孔令琳，王來娣，白 皓，江 勇，王志秀，王 維，陳國宏，戴網(wǎng)成，常國斌*

(1.揚州大學動物科學與技術學院，揚州 225009； 2. 教育部農(nóng)業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品安全國際合作聯(lián)合實驗室，揚州 225009；3. 宿遷益客種禽有限公司宿豫分公司，宿遷 223800； 4. 天成畜禽生態(tài)養(yǎng)殖場，鎮(zhèn)江 212000)

黃羽肉雞作為中國的優(yōu)良地方雞種，肉質(zhì)鮮香細嫩，風味獨特，深受廣大消費者喜愛，市場占有率逐年提高，與白羽肉雞產(chǎn)量相當[1]。黃羽肉雞品種繁多，雪山雞是由常州立華畜禽有限公司利用中國優(yōu)質(zhì)地方良種藏雞、茶花雞為主要素材培育出的優(yōu)質(zhì)黃羽肉雞新品種[2-4]。長期以來，高效、低成本的飼養(yǎng)管理系統(tǒng)一直是肉雞行業(yè)的養(yǎng)殖目標。生產(chǎn)中常采用公母混飼的自由養(yǎng)殖模式，但包括雪山雞在內(nèi)的黃羽肉雞生長速度受性別影響較大，因此，公母分開飼養(yǎng)是未來提高生產(chǎn)效率的必經(jīng)之路。受消費習慣的影響，公母雞均在市場上占有一席之地，而研究者對公雞研究較多，母雞的研究相對缺乏。腸道微生物對宿主的營養(yǎng)吸收和免疫功能具有重要意義[5-6]。另外，就養(yǎng)殖方式而言，籠養(yǎng)模式能夠節(jié)約土地資源，實現(xiàn)集約化生產(chǎn)，因此，籠養(yǎng)也將是我國未來肉雞養(yǎng)殖的主要模式。籠養(yǎng)系統(tǒng)衛(wèi)生條件較好，雞群遠離糞便，空間利用率高，但福利問題也不容忽視[7]，飼養(yǎng)密度是肉雞飼養(yǎng)管理的一個重要因素[7-8]，低密度飼養(yǎng)制度降低了有限資源的有效利用；飼養(yǎng)密度過高，容易引起家禽應激反應進而影響動物福利以及食品健康[9]。因此，合理的飼養(yǎng)密度對黃羽肉雞高效生產(chǎn)具有重要意義。

本試驗以雪山雞母雞為素材，研究3種飼養(yǎng)密度對雞屠宰性能、行為評價和腸道微生物的影響，以期為雪山雞等相似品種的高效養(yǎng)殖提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

試驗采用單因素設計，選取6周齡健康、體重相近((753.25±20.48) g)的雌性雪山雞180只，飼養(yǎng)于鎮(zhèn)江天成農(nóng)業(yè)科技有限公司，雞籠規(guī)格：390 mm×370 mm×350 mm。分高、中、低飼養(yǎng)密度3組進行籠養(yǎng)，高密度組飼養(yǎng)密度為4只·籠-1(約28只·m-2)，中密度組飼養(yǎng)密度為3只·籠-1(約21只·m-2)，低密度組飼養(yǎng)密度為2只·籠-1(約14只·m-2)，每組20個重復。試驗過程中每周稱重，飼養(yǎng)至上市日齡15周進行羽毛和步態(tài)評分，并進行屠宰測定與肉品質(zhì)測定。試驗雞所喂飼料購自江蘇省立華牧業(yè)有限公司，自由采食和飲水。舍內(nèi)每天23 h光照，1 h黑暗，免疫和消毒程序按常規(guī)程序進行。

1.2 檢測指標與方法

1.2.1 體重、死亡率 在試驗雞飼養(yǎng)期間，每周稱重，計算試驗雞各周齡平均體重。每天記錄各試驗組死亡數(shù)，計算死亡率。死亡率=死亡雞數(shù)/試驗雞總數(shù)×100%。

