張亞楠，李亞菲，陳汝佳，余 波，彭 珊，李 婷，蒲 齡，徐景峨*

(1. 貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，貴陽(yáng) 550005； 2. 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與監(jiān)測(cè)技術(shù)研究所，廣州 510640; 3. 貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴陽(yáng) 550025)

多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida)是革蘭陰性菌，能在世界范圍內(nèi)引起多種動(dòng)物疾病，如禽霍亂、豬萎縮性鼻炎、兔敗血癥和牛肺炎等[1-3]，在某些情況下，還可通過(guò)動(dòng)物咬傷或抓傷引起人類感染[4-5]。目前，由于缺乏有效的多血清型疫苗，抗生素仍是治療巴氏桿菌感染的首選方法[6]，但隨著抗生素的不合理使用，多國(guó)出現(xiàn)了對(duì)包括頭孢噻呋、頭孢噻肟、頭孢曲松等第3代頭孢菌素類抗生素在內(nèi)的多種抗菌藥物耐藥現(xiàn)象，這給抗菌藥物的使用帶來(lái)了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)[7-9]。

毒力因子是細(xì)菌入侵并在宿主體內(nèi)增殖的關(guān)鍵因子，同時(shí)還具有較強(qiáng)的免疫原性[10]。毒力基因的豐度與細(xì)菌的致病性相關(guān)，目前已被證實(shí)與P.multocida致病性密切相關(guān)的毒力基因除莢膜(capsule)和脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)相關(guān)基因外，還包括菌毛和黏附素(fimbriae and adhesins)、毒素(Pasteurellamultocidatoxin)、鐵調(diào)節(jié)蛋白和鐵獲取蛋白(iron regulation and iron acquisition proteins)、唾液酸代謝相關(guān)蛋白(sialic acid metabolism)、透明質(zhì)酸酶(hyaluronidases)及外膜蛋白(outer membrane proteins)的毒力基因[3,11]。其中，莢膜可增強(qiáng)P.multocida的侵襲力和繁殖能力，由莢膜編碼基因簇編碼，該區(qū)域分為3個(gè)功能區(qū)(莢膜多糖輸出區(qū)、莢膜合成區(qū)和莢膜多糖磷脂替換區(qū))，按照結(jié)構(gòu)可分為5種不同的莢膜基因型(A、B、D、E、F)[12]；按照每個(gè)區(qū)域的基因數(shù)目，可分成兩大類：A、D、F型一類，10個(gè)編碼基因緊密相鄰；B和E型為另一類，15個(gè)編碼基因，在莢膜多糖輸出區(qū)分散排列[13]。LPS有黏附、侵入和抗血清的作用，其致病作用跟LPS的完整性相關(guān)[14-15]。LPS由類脂A和核心寡糖組成，根據(jù)核心寡糖外核基因在不同菌株間的差異可分為8個(gè)LPS基因型，即L1～L8[16]。此外，菌毛和黏附素在P.multocida感染致病過(guò)程中扮演著十分關(guān)鍵的作用，能黏附并定植于宿主細(xì)胞或組織，如IV型菌毛亞單位蛋白(由ptfA基因編碼)、黏附相關(guān)蛋白(包括FimA、ComE1、FhaB、Flp1、Flp2、Hsf_1、Hsf_2、TadG、TadF、TadF、RcpB等)、菌毛低分子蛋白(fimbrial low-molecular-weight protein, Flp)(由Flp操縱子基因編碼)等[11]。在P.multocida流行病學(xué)研究中，基于不同毒力基因譜檢測(cè)的毒力基因分型已發(fā)展成為一種有用的基因分型方法，因此對(duì)于鴨源P.multocida毒力基因多樣性的檢測(cè)顯得尤為重要[17]。

P.multocida分離株的感染表現(xiàn)出宿主偏好，如A：L1：ST129、D：L6：ST50、A：L3：ST9分別在禽類、豬、兔的感染中占優(yōu)勢(shì)[3]。應(yīng)用莢膜基因型、LPS基因型和多位點(diǎn)序列分型(multilocus sequence typing, MLST)相結(jié)合的基因分型方法將有助于臨床分離株的鑒定，為研究P.multocida的全球流行性和分子進(jìn)化提供依據(jù)[17]。

