)予；醋酸羥丙基甲基纖維素琥珀酸酯(hydroxypropyl methyl cellulose acetate succinate，HPMCAS-MF，圖1b)由大連業(yè)建貿(mào)易有限公司贈(zèng)予。

SPF級(jí)健康雄性SD大鼠，220～250 g，購自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司[生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2019-0010]，試驗(yàn)前禁食12 h，自由飲水。

1.2 氟苯尼考固體分散體(FF-MF ASD)的制備

將聚合物HPMCAS-MF配成0.1 g·mL-1的溶液，然后將FF和HPMCAS-MF按照5∶5的比例加入10 mL上述聚合物溶液中，充分溶解，混合后注入反溶劑中，充分沉淀后抽濾，沉淀物冷凍干燥48 h，研磨過80目篩備用。

1.3 固體分散體的表征

1.3.1 X射線衍射(XRD) 將FF、HPMCAS-MF和FF-MF ASD(FF∶HPMCAS-MF=5∶5)粉末樣品過篩后進(jìn)行測(cè)試。工作條件：掃描范圍5～35°，電壓40 KV，電流40 mA，步長0.02°，測(cè)試速度0.1 s·step-1，銅靶，入射線波長0.154 18 nm。

1.3.2 差示量熱掃描(DSC)和熱重分析(TGA) 稱取適量粉末樣品放入坩堝，通氮?dú)?，進(jìn)行升溫測(cè)試。工作條件：N2氣流20 mL·min-1，TGA測(cè)試范圍25～500 ℃，DSC測(cè)試范圍0～200 ℃，升溫速率10 ℃·min-1。

1.3.3 掃描電鏡(SEM) 將FF、HPMCAS-MF和FF-MF ASD粉末樣品粘到導(dǎo)電膠上，噴金后測(cè)試，觀察樣品形貌。

1.4 穩(wěn)定性研究

精密稱取200 mg FF-MF ASD于安瓿瓶中，放在(40±5) ℃和相對(duì)濕度(75±3)%的恒溫恒濕箱中，并分別于0、7、14、30、60和90 d對(duì)該樣品進(jìn)行差示量熱掃描和粉末X射線衍射。

1.5 體外溶出速率

精密稱取FF原料藥200 mg、FF-MF ASD(等同于200 mg的FF)過篩后進(jìn)行體外溶出速率的測(cè)定，溶出介質(zhì)為pH 6.8磷酸鹽緩沖液，溶出介質(zhì)體積為20 mL，溫度為(37±0.5)℃，轉(zhuǎn)速為250 r·min-1，分別于 0.5、1、2、5、10、20、30、60、90和120 min 時(shí)取樣200 μL (隨即補(bǔ)足等溫度等量的溶出介質(zhì))，用0.45 μm微孔濾膜過濾，測(cè)定吸光度，重復(fù)3次。

1.6 藥動(dòng)學(xué)

1.6.1 給藥與采樣 選取10只健康SD大鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，試驗(yàn)前12 h，禁食不禁水，隨機(jī)分為2組，每組5只。選擇0.1% CMC-Na水溶液作為懸浮劑，將FF和FF-MF ASD分別加入1 mL懸浮劑，并進(jìn)行渦旋處理均勻分散備用。以20 mg·kg-1灌胃給予FF和FF-MF ASD(等同于20 mg·kg-1的FF)。給藥后，用微量采血管分別于0.083、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、6、8、12和24 h時(shí)進(jìn)行大鼠眼眶采血約0.5 mL，6 000 r·min-1離心10 min，取上層血漿于EP管中，-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.6.2 血漿樣品處理 血漿樣品取100 μL，加入300 μL乙腈后，渦旋振蕩2 min，以12 000 r·min-1離心10 min，上清液用0.22 μm有機(jī)濾頭過濾，取200 μL處理好的樣品用HPLC進(jìn)行FF的含量檢測(cè)。

1.6.3 高效液相色譜條件 色譜柱：SunFire?C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈∶水= 60∶40； 流速：1 mL·min-1；柱溫：37 ℃；進(jìn)樣量：20 μL；測(cè)定波長：224 nm。

2 結(jié) 果

2.1 氟苯尼考的X-射線衍射分析

FF、FF-MF ASD和HPMCAS-MF的XRD結(jié)果如圖2所示。

圖2 FF、FF-MF ASD和HPMCAS-MF的XRD圖Fig.2 XRD analysis of FF, FF-MF ASD and HPMCAS-MF

FF的X射線粉末衍射圖中在衍射角度2θ在(8.0±0.2)、(16.2±0.2)、(23.5±0.2)、(24.4±0.2)、(26.9±0.2)、(38.6±0.2)°處均具有衍射峰，表明FF是一種高結(jié)晶度藥物；HPMCAS-MF無明顯衍射峰； FF-MF ASD未看到晶體衍射峰，表明FF以無定形態(tài)分散在HPMCAS-MF中，即在該比例下，聚合物HPMCAS-MF和藥物FF形成了固體分散體。