1.2.2 屠宰性能測定 試驗雞飼養(yǎng)至上市日齡時屠宰，每個重復隨機選取1只，每組共20只，屠宰后進行指標測定，參照《家禽生產(chǎn)性能名詞術語和度量統(tǒng)計方法》(NY/T823-2004)測定屠體重、全凈膛重、胸肌重、腿肌重及腹脂重。

屠宰率、全凈膛率、胸肌率、腿肌率及腹脂率計算方法：

屠宰率=屠體重/活體重×100%；全凈膛率=全凈膛重/宰前體重×100%；胸肌率=兩側(cè)胸肌重/全凈膛重×100%；腿肌率=兩側(cè)腿肌重/全凈膛重×100%；腹脂率=腹脂重/活體重×100%。

1.2.3 羽毛、步態(tài)評分 試驗雞屠宰前對所有雞只羽毛質(zhì)量以及行走能力進行評分。評分標準見表1，由Jones等[10]的羽毛評分標準與Mahmoud等[11]的步態(tài)評分標準改編而來。

表1 雪山雞羽毛及步態(tài)評分標準

1.2.4 腸道微生物多樣性檢測 不同飼養(yǎng)密度組分別于上市日齡隨機選取5只進行屠宰，采集盲腸內(nèi)容物，液氮速凍后立即轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱，腸道內(nèi)容物的菌群測定由北京諾禾致源科技股份有限公司完成。

使用QIAamp DNA Stool Mini Kit(QIAGEN)進行腸道內(nèi)容物DNA提取， NanoDrop 2000分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳法測定DNA的濃度和質(zhì)量。特異性引物擴增16S rRNA的V3-V4區(qū)，并利用Illumina HiSeq 2500平臺上進行測序，得到250 bp雙端序列。對測序得到的原始數(shù)據(jù)(raw data)進行拼接并過濾，得到樣本有效數(shù)據(jù)(clean data)?；谟行?shù)據(jù)進行OTUs(operational taxonomic units)聚類和物種分類分析。根據(jù)各樣本OTUs聚類結(jié)果，對每個樣本的OTU序列做物種注釋，根據(jù)得到的OTUs進行豐度聚類、韋恩圖、多樣性計算等分析，以得到各組物種豐富度與樣品均勻度信息、不同分組間的共有OTUs與特有OTUs信息等；通過主成分分析(PCA)等降維分析和樣本聚類樹展示，探究不同樣本或組別間群落結(jié)構(gòu)的差異；選用LEfSe等統(tǒng)計分析方法對分組樣本的物種組成和群落結(jié)構(gòu)進行差異顯著性檢驗[12-14]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有試驗數(shù)據(jù)使用Excel 2013軟件進行整理，再使用SPSS 17.0 軟件進行分析。百分率利用反正弦函數(shù)進行轉(zhuǎn)換后，各組間差異顯著性采用One-way ANOVA檢驗，數(shù)據(jù)用“平均值±標準差(Mean±S.E.)”表示。

2 結(jié) 果

2.1 不同飼養(yǎng)密度下雪山雞生長性能、屠宰性能分析

為研究高、中、低3種籠養(yǎng)密度對雪山雞生長的影響，測定了試驗雞每周齡體重的變化，結(jié)果見表2。15周齡時籠養(yǎng)模式下低密度組雪山雞體重達到1 920.83 g， 中密度組體重次之，高密度組體重最小，其中，低密度組與中密度組體重差異不顯著(P>0.05)， 高密度組雞體重在11周后顯著低于其他兩組(P<0.05)。

表2 不同飼養(yǎng)密度下雪山雞7～15周齡體重

不同飼養(yǎng)密度下雪山雞屠宰性能見表3。試驗雞腹脂重和腹脂率3組間差異顯著(P<0.05)，低密度組高于中密度組，中密度組高于高密度組，其余屠宰性能指標3組間差異均不顯著(P>0.05)。