本研究從貴州省出現(xiàn)的疑似禽霍亂的56日齡的病(死)花邊鴨組織中分離得到5株P(guān).multocida，對(duì)分離株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，同時(shí)采用細(xì)菌全基因組測(cè)序技術(shù)對(duì)分離得到的P.multocida強(qiáng)毒株P(guān)mCW1進(jìn)行測(cè)序，并對(duì)其耐藥基因及毒力基因進(jìn)行分析，探究分離株的生物學(xué)、毒力及耐藥特征，對(duì)鴨霍亂的臨床用藥及疫苗研發(fā)具有一定指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSA)、胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)等購(gòu)自青島海博生物生物技術(shù)有限公司；新生牛血清購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；無(wú)菌脫纖維綿羊血購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司；DL2000 DNA Marker、Premix Taq (EXTaqversion 2.0 plus dye)等購(gòu)自寶生物(大連)工程有限公司；瓊脂糖，購(gòu)自O(shè)xoid公司。普通梯度PCR儀、核酸電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)，均購(gòu)自Bio-Rad公司；超凈工作臺(tái)，購(gòu)自蘇州凈化設(shè)備有限公司。

1.2 菌株的分離與鑒定

2020年6月，貴州省三穗縣某鴨場(chǎng)56日齡花邊鴨群3 000余羽，3 d內(nèi)發(fā)病死亡1 185羽，疑似感染禽霍亂，從典型的臨床癥狀和剖檢癥狀的病死鴨中，隨機(jī)無(wú)菌采集5只病(死)鴨的腦和肝組織分別進(jìn)行細(xì)菌的分離，觀察菌株在含有5%新生牛血清的TSA平板及鮮血瓊脂平板上的生長(zhǎng)情況并進(jìn)行菌株的純化。采用kmt1基因特異性PCR方法進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，測(cè)序并Blast分析，以確認(rèn)其多殺性。引物序列：kmt1-F(5′-ACCGACAAGCCCACTCACAACA-3′)；kmt1-R(5′-ATCATCCTAACCGCCTGAAAGC-3′)。

根據(jù)Townsend等[12]報(bào)道的莢膜基因型分型方法和Harper等[16]建立的脂多糖基因型分型方法，送生工生物工程(上海)股份有限公司合成PCR引物。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖進(jìn)行凝膠電泳分析。

采用文獻(xiàn)[12-13]報(bào)道的腸桿菌科細(xì)菌基因間重復(fù)序列聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(enterobacterial repetitive intergenic consensus sequence，ERIC)-PCR方法鑒定5株分離株的同源性。

1.3 多位點(diǎn)序列分型法(MLST)

本研究采用多宿主來(lái)源P.multocidaMLST數(shù)據(jù)庫(kù)(Multiple host MLST database)對(duì)5株分離株進(jìn)行MLST分型。根據(jù)P.multocidaMLST官網(wǎng)(http://pubmLst.org/pmultocida_multihost)上推薦的PCR方法分別擴(kuò)增7個(gè)管家基因(adk、aroA、deoD、gdhA、g6pd、mdh、pgi)。PCR產(chǎn)物利用1%瓊脂糖進(jìn)行凝膠電泳分析，條帶大小正確的擴(kuò)增產(chǎn)物送往生工生物工程(上海)股份有限公司利用對(duì)應(yīng)的測(cè)序引物進(jìn)行測(cè)序，并將序列提交至Multiple host MLST database進(jìn)行MLST基因分型。

1.4 動(dòng)物回歸試驗(yàn)

健康未接種禽巴氏桿菌疫苗的15日齡三穗鴨24只，隨機(jī)分成6組，每組4只，公母各半。5組試驗(yàn)組分別肌肉接種P.multocida分離菌懸液,0.2 mL·只-1， 濃度依次為1.1×102、1.1×103、1.1×104、1.1×105、1.1×106cfu·mL-1，對(duì)照組注射等量生理鹽水，逐日觀察動(dòng)物發(fā)病及死亡情況，及時(shí)對(duì)死亡鴨進(jìn)行剖檢、觀察,并進(jìn)行病原菌的分離鑒定，同時(shí)采用ERIC-PCR方法鑒定攻毒前、后分離株的同源性。

