吳 瑕，勞夢(mèng)琴，譚祥梅，陳鵬飛，于家榮，朱鈞銳，張玉嬌，虞凌雪，高 飛，姜一峰，童光志，周艷君

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

豬繁殖與呼吸綜合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是引起母豬繁殖障礙和仔豬呼吸道癥狀及死亡的高度接觸性傳染病，其病原豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）是一種易于發(fā)生變異和重組的單股正鏈RNA病毒，該疾病可造成持續(xù)性感染和免疫抑制，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)危害極為嚴(yán)重[1]。上世紀(jì)80年代PRRS在美國(guó)首次被報(bào)道，當(dāng)時(shí)因病原體未知被稱為“豬神秘病”[2]，我國(guó)于1996年首次分離到PRRSV并命名為CH-1a[3]，2006年此后流行的PRRSV基因組發(fā)生變異，在Nsp2基因處出現(xiàn)30個(gè)氨基酸不連續(xù)缺失，稱之為高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus，HP-PRRSV），該毒株可感染各個(gè)年齡階段的豬只，發(fā)病率可達(dá)50%～100%，死亡率達(dá)20%～100%，感染豬群主要表現(xiàn)出高熱、高發(fā)病率和高死亡率的典型特征，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成極大經(jīng)濟(jì)損失[4-5]。2014年，我國(guó)報(bào)道了基因組出現(xiàn)明顯變異和易重組的NADC30樣PRRSV[6-8]。近年來(lái)，PRRSV重組毒株的增加和重組頻率的提高，使得PRRSV在我國(guó)的流行情況變得更為復(fù)雜，表明PRRSV基因重組在病毒進(jìn)化中發(fā)揮了重要作用[9]，而PRRSV的不斷變異和重組也給目前PRRS的控制帶來(lái)了不利影響，由此可見(jiàn)，及時(shí)監(jiān)測(cè)PRRSV的變異情況是疫情有效防控的重要保障。本研究對(duì)2017-2020年采集自上海市、浙江省、江蘇省等不同發(fā)病豬場(chǎng)的血清和組織樣品進(jìn)行PRRSV檢測(cè)，并對(duì)流行毒株的Nsp2和ORF5等基因進(jìn)行遺傳進(jìn)化和序列比較分析，分析PRRSV在我國(guó)部分地區(qū)的流行趨勢(shì)和變異情況，為指導(dǎo)臨床上對(duì)PRRS疫情的防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料樣品來(lái)源 發(fā)病豬臨床樣品566份，為2017-2020年采集自上海市、浙江省、江蘇省、江西省、河北省、湖北省、新疆維吾爾自治區(qū)等7個(gè)省區(qū)內(nèi)出現(xiàn)流產(chǎn)、咳喘、發(fā)熱和死亡的養(yǎng)豬場(chǎng)中發(fā)病豬的血液和肺臟、淋巴結(jié)、脾臟等組織臟器。

1.2 主要試劑 E.Z.N.A Toatal RNA Kit和Gel Extraction kit購(gòu)自O(shè)mega公司；反轉(zhuǎn)錄酶、2× LATaqPremix、DL2000 DNA marker、DL5000 DNA marker、瓊脂糖、pMD18-T載體購(gòu)自TaKaRa公司；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit購(gòu)自ThermoFisher公司。

1.3 樣品處理與RNA提取 取組織樣品約0.5 g于2 mL離心管中剪碎，加入1 mL的無(wú)菌PBS后用組織高通量研磨儀將其充分碾磨，組織研磨液經(jīng)4℃，10 000 ×g離心10 min，取上清液保存于-80℃?zhèn)溆谩Ｈ∵m量上清液用于RNA提取，所有樣品RNA的提取均根據(jù)E.Z.N.A Toatal RNA Kit的說(shuō)明書(shū)操作。將獲得的RNA按照RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit的說(shuō)明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

1.4 引物設(shè)計(jì)及RT-PCR擴(kuò)增 根據(jù)CH-1a（GenBank登錄號(hào)：AY032626）、HuN4（GenBank登錄號(hào)：EF635006）以及NADC30（GenBank登錄號(hào)：JN654459）基因組中Nsp2基因序列，設(shè)計(jì)檢測(cè)引物（表1），其中用Nsp2引物擴(kuò)增片段大小可以區(qū)分經(jīng)典類毒株（1021 bp）、HP-PRRSV類毒株（931 bp）和NADC30類毒株（628 bp）。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系（20 μL）為：2× LATaqPremix 10 μL，上、下游引物各1 μL（10 pmol/L），cDNA樣品1 μL，ddH2O 7 μL。PCR反應(yīng)條件為：98℃預(yù)變性30 s；98℃變性10 s，57℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72℃終延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳分析，同時(shí)，選擇PCR呈陽(yáng)性的樣品進(jìn)行DNA膠回收，將目的片段克隆至pMD18-T載體后進(jìn)行基因測(cè)序。