表3 不同飼養(yǎng)密度下雪山雞屠宰性能

2.2 不同飼養(yǎng)密度下雪山雞羽毛與步態(tài)評分分析

試驗雞屠宰前，對不同飼養(yǎng)密度下雪山雞羽毛質(zhì)量與行走能力進行評估，羽毛與步態(tài)評分結(jié)果見圖1。試驗雪山雞羽毛質(zhì)量在3種不同飼養(yǎng)密度下，高密度組羽毛評分得0分的概率顯著低于低、中密度組(P<0.05)，得1分的概率低密度組低于中密度組但差異不顯著(P>0.05)，而高密度組羽毛評分得2分的概率顯著高于低、中密度組(P<0.05)，其余的得分率組間差異不顯著(P>0.05)。3種飼養(yǎng)密度下雪山雞步態(tài)評分得分差異不顯著(P>0.05)。總體來說，后期籠養(yǎng)模式下，飼養(yǎng)密度對雪山雞行走能力影響不大，飼養(yǎng)密度越低雪山雞羽毛質(zhì)量越好。

不同字母表示差異顯著(P<0.05)，無字母或相同字母表示差異不顯著(P>0.05)The different letters indicate significant difference (P<0.05), no letter or the same letter indicate no significant difference (P>0.05)圖1 不同飼養(yǎng)密度下雪山雞羽毛、步態(tài)得分率Fig.1 The percentage of feather and gait score under different cage densities

2.3 不同飼養(yǎng)密度下雪山雞腸道微生物區(qū)系分析

2.3.1 腸道微生物區(qū)系組成分析 3種密度下采集共15個個體的盲腸內(nèi)容物，測序后平均每個樣本獲得85 547個序列。根據(jù)97%的相似性閾值，將拼接、優(yōu)化的序列劃分成1 501個OTUs。根據(jù)物種注釋結(jié)果，所有樣本共測得23個門，41個綱，71個目，121個科，237個屬。在門(phylum)和屬(genera)水平上，選取不同飼養(yǎng)密度下雪山雞盲腸內(nèi)容物豐度排名前5的物種分析相對豐度，結(jié)果見表4， Bacteroidetes(擬桿菌門)，F(xiàn)irmicutes(厚壁菌門)、Proteobacteria(變形菌門)是試驗雞盲腸微生物的優(yōu)勢菌門，菌群比例達到所有菌群的93%以上，屬水平主要以Bacteroides(擬桿菌屬)、Lactobacillus(乳桿菌屬)、Faecalibacterium(糞桿菌屬)、Alistipes(另枝菌屬)菌屬為主，總體差異不顯著。在屬水平上，選擇表達豐度前20的菌群繪制熱圖，結(jié)果見圖2，相對于中、高密度組，低密度組的盲腸中Blautia、Suboligranulum及Lactobacillus菌屬下調(diào)，而Parabacteioides、Phascolarctobacteriun菌屬上調(diào)；相較于低、高密度組，中密度組Alistipes、Romaboutsia等菌屬上調(diào)，而Parabaceroides、Desulfovibrio等菌屬下調(diào)；與低、中密度組相比，高密度組Blautia、Allopreotella等菌屬上調(diào)，而Bcteroides、Akkermansia菌屬下調(diào)。不同飼養(yǎng)密度模式下盲腸微生物菌群豐度存在一定的差異。

表4 門和屬水平盲腸微生物相對豐度(n=5)

2.3.2 盲腸微生物區(qū)系多樣性分析 對3種密度下盲腸微生物共有和特有OTUs的數(shù)量進行分析，結(jié)果見圖3A，韋恩圖顯示，3種密度下，共有OTUs達到827個，相對而言，中密度飼養(yǎng)模式下的特有OTUs較少，為123個。Rank曲線趨于平緩(圖3B)，說明測序數(shù)據(jù)量漸進合理，滿足測序要求，物種的豐富度較高，物種分布均勻。此外，Alpha多樣性可以反映微生物群落的豐度和多樣性。微生物的置換多變量方差分析(Adonis)、相似性分析(ANOSIM)和多反應置換程序(MRPP)P值能表明不同飼養(yǎng)密度下盲腸微生物是否具有統(tǒng)計學差異。結(jié)果顯示，高、中、低籠養(yǎng)密度下雪山雞盲腸微生物群落結(jié)構(gòu)上無顯著差異，相較于高密度組雪山雞盲腸微生物區(qū)系而言，中、低密度組更趨于相近(表5)。Beta多樣性分析是對不同組間樣品的微生物群落構(gòu)成進行比較分析，結(jié)果顯示，在主成分分析(PCA)圖中，PC1占總變異的40.94%，PC2占總變異的15.95%(圖3C)。相對而言，中、低密度飼養(yǎng)模式的雪山雞盲腸微生物更為相似，而與高密度飼養(yǎng)模式的盲腸微生物群落相距較遠。使用LEfSe軟件作LEfSe(LDA Effect Size)分析，默認設置LDA Score的篩選值為3，繪制LDA值分布柱狀圖[15]，結(jié)果見圖3D。在高、中、低3種籠養(yǎng)密度模式下，菌群豐度存在顯著差異的菌種數(shù)量分別為4、5、3種，它們可作為對應密度飼養(yǎng)模式的潛在生物標志物。