1.5 藥物敏感性試驗(yàn)

參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI)標(biāo)準(zhǔn)[18]，采用微量肉湯二倍稀釋法測(cè)定18種抗菌藥物的MIC值，被測(cè)試的抗菌藥物包括阿莫西林、氨芐西林、頭孢噻肟、頭孢曲松、頭孢噻呋、頭孢他啶、黏菌素、鏈霉素、慶大霉素、阿米卡星、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、恩諾沙星、林可霉素、紅霉素、阿奇霉素、氟苯尼考和多西環(huán)素(北京索萊寶科技有限公司，中國(guó))。以大腸埃希菌ATCC?25922和金黃色葡萄球菌ATCC?29213作為質(zhì)控菌。

1.6 全基因組測(cè)序與耐藥性、毒力性分析

用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取PmCW1基因組DNA，提取的基因組DNA樣品由北京諾禾致源基因科技有限公司進(jìn)行全基因組測(cè)序?；蚪M測(cè)序在Nanopore ProMethation和Illumina NovaSeq PE150上進(jìn)行；使用Unicycler軟件[19](https://github.com/rrwick/Unicycler)用于基因組組裝。使用GeneMarkS(Version 4.17)[20](http://topaz.gatech.edu /GeneMark/)軟件對(duì)新測(cè)序的基因組進(jìn)行編碼基因預(yù)測(cè)。使用Comprehensive Antibiotic Research Database(CARD)數(shù)據(jù)庫(kù)(https://card.mcmaster.ca/)提供的Resistance Gene Identifier(RGI)軟件將PmCW1的氨基酸序列與CARD數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)(RGI內(nèi)置blastp，默認(rèn)e value≤1×10-30)，根據(jù)RGI的比對(duì)結(jié)果，統(tǒng)計(jì)注釋到數(shù)據(jù)庫(kù)的抗性基因信息。對(duì)注釋得到的PmCW1耐藥基因與其耐藥表型進(jìn)行比較分析，分析其耐藥表型和耐藥性的關(guān)系。使用Diamond軟件[21]，把目標(biāo)物種的氨基酸序列與Virulence Factors of Pathogenic Bacteria(VFDB)數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.mgc.ac.cn/ VFs/)進(jìn)行比對(duì)，把目標(biāo)物種的基因和其相對(duì)應(yīng)的毒力因子功能注釋信息結(jié)合起來(lái)，得到注釋結(jié)果。使用Easyfig[22](http://mjsull.github.io/ Easyfig/)分析PmCW1毒力相關(guān)的脂多糖核心寡糖外核、莢膜編碼基因簇及Flp操縱子基因簇與HN141014(LUCX00000000)、P1059(CM001581)、Pm70(AE004439)、ATCC1702(LUDD00000000)及HN06(CP003313)之間基因結(jié)構(gòu)與同源性的差異。

2 結(jié) 果

2.1 菌株的分離鑒定

2020年6月，從5只病(死)鴨的腦和肝中均分離出較純的巴氏桿菌，同一個(gè)體不同部位分離出來(lái)的菌株算作1株，共分離得到5株巴氏桿菌。在含5%新生牛血清的TSA平板上生長(zhǎng)良好，在鮮血平板上長(zhǎng)成水滴狀小菌落，不溶血(圖1)。kmt1-PCR擴(kuò)增結(jié)果與預(yù)期相符(圖2)，測(cè)序結(jié)果與NCBI公布的kmt1基因序列比對(duì)，相似性達(dá)99%以上，確定5株均為多殺性巴氏桿菌。從ERIC-PCR的電泳結(jié)果(圖3)可以看出，本次分離得到的5株菌具有相同的擴(kuò)增片段，表明菌株間同源性高，克隆傳播的可能性大。

a.含5%新生牛血清的TSA平板；b.鮮血平板a.TSA plate containing 5% newborn bovine serum; b.Blood plate圖1 鴨源巴氏桿菌在不同培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of Pasteurella from ducks on different media

M. DL2000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～5.PmCW1～5；6～10.陰性對(duì)照M. DL2000 DNA marker; 1-5. PmCW1-5; 6-10. Negative control圖2 kmt1-PCR鑒定結(jié)果Fig.2 Results of kmt1-PCR identification