2.2 氟苯尼考固體分散體的熱分析

FF、FF-MF ASD和HPMCAS-MF的TGA結(jié)果如圖3 a所示。由圖可知FF、FF-MF ASD和HPMCAS-MF的分解溫度均在220 ℃左右，而本研究所用共沉淀方法全程無需加熱處理，這消除了熱不穩(wěn)定性問題。

FF、FF-MF ASD和HPMCAS-MF的DSC結(jié)果如圖3 b所示。FF在154.96 ℃可見一尖銳吸收峰，此為FF的熔點(diǎn)溫度，這與孟凡亮[10]報(bào)道一致；HPMCAS-MF在升溫過程中沒有吸熱峰出現(xiàn)，說明其為非晶態(tài)，其玻璃化轉(zhuǎn)變溫度(glass transition temperature，Tg)在120 ℃左右；而FF-MF ASD中FF的晶體熔點(diǎn)峰完全消失，說明氟苯尼考與聚合物HPMCAS-MF以分子狀態(tài)均勻混合且相容性良好，藥物以無定形態(tài)存在，這與上述XRD結(jié)果相吻合。

2.3 氟苯尼考固體分散體的掃描電子顯微鏡觀察結(jié)果

FF、FF-MF ASD和HPMCAS-MF的SEM結(jié)果如圖4所示。FF為大小不一的塊狀晶體，表面光滑；HPMCAS-MF呈現(xiàn)不規(guī)則的顆粒狀，形態(tài)飽滿，立體感較強(qiáng)，呈現(xiàn)疏松多孔結(jié)構(gòu)；FF-MF ASD中片狀藥物結(jié)構(gòu)消失，無明顯的晶體存在，呈疏松多孔形式，藥物以無定形態(tài)高度分散于HPMCAS-MF的孔穴中。

2.4 氟苯尼考固體分散體的穩(wěn)定性

FF-MF ASD在恒溫恒濕環(huán)境中放置后不同時(shí)間取樣后的XRD和DSC圖譜如圖5所示。通過XRD(圖5 a)和DSC(圖5 b)圖譜可以看出FF-MF ASD在0、7、14、30、60和90 d內(nèi)均無結(jié)晶峰和吸熱峰出現(xiàn)，表明該ASD在3個(gè)月內(nèi)性質(zhì)穩(wěn)定。

a. TG; b.DSC圖3 FF、FF-MF ASD和HPMCAS-MF的熱分析圖(TG和DSC)Fig.3 Thermal analysis (TG and DSC) of FF, FF-MF ASD and HPMCAS-MF

a. FF, 5 000×; b. HPMCAS-MF, 5 000×; c. FF-MF ASD, 5 000×; d. FF-MF ASD, 20 000×圖4 FF、FF-MF ASD和HPMCAS-MF的SEM圖Fig.4 SEM analysis of FF, FF-MF ASD and HPMCAS-MF

2.5 體外溶出

FF和FF-MF ASD在37 ℃、pH 6.8磷酸鹽緩沖溶液中的溶出結(jié)果如圖6所示。FF和FF-MF ASD在2 h內(nèi)均達(dá)到溶解平衡，F(xiàn)F-MF ASD的飽和溶解度為5.55 mg·mL-1，較FF原藥(1.15 mg·mL-1)提高了4.8倍。20 min內(nèi)FF-MF ASD的溶出速率明顯增加，之后趨于穩(wěn)定。可以看出制備出的氟苯尼考無定形固體分散體顯著增加了氟苯尼考的的溶解度和溶解速度，且該ASD較穩(wěn)定，能保持120 min 內(nèi)溶解度無明顯變化，說明聚合物的存在顯著抑制了氟苯尼考的結(jié)晶過程。

a. XRD; b.DSC圖5 FF-MF ASD的XRD和DSC圖譜Fig.5 XRD and DSC analysis of FF-MF ASD

圖6 FF和FF-MF ASD的體外溶出曲線Fig.6 The in vitro dissolution of FF and FF-MF ASD

2.6 藥物代謝動(dòng)力學(xué)