表5 基于組間微生物群落差異Adonis、MRPP和ANOSIM P值

HCe. 高密度組盲腸；MCe. 中密度組盲腸；LCe. 低密度組盲腸。下同。紅色表示豐度高，而藍色表示豐度低HCe.High density cecum; MCe. Middle density cecum; LCe. Low density cecum. The same as below. Red indicates high abundance, while blue indicates low abundance圖2 不同分組樣本菌群相對豐度熱圖Fig.2 Heat map of relative abundance of microflora from different groups

3 討 論

3.1 不同飼養(yǎng)密度對雪山雞生長性能及屠宰性能的影響

隨著我國畜牧養(yǎng)殖業(yè)集約化機械化水平越來越高，采用籠養(yǎng)以提高養(yǎng)雞經(jīng)濟效益已成為一種必然趨勢[16]。而我國飼養(yǎng)優(yōu)質(zhì)黃羽肉雞的方式大多仍是農(nóng)家戶外放牧，公母混飼，規(guī)模小，效益較低。近幾年，黃羽肉雞籠養(yǎng)的相關研究逐漸增多[17-19]，籠養(yǎng)模式下生長性能優(yōu)于散養(yǎng)模式，而散養(yǎng)模式對黃羽肉雞的胴體產(chǎn)量、肉質(zhì)、血清生化指標均有一定的促進作用[20-22]。本試驗結(jié)果表明，雪山雞的飼養(yǎng)密度與體重呈反比，隨著飼養(yǎng)密度的增加，試驗雪山雞的體重逐漸降低，高飼養(yǎng)密度組雪山雞體重第11～15周均顯著低于中、低飼養(yǎng)密度組，而中、低飼養(yǎng)密度組間體重差異不顯著。這與之前的研究結(jié)果趨勢一致[23-24]。家禽屠宰性能是衡量其產(chǎn)肉性能、屠體表現(xiàn)與屠宰加工效益的重要指標之一[25]。本試驗籠養(yǎng)雪山雞在3種飼養(yǎng)密度下屠宰率均達到90%，全凈膛率均大于62%，證明雪山雞整體屠宰性能優(yōu)良，產(chǎn)肉性能良好。其中，高密度組雪山雞僅腹脂重、腹脂率顯著低于低、中密度組，其他屠宰指標差異均不顯著。這可能是由于低、中飼養(yǎng)密度肉雞活動空間與行為不受限[26]，采食量多導致腹脂的沉積效率較高。

A. 不同飼養(yǎng)密度雞只腸道微生物菌群韋恩圖；B. 樣品豐度曲線；C. 主成分分析圖；D. 不同飼養(yǎng)密度下雪山雞盲腸菌群LDA分布柱狀圖A. Venn diagram of intestinal microflora of chickens with different cage densities; B. Sample abundance curve; C. Principal component analysis diagram; D. Histogram of LDA distribution of cecum flora of Xueshan chickens at different cage densities圖3 盲腸內(nèi)容物微生物菌群的多樣性Fig.3 Diversity of microflora in cecum