M.DL5000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～5.PmCW1～5M.DL5000 DNA marker; 1-5.PmCW1-5 respectively圖3 5株巴氏桿菌分離株的ERIC-PCR結(jié)果Fig.3 ERIC-PCR results of five P. multocida isolates

2.2 莢膜基因型：脂多糖基因型和MLST分型

利用PCR方法對(duì)5株菌進(jìn)行血清基因型鑒定，結(jié)果顯示均為A：L1型(圖4)。對(duì)5株菌分別進(jìn)行7個(gè)管家基因的擴(kuò)增和測(cè)序，測(cè)序結(jié)果提交至http://pubmLst.org/pmultocida_multihost，結(jié)果顯示,5株均為ST128型，圖5為MLST所用7個(gè)管家基因PCR陽(yáng)性圖。

2.3 動(dòng)物回歸試驗(yàn)

P.multocidaPmCW1動(dòng)物回歸試驗(yàn)結(jié)果顯示，1.1×104、1.1×105、1.1×106這三個(gè)試驗(yàn)組中鴨12 h內(nèi)全部死亡，24 h內(nèi)5組試驗(yàn)組鴨全部死亡，對(duì)照組正常。死亡鴨剖檢觀察到全身性出血(圖6)，分離鑒定結(jié)果顯示在5%新生牛血清的TSA平板均有較純的菌落生長(zhǎng)，經(jīng)菌落PCR鑒定均為P.multocida。同時(shí)，ERIC-PCR鑒定結(jié)果顯示與攻毒所用的PmCW1具有相同的擴(kuò)增片段，可以判定為同一株P(guān).multocida(圖7)。

M．DL2000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～5.PmCW1-5；6～7(圖a)/6(圖b).陰性對(duì)照M．DL2000 DNA marker; 1-5.PmCW1-5 respectively; 6-7(Fig.a)/6(Fig.b).Negative control圖4 莢膜基因型(a)和脂多糖基因型(b)PCR結(jié)果Fig.4 PCR for Capsules genotype (a) and lipopolysaccharide genotype(b)

M.DL2000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～7.deoD、gdhA、g6pd、adk、pgi、mdh、aroA基因陽(yáng)性結(jié)果M.DL2000 DNA marker；1-7 are positive results of deoD，gdhA，g6pd，adk，pgi，mdh，aroA gene，respectively圖5 MLST所用7個(gè)管家基因PCR陽(yáng)性圖Fig.5 Positive PCR results of seven housekeeping genes used in MLST

2.4 藥物敏感性試驗(yàn)

由表1可見，在對(duì)5株菌進(jìn)行18種抗菌藥物敏感性檢測(cè)中，阿莫西林的MIC值最高，均>128 mg·L-1； 其次為鏈霉素，MIC值為32～8 mg·L-1； 后面依次為林可霉素(MIC值均為8 mg·L-1)、 阿米卡星(MIC值為8～2 mg·L-1)、氨芐西林(MIC值為4～2 mg·L-1)；對(duì)黏菌素的MIC值差異較大，MIC最大值為4 mg·L-1(PmCW1)，而最小的則為<0.06 mg·L-1(PmCW5)，存在至少64倍的差異；對(duì)慶大霉素的MIC值，除PmCW1為2 mg·L-1，其余均為1 mg·L-1；5株菌對(duì)其余11種 抗菌藥物的MIC值均≤0.5 mg·L-1。

表1 抗菌藥物對(duì)5株鴨源多殺性巴氏桿菌的MIC值

受試藥物的耐藥折點(diǎn)值判斷標(biāo)準(zhǔn)主要參考CLSI VET01-S中描述的值，CLSI VET01-S未給出的則參考?xì)W盟委員會(huì)藥物敏感性測(cè)驗(yàn)(EUCAST)標(biāo)準(zhǔn)[23]。5株菌均對(duì)氨芐西林、阿莫西林、左氧氟沙星和林可霉素4種藥物耐藥，其中PmCW1還對(duì)環(huán)丙沙星低水平耐藥。