各給藥組的平均血藥濃度-時(shí)間曲線及參數(shù)如圖7和表1所示。FF在大鼠體內(nèi)吸收迅速，在1.1 h達(dá)到最大血藥濃度，而FF-MF ASD的達(dá)峰時(shí)間極顯著推遲，達(dá)2.8 h(P<0.01)；FF-MF ASD的達(dá)峰濃度極顯著高于FF原料藥(P<0.01)，是FF的1.69倍；FF原料藥最大滯留時(shí)間為15.03 h，F(xiàn)F-MF ASD的MRT極顯著縮短，僅為7.52 h(P<0.01)；FF原料藥和FF-MF ASD的半衰期差異不顯著(P>0.05)；FF原料藥的AUC0～∞為29.84 (μg·h)·mL-1，F(xiàn)F-MF ASD的AUC0～∞顯著提高為40.94 (μg·h)·mL-1(P<0.05)，結(jié)果表明，制備的FF-MF ASD生物利用度比FF提高了37.2%。

圖7 口服FF和FF-MF ASD在大鼠體內(nèi)的血藥濃度-時(shí)間曲線Fig.7 Concentration vs time curve of plasma drug in rats after oral administration of FF and FF-MF ASD

表1 大鼠口服FF和FF-MF ASD主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)比較

3 討 論

HPMCAS-MF是近年來興起的一種可用于固體分散體的理想載體，其Tg為120 ℃，在pH 6.0溶解，有較廣泛的有機(jī)溶劑溶解性和較低的溶液黏度[11-13]。HPMCAS-MF既具有琥珀?；?，又含有多種疏水性取代基，pKa值約為5，因此導(dǎo)致其在pH≤4時(shí)電離率<10%，在pH≥5時(shí)電離率≥50%，并且HPMCAS在腸道pH下被電離，主要以膠體聚合物的形式存在于水溶液中，由于聚合物上取代基的疏水性，使不溶性藥物分子與聚合物相互作用，在溶液中形成非晶藥物/聚合物納米結(jié)構(gòu)[14]，這些藥物/聚合物納米結(jié)構(gòu)構(gòu)成了一種高溶解度的非晶藥物，可以迅速溶解，從而提供過飽和的藥物濃度，達(dá)到增加藥物溶解度、提高生物利用度的目的。HPMCAS-MF不僅可以作為潤濕劑提高藥物的可潤濕性，而且在以其為載體的固體分散體中，由于黏度增大和絡(luò)合作用還能抑制藥物結(jié)晶，從而提高藥物穩(wěn)定性[15-16]。Sarabu等[17]研究了HPMCAS對(duì)硝苯地平藥物無定形固體分散體的影響，結(jié)果表明HPMCAS可以明顯增加藥物的溶解度和溶出速率，溶解度較原料藥提高了2.5倍，且能在40 ℃、75%濕度條件下在3個(gè)月內(nèi)保持性質(zhì)穩(wěn)定，藥物保持無定形態(tài)。Liang等[18]制備了姜黃素和HPMCAS的無定形固體分散體，溶解度提高了約8.4倍，顯著地增強(qiáng)了姜黃素的溶出，提高了姜黃素的化學(xué)穩(wěn)定性，且HPMCAS比聚乙烯吡咯烷酮PVPK30更能抑制姜黃素的降解。FF原料藥本身是一種溶解度較低的藥物，本研究選擇HPMCAS-MF為載體制備FF-MF ASD，結(jié)果顯示制備為固體分散體后使氟苯尼考的溶解度提高了4.8倍，其原因可能是聚合物的存在抑制了FF晶體的凝聚，抑制了FF的結(jié)晶，另外制備的FF-MF ASD呈疏松多孔狀形態(tài)，導(dǎo)致藥物的比表面積較大且與溶出介質(zhì)的接觸面積大大增加。

FF屬于BCSⅡ類藥物[19]，口服后FF在體內(nèi)的低溶解度大大限制了機(jī)體對(duì)藥物的吸收，難以發(fā)揮其臨床療效。目前國內(nèi)外已有大量提高藥物溶解度的固體制劑的研究報(bào)道[20-22]。馬可等[23]將氟苯尼考與β-環(huán)糊精按1∶1投料比制備出氟苯尼考-β-環(huán)糊精包合物，進(jìn)行了體外溶出試驗(yàn)，其15 min溶出率為氟苯尼考的5倍，提高了氟苯尼考的水溶性，但該研究缺乏體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)試驗(yàn)，不能確定此包合物在動(dòng)物體內(nèi)的吸收代謝規(guī)律。婁雅婧[24]利用混懸法，制備出氟苯尼考-檸檬酸共晶，使氟苯尼考的溶解度提高了3.3倍，此方法通過氫鍵作用，不需要破壞共價(jià)鍵就能使氟苯尼考的溶解度提高。將氟苯尼考固體加熱至熔點(diǎn)以上160～200 ℃使其熔化，再降溫冷卻至15～30 ℃，得到固態(tài)無定形氟苯尼考，使溶解度由1.05提高到1.30 mg·mL-1，并提高了其生物利用度[25]。曹航[26]使用改良溶劑反溶劑法制備出氟苯尼考微晶體，此方法以水為反溶劑，丙酮為溶劑，在4 ℃下，用HPMC修飾制備的微晶體較FF溶解度提高了1.5倍。氟苯尼考新固體制劑的開發(fā)雖然使其溶解度得到了一些改善，但仍不理想，研制高效氟苯尼考水溶性固體制劑仍是目前亟需解決的問題。