3.2 不同飼養(yǎng)密度對雪山雞羽毛質(zhì)量與行走能力的影響

考慮到黃羽肉雞相對白羽肉雞運動需求較大，本試驗未采用師維洲和Зелятров[27]綜合各國研究建議的籠養(yǎng)肉雞飼養(yǎng)密度(30～40只·m-2)，綜合考慮肉品質(zhì)和風味等因素采用高(約28只·m-2)、中(約21只·m-2)、 低(約14只·m-2) 3種飼養(yǎng)密度組進行黃羽肉雞后期籠養(yǎng)試驗。有研究表明，高飼養(yǎng)密度會對肉雞和蛋雞的羽毛質(zhì)量造成較大損傷[28-29]，而當活動空間變大時，羽毛質(zhì)量會重新得到一定改善[29]。本研究結(jié)果顯示，高飼養(yǎng)密度下雪山雞羽毛臟污程度高于中低密度組，且飼養(yǎng)密度越高，雪山雞的羽毛狀態(tài)越不好。此外有研究顯示過高的飼養(yǎng)密度會對肉雞的腿部健康以及行走能力造成破壞[30]，影響肉雞健康發(fā)育與動物福利[31]。本研究中，3種飼養(yǎng)密度條件下雪山雞行走能力幾乎沒有受到影響，這可能是由于試驗所設飼養(yǎng)密度未達到會使白羽肉雞出現(xiàn)胴體擦傷率、骨質(zhì)疏松癥發(fā)病率提高以及死亡率提高等的程度[23, 32-33]。

3.3 不同飼養(yǎng)密度對雪山雞腸道微生物的影響

雞的胃腸道內(nèi)存在大量的微生物群落，這些微生物群對雞的生長發(fā)育和健康起著重要的作用，能夠促進營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，改善雞的免疫系統(tǒng)[34]。因此，測定不同飼養(yǎng)密度對雪山雞腸道微生物區(qū)系的影響對于肉雞飼養(yǎng)評估具有重要意義。本研究發(fā)現(xiàn)，雪山雞雌雞盲腸內(nèi)容物中Firmicutes(厚壁菌門)、Proteobacteria(變形菌門)、Bacteroidetes(擬桿菌門)是優(yōu)勢菌門，菌群比例達到所有菌群的93%以上，這與Lee等[35]的研究結(jié)果一致。Beta多樣性結(jié)果顯示，3種飼養(yǎng)密度盲腸菌群的種類和豐度間差異不顯著，關于籠養(yǎng)條件下不同飼養(yǎng)密度對肉雞腸道菌群的影響研究較少，僅Guardia 等[36]對平養(yǎng)條件下不同飼養(yǎng)密度的羅斯雞腸道微生物測定發(fā)現(xiàn)，菌群豐度受飼養(yǎng)密度的影響，但影響程度有限，且飼養(yǎng)密度增加導致的菌群變化可能與肉雞生長性能下降有關。動物數(shù)據(jù)和人類研究表明，肥胖人群的總體Firmicutes(厚壁菌門)與 Bacterioidetes(擬桿菌門)比例比瘦人要高[37-38]。但本試驗中，兩者比例差異不大。此外，結(jié)果還表明，中密度飼養(yǎng)模式下肉雞盲腸內(nèi)容物中特有OTUs較少，豐度排名前20的菌屬在各組間有一定的差異，且中、低密度盲腸微生物群落趨于相近，與高密度盲腸微生物存在一定的差異。Blautia屬于Lachnospiraceae細菌科，能產(chǎn)生丁酸和乙酸[39]，通過調(diào)節(jié)G蛋白偶聯(lián)受體(GPR)來抑制肥胖[40]，Blautia豐度與VFA呈顯著負相關[41]。Blautia在高飼養(yǎng)密度下豐度上調(diào)，這可能與體重下降、腹脂重及腹脂率降低相關。

4 結(jié) 論

綜合看來，本試驗采用中密度(約21只·m-2)籠養(yǎng)模式能夠使雪山雞母雞獲得較好生產(chǎn)性能和較適宜的腹脂指數(shù)，且對羽毛質(zhì)量和行走能力影響較小，對于腸道微生物的影響不大。本研究結(jié)果可為雪山雞等黃羽肉雞品種的養(yǎng)殖提供一定的參考。