2.5 PmCW1抗性基因的分析

通過(guò)對(duì)PmCW1基因組測(cè)序數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，該菌存在多個(gè)耐藥基因，包括2個(gè)β-內(nèi)酰胺類耐藥基因(青霉素結(jié)合蛋白pbp2和pbp1a)，5個(gè)四環(huán)素耐藥基因(tetA、tetB、tetT、tet34、tet35)，1個(gè)磷霉素耐藥基因(murA)，1個(gè)磺胺類耐藥基因(sul3)，1個(gè)維吉尼亞霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶vatB，1個(gè)甲氧芐啶耐藥基因(dfrA3)，1個(gè)廣譜抗菌劑三氯生耐藥基因fabI，3個(gè)多黏菌素抗性決定區(qū)基因(PmrE、PmrC和basS)。同時(shí)檢測(cè)到9個(gè)抗生素耐藥基因簇/操縱子(CpxR、vanRE、vanRN、vanTrL、vanHA、vanHB、vanL、mecC、arlR)和18個(gè)與外排泵復(fù)合體相關(guān)的基因(mdtk、bcr-1、cmeC、cpxA、CRP、farB、hmrM、H-NS、macA、macB、MexI、MexV、msbA、msrB、opmE、patA、sav1866、TaeA)，它們介導(dǎo)對(duì)多種抗生素耐藥。此外，還預(yù)測(cè)出4個(gè)喹諾酮耐藥決定區(qū)基因(gyrA、gyrB、parC、parE)和1個(gè)與氟喹諾酮耐藥相關(guān)基因mfd，經(jīng)比對(duì)發(fā)現(xiàn)gyrA的80位出現(xiàn)突變(Ser80Gly)、parC的84位出現(xiàn)突變(Leu84Ser)。

a.心、肺出血；b.肝出血、壞死；c.腸道彌漫性出血a. Heart and lung bleeding; b. Liver hemorrhage and necrosis; c. Diffuse intestinal bleeding圖6 攻毒致死鴨的剖檢圖Fig.6 Necropsy diagram of ducks killed by challenge poison

M.DL5000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.PmCW1；2～4.攻毒后分離株M.DL5000 DNA marker; 1. PmCW1; 2-4.Isolates after challenge圖7 攻毒前后分離株的ERIC-PCR結(jié)果Fig.7 ERIC-PCR results of isolates before and after challenge

2.6 PmCW1毒力基因的分析

經(jīng)與VFDB數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，預(yù)測(cè)PmCW1中存在的毒力基因總數(shù)為201；根據(jù)毒力基因所屬類別名稱(即VF_name)進(jìn)行歸類，毒力因子有71種；某類毒力基因的占比=(毒力基因所屬類別名稱即VF_name)÷(預(yù)測(cè)出來(lái)的毒力基因總數(shù)即201)×100%(圖8)；如數(shù)量為1的即占比<1%，圖8中未將具體名稱列出。PmCW1中存在的主要是與脂寡糖/脂多糖(LOS/LPS)(galE、galU、gmhA、htrB、kdkA、kdsA、kdsB、kdtA、kpsF、lex2B、lgtF、licA、licC、lpxA、lpxB、lpxC、lpxD、lpxH、lpxK、lsgA、lsgD、lsgE、lsgF、msbA、msbB、neuA、rfaC、orfM、rfaD、rfaE、rfaF、rffG、waq、wecA、yhxB/manB等)、莢膜(capsule)(phyBA、hyaEDCB、hexDCBA、bexA、bexC、bexD等)、黏附因子(fimbriae and adhesins)(flp1-flp2-tadV-rcpCAB-tadZABCDEFG、ptfA、comEA、hofBC等)等相關(guān)基因，此外，還有鐵攝取相關(guān)蛋白基因(ccmABCEF、hgbBC、fur、hscB等)以及部分外膜蛋白基因(ompP5等)，絕大多數(shù)在不同宿主來(lái)源的P.multocida中間高度保守。PmCW1中有些基因存在多個(gè)拷貝數(shù)，如脂寡糖/脂多糖相關(guān)基因rfaC存在2個(gè)拷貝、血紅素生物合成相關(guān)基因hemN存在2個(gè)拷貝等。

占比<1%的毒力因子名稱未列出The names of virulence factors with a percentage <1% are not listed圖8 PmCW1毒力決定因子Fig.8 PmCW1 virulence determining factor