采用分子包合技術(shù)形成固體分散體可提高氟苯尼考的溶解度，改善氟苯尼考在動(dòng)物體內(nèi)的吸收，提高其生物利用度。固體分散體的常規(guī)制備方法包括熱熔擠出法[27]、溶劑法[28-29]、熔融法[30]等。Xu等[31]利用熱熔擠出技術(shù)制備出氟苯尼考固體分散體，其在酸性條件下制劑的釋放率<10%，磷酸鹽緩沖液條件下的釋放率>80%，并且該制劑的相對(duì)生物利用度可達(dá)117.2%，其優(yōu)點(diǎn)為具有腸溶性和緩釋作用。閆浩松[32]通過熔融法與熱熔擠出法制備出氟苯尼考固體分散體，使其溶解度提高了1.5倍，生物利用度提高11.88%，并且具有高效、速釋、成本低的優(yōu)點(diǎn)。但利用熱熔擠出法制備固體分散體需通過物料輸送、熔融、剪切、混合、熔體輸送和擠出成型等多個(gè)單元的操作，在高溫熔融和強(qiáng)剪切力的作用下，使多組分物料的粒徑不斷減小，從而提高藥物的溶解度。另外由于熱熔擠出法對(duì)藥物的熱穩(wěn)定性和熱塑性等要求較高，因此除具有適宜的物理化學(xué)性質(zhì)和穩(wěn)定性外，載體與藥物必須具有良好的相容性，且載體的玻璃轉(zhuǎn)變溫度應(yīng)低于藥物的熱降解溫度[33]。熔融法制備固體分散體對(duì)溫度和保留時(shí)間的要求較高，溫度越高及保溫時(shí)間越長所制得的顆粒其釋放度相對(duì)越快，因此該方法只適用于熱穩(wěn)定性的藥物和材料[34]。傳統(tǒng)溶劑法需要先把藥物和載體共同溶于有機(jī)溶劑中，再通過蒸去溶劑得到固體，此法需要消耗較多的有機(jī)溶劑，成本較高且污染環(huán)境[35]；本研究采用共沉淀法制備了FF的固體分散體，使藥物以無定形態(tài)均勻分散在聚合物HPMCAS-MF中，試驗(yàn)過程中無需高溫操作和特殊設(shè)備，所需溶劑量很小，是一種成本低、環(huán)境友好的制備方法。Chow等[36]使用共沉淀法制備了姜黃素?zé)o定形固體分散體，并比較了不同溶劑對(duì)其粒徑的影響，此方法制備的固體分散體不僅粒徑小，而且包封率高、穩(wěn)定性良好。

基于HPMCAS的載體特性，其在水、pH 1.2、pH 4.5的介質(zhì)中，溶解度及溶出效果均較差，僅在pH 6.8磷酸鹽緩沖液中的溶解度才具有明顯的提高[37]，而且pH 6.8接近于動(dòng)物腸液的pH[38]，更能反映生理?xiàng)l件下藥物的溶解環(huán)境，本研究選用pH 6.8的磷酸鹽緩沖溶液考察 FF-MF ASD的體外溶出性能，結(jié)果表明該固體分散體增加了藥物的溶解度，而且有利于藥物的溶出。之后探討了大鼠口服氟苯尼考后的藥物代謝動(dòng)力學(xué)特征，而且較好的溶出促使氟苯尼考固體分散體在大鼠的口服生物利用度提高了37.2%。對(duì)于口服抗生素藥物來說，溶出速度的快慢是決定藥物吸收速率的決定性因素，因此推測(cè)可能是由于疏松多孔結(jié)構(gòu)增加了藥物顆粒的比表面積，使ASD在胃腸道的生物黏附作用得到了增強(qiáng)，并且能夠增加細(xì)胞旁路吸收和攝取，使得藥物粒子在胃腸道中的吸收時(shí)間延長，生物利用度得以提高。

4 結(jié) 論

利用共沉淀技術(shù)將FF和HPMCAS-MF制備成了穩(wěn)定性良好的FF-MF ASD，該固體分散體可有效改善FF的溶解度和體外溶出速率，提高了難溶性藥物FF的生物利用度，為擴(kuò)大氟苯尼考的臨床應(yīng)用提供了支持。