2.7 P. multocida基因組局部區(qū)域比較分析

脂多糖變異區(qū)(即外部核心多糖編碼基因簇)比較基因組學(xué)分析顯示(圖9a)，PmCW1(A：L1，ST128)與HN141014(A：L1，ST129)相比，它們之間基因結(jié)構(gòu)一致；而與P1059(A：L3，ST8)、Pm70(F：L3，ST9)、ATCC1702(A：L2，ST156)相比，它們之間的變異區(qū)主要集中在hptE與priA基因之間，這一區(qū)間內(nèi)的基因主要為糖基轉(zhuǎn)移酶編碼基因。

莢膜多糖磷脂替換區(qū)phyBA和莢膜多糖輸出區(qū)hexDCBA，在不同血清型之間高度保守，而合成區(qū)基因簇存在差異，A型由hyaEDCB基因編碼，D型由dcbEFCB基因編碼，F(xiàn)型由fcbEDCB基因編碼。PmCW1(A：L1，ST128)與HN141014(A：L1，ST129)、ATCC1702(A：L2，ST156)相比，各基因結(jié)構(gòu)一致；與Pm70(F：L3，ST9)相比，除hyaD與fcbD的相似性為82.7%，其余各基因相似性均高于98.1%；與HN06(D：L6，ST50)相比，hyaED與dcbEF之間相似性在61.1%～50.4%，且HN06在phyBA和hyaED之間存在一個(gè)IS605/IS200家族轉(zhuǎn)座酶基因(圖9b)。

Flp操縱子由14個(gè)基因(flp1-flp2-tadV-rcpCAB-tadZABCDEFG)組成，承擔(dān)細(xì)菌的黏附功能。在本研究中分析5株巴氏桿菌Flp操縱子相似情況如圖9c所示，除Pm70(F：L3，ST9)缺失flp2基因，其余4株的Flp操縱子均是經(jīng)典的14基因編碼組成。PmCW1(A：L1，ST128)的Flp操縱子與HN141014(A：L1，ST129)的各基因結(jié)構(gòu)一致；與Pm70(F：L3，ST9)除了flp1基因外各基因相似性均高于82.0%；而與P1059(A：L3，ST8)、ATCC1702(A：L2，ST156)雖然基因結(jié)構(gòu)一致，但基因相似性較低。

圖9 多殺性巴氏桿菌脂多糖核心寡糖外核(a)、莢膜合成區(qū)(b)及 Flp 操縱子(c)比較基因組學(xué)分析Fig.9 Comparative genomic analysis of LPS outer core biosynthesis gene clusters(a),capsular loci (b), and Flp-operons(c) among different P. multocida

3 討 論

莢膜和LPS對(duì)P.multocida的毒力和宿主特異性起著重要作用。本研究從貴州規(guī)模化鴨場(chǎng)分離得到5株鴨源P.multocida強(qiáng)毒株，經(jīng)鑒定血清型(莢膜基因型：脂多糖基因型)為A：L1型，這與王林柏等[24]、Li等[25]報(bào)道的國(guó)內(nèi)部分地區(qū)禽源P.multocida血清型主要為A：L1型的結(jié)果一致，也與Peng等[3]報(bào)道全球不同地區(qū)的流行情況相同，說(shuō)明在全球范圍內(nèi)流行的禽源P.multocida仍以A：L1型為主。需要注意的是，Ujvári等[26]、Ewers等[27]報(bào)道A：L1在貓和人分離株中最常見，Turni等[28]、Ujvári等[29]也報(bào)道過(guò)人類和各種動(dòng)物物種之間存在P.multocida的共享基因型，同時(shí)還有報(bào)道[26]稱人類不是P.multocida的自然宿主，但是人類可能通過(guò)與家庭寵物或養(yǎng)殖場(chǎng)動(dòng)物接觸而感染，造成不同血清型的P.multocida跨物種水平傳播到人類。

已有的流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)表明，導(dǎo)致某些特定疾病的P.multocida集中于某一特定的ST型，例如有報(bào)道與出血性敗血癥相關(guān)的P.multocida多為ST122，而與禽霍亂相關(guān)P.multocida多為ST129[30-31]。這些結(jié)果意味著P.multocida的ST型與疾病之間也可能存在一定的相關(guān)性。目前無(wú)論是我國(guó)還是全球范圍內(nèi)禽源P.multocida的多位點(diǎn)序列分型以ST129型為主，偶見ST122、ST107、ST6、ST44、ST8、ST58等[1,24,32-33]。本研究分離得到的鴨源P.multocida均為ST128型，這在禽源P.multocida中鮮有報(bào)道，提示在貴州地區(qū)鴨源P.multocida出現(xiàn)了不同于全國(guó)流行的ST型。

本研究中P.multocida分離株僅對(duì)氨芐西林、阿莫西林、左氧氟沙星、林可霉素和環(huán)丙沙星5種藥物耐藥，不同于陳國(guó)權(quán)等[34]、Holschbach等[7]報(bào)道的P.multocida分離株耐藥性嚴(yán)重，說(shuō)明P.multocida的耐藥性受地理位置、用藥史、管理水平及環(huán)境等多方面因素影響。對(duì)食品動(dòng)物上禁用抗生素(如頭孢曲松、頭孢噻肟、頭孢他啶、阿奇霉素等)的MIC值較低，說(shuō)明此規(guī)模化鴨場(chǎng)對(duì)抗菌藥物的使用相對(duì)合理。同時(shí)結(jié)合采樣調(diào)研，說(shuō)明此鴨場(chǎng)未亂用這些抗生素。本研究中的分離株ST型相同，但藥敏試驗(yàn)結(jié)果存在差異，如不同菌株對(duì)黏菌素的MIC值存在至少64倍的差異，這可能與在動(dòng)物體內(nèi)不同抗生素壓力下的選擇作用有關(guān)。

PmCW1的耐藥表型與耐藥基因檢測(cè)結(jié)果基本相符，如PmCW1中僅存在2個(gè)β-內(nèi)酰胺類耐藥基因(青霉素結(jié)合蛋白pbp2和pbp1a)，這與PmCW1對(duì)青霉素類藥物氨芐西林和半合成青霉素類藥物阿莫西林均耐藥，而對(duì)其他4種三代頭孢菌素類藥物MIC值均<0.06 mg·L-1的結(jié)果相一致。喹諾酮耐藥決定區(qū)(QRDR)靶位基因突變通常定位于gyrA(第67-106位)或parC(第63-102位)的氨基末端結(jié)構(gòu)域，gyrB和parE的突變也會(huì)導(dǎo)致喹諾酮類藥物耐藥，但突變頻率相對(duì)少[35]。本研究中發(fā)現(xiàn)PmCW1的QRDR存在突變，gyrA的80位出現(xiàn)突變(Ser80Gly)和parC的84位出現(xiàn)突變(Leu84Ser)，Kong等[36]也報(bào)道過(guò)P.multocida中parC的84位突變，這可能是PmCW1對(duì)喹諾酮類藥物耐藥的原因之一。此外，還預(yù)測(cè)到1個(gè)與氟喹諾酮耐藥相關(guān)基因mfd，在空腸彎曲桿菌中mfd的過(guò)度表達(dá)提高了環(huán)丙沙星耐藥性的自發(fā)突變率，mfd對(duì)氟喹諾酮類藥物耐藥性的產(chǎn)生中起重要作用[37]，但mfd在P.multocida中對(duì)氟喹諾酮類藥物耐藥性的作用還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

在流行病學(xué)研究中，毒力基因分型已發(fā)展成為一種有用的基因分型方法，所用基因一部分為P.multocida的廣泛特征基因，它們?cè)诓煌蛐秃?或不同寄主種類的菌株中具有較高的檢出率，如ptfA、fimA、hsf-2、exbB、exbD、tonB、fur、sodA、sodC、ompA、ompH、oma87和plpB等；另一部分毒力基因只在有限數(shù)量的分離株中檢測(cè)到，這主要與特定類型的疾病和/或某些寄主物種有關(guān)，例如toxA只在與進(jìn)行性萎縮性鼻炎相關(guān)的菌株中發(fā)現(xiàn)，而tbpA只在牛和羊源的分離株中發(fā)現(xiàn)[17]。本研究中預(yù)測(cè)到參與編碼PmCW1的毒力基因有201個(gè)，除莢膜、LPS和Flp相關(guān)基因外，還有IV型菌毛基因(ptfA、comE、hofB、hofC、vfr)、鐵攝取相關(guān)蛋白(ccmABCEF、hgbBC、fur、hscB等)以及部分外膜蛋白(ompP5等)等重要毒力基因。IV型菌毛基因ptfA已經(jīng)在莢膜A型、B型和D型菌株中被發(fā)現(xiàn)[38]，ptfA和comE編碼的假定蛋白與菌毛幫助P.multocida黏附到宿主細(xì)胞上面，這與在其他細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的黏附素結(jié)構(gòu)相似[39]；ccmABCDEF操縱子，編碼參與血紅素翻譯后附著的蛋白質(zhì)，在大腸桿菌中也有發(fā)現(xiàn)[40]；fur編碼鐵攝取調(diào)節(jié)因子Fur，與在胸膜肺炎放線桿菌中發(fā)現(xiàn)的相似[41]；這些毒力基因的存在、缺失或豐度可能受到寄主、地理位置或環(huán)境因素的影響，對(duì)P.multocida毒力的增強(qiáng)、減弱具有一定的作用。

通過(guò)局部比較基因組學(xué)分析顯示，強(qiáng)毒株P(guān)mCW1在脂多糖變異區(qū)和莢膜合成區(qū)的基因簇與A：L1型P.multocida各基因結(jié)構(gòu)一致，說(shuō)明PmCW1具有典型的A：L1型P.multocida的特征。脂多糖變異區(qū)(即外部核心多糖編碼基因簇)常位于兩個(gè)保守基因fpg和priA之間[42]，而在本研究中，L1型與其他兩種LSP型(L2、L3型)菌株間差異區(qū)縮小，主要集中在hptE和priA之間，這種差異可能是引起P.multocida菌體脂多糖血清型不同的原因[43]。值得注意的是rpmE基因在不同菌株間相似性高于90%，且在hptE和priA之間隨機(jī)排列。對(duì)莢膜合成區(qū)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)A型與D型的各基因結(jié)構(gòu)及相似性差異大，而A型與F型的差異非常小，這可能與P.multocida分離株感染的宿主偏好性有關(guān)，如A型和F型常引起禽類的感染，D型在豬的感染中占優(yōu)勢(shì)[3]。Flp操縱子通常由14個(gè)基因編碼，但也存在部分基因缺失的情況[44]，如禽源弱毒株P(guān)m70(F：L3，ST9)的Flp操縱子缺失flp2基因；PmCW1具有經(jīng)典的14基因編碼，與其余4株A型P.multocida之間基因結(jié)構(gòu)相同，但相似性存在差異。本研究系統(tǒng)分析了鴨源A：L1，ST128型P.multocida強(qiáng)毒株P(guān)mCW1的耐藥性及毒力特征，為貴州地區(qū)鴨霍亂的臨床用藥及疫苗研發(fā)提供理論依據(jù)。

4 結(jié) 論

通過(guò)對(duì)臨床疑似鴨霍亂的病原菌進(jìn)行系統(tǒng)研究，發(fā)現(xiàn)在鴨源P.multocida鮮有報(bào)道的ST128型PmCW1，且為強(qiáng)毒株。PmCW1攜帶多種耐藥基因(pbp2、pbp1a、tetA、tetB、tetT、tet34、tet35、sul3以及dfrA3)介導(dǎo)對(duì)青霉素類、四環(huán)素類、磺胺類以及甲氧芐啶等藥物耐藥；此外，還存在耐藥基因簇/操縱子和外排泵復(fù)合體相關(guān)的基因，可介導(dǎo)P.multocida對(duì)多種抗生素耐藥。PmCW1具有典型的A：L1型P.multocida的特征，毒力基因主要是脂寡糖/脂多糖(LOS/LPS)、莢膜、黏附因子等相關(guān)編碼基因；此外，還檢測(cè)到還有IV型菌毛基因(ptfA、comE、hofB、hofC、vfr)、鐵攝取相關(guān)蛋白(ccmABCEF、hgbBC、fur、hscB等)以及部分外膜蛋白(ompP5等)等重要毒力基因。