表1 PRRSV檢測(cè)及基因擴(kuò)增引物Table 1 Detection and gene amplification primers of PRRSV

1.5 基因序列分析 應(yīng)用DNAStar軟件的Clustal W方法對(duì)測(cè)序得到的PRRSV基因序列與參考毒株（表2）進(jìn)行核苷酸和氨基酸序列比對(duì)分析。應(yīng)用MEGA7.0對(duì)Nsp2和ORF5基因進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)分析。

表2 本研究使用的參考毒株信息Table 2 Reference strain information used in this study

2 結(jié)果

2.1 PRRSV的檢測(cè)結(jié)果 以采集樣品cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。結(jié)果顯示：所檢樣品中PRRSV陽(yáng)性樣品共有246份，部分樣品Nsp2基因擴(kuò)增產(chǎn)物與NADC30樣毒株大小一致（圖1），但各地豬場(chǎng)陽(yáng)性率差異較大，最低為3.92%，最高達(dá)71.60%（表3）。

圖1 PRRSV ORF7和Nsp2基因PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.1 Identification of PRRSV ORF7 and Nsp2 gene by PCR

表3 PRRSV樣品統(tǒng)計(jì)Table 3 The sample statistics of PRRSV

2.2 Nsp2基因進(jìn)化樹(shù)分析 從陽(yáng)性樣品中選擇31份樣品進(jìn)行Nsp2基因克隆和測(cè)序，與GenBank的代表性參考株序列進(jìn)行比較分析，并繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果顯示，Nsp2基因進(jìn)化樹(shù)將國(guó)內(nèi)的美洲型PRRSV基因分成4個(gè)譜系：NADC30-like（譜系1）、QYYZ-like（譜系3）、VR-2332-like（譜系5）和HuN4-like/CH-1a-like（譜系8）；本研究獲得的31株P(guān)RRSV Nsp2基因主要分布在3個(gè)譜系中，即Lineage 8（屬于HP-PRRSV類毒株）、Lineage 5（屬于VR2332類毒株）、Lineage 1（屬于NADC30類毒株），由此表明本研究采集樣品的發(fā)病豬場(chǎng)中主要是以HP-PRRSV類毒株流行為主，NADC30類毒株感染并存（圖2）。31株Nsp2基因測(cè)序結(jié)果顯示，各毒株基因長(zhǎng)度為1924～2232 bp。與美洲型的代表性參考株VR2332、CH-1a、BJ-4、HuN4、JXA1和NADC30等進(jìn)行同源性分析。結(jié)果顯示：31株Nsp2基因之間的核苷酸同源性為57.2%～100%，氨基酸同源性為49.6%～100.0%；與VR2332、CH-1a、BJ-4經(jīng)典株的核苷酸同源性為57.9%～97.9%，氨基酸同源性為49.1%～96.4%；與HuN4、JXA1等HPPRRSV株的核苷酸同源性為58.8%～99.7%，氨基酸同源性為51.4%～99.2%；與NADC30株的核苷酸同源性為58.8%～92.4%，氨基酸同源性為53.2%～88.1%。以上結(jié)果表明，PRRSV在自然流行過(guò)程中發(fā)生了不同程度的變異。

圖2 PRRSV陽(yáng)性樣品Nsp2基因的進(jìn)化樹(shù)分析Fig.2 Phylogenetic tree analysis of Nsp2 gene in PRRSV positive samples

2.3 Nsp2氨基酸序列分析 在PRRSV編碼的各種蛋白中，Nsp2基因變異最大，常被作為病毒進(jìn)化和流行病學(xué)分析的靶基因，本研究獲得的31個(gè)分離株的Nsp2基因編碼氨基酸長(zhǎng)度為635～771 aa。其中位于譜系8的23個(gè)分離株在481 aa和533～561 aa位置具有不連續(xù)缺失30個(gè)氨基酸（1+29 aa），與HP-PRRSV類毒株一致。值得注意的是，其中ZJ11/2017在769～782 aa位置又缺失了14個(gè)氨基酸（1+29+14 aa）。位于譜系5的2個(gè)分離株與VR2332類似，沒(méi)有氨基酸發(fā)生缺失和插入。位于譜系1的6個(gè)分離株在320～431 aa、481 aa和533～552 aa位置均有不連續(xù)缺失131氨基酸（111+1+19 aa），保持與NADC30類毒株一致的特征，但其中HBap4/2018與VR2332相比在464～468位又缺失了5個(gè)氨基酸（111+5+1+19 aa）（圖3）。

圖3 PRRSV Nsp2氨基酸序列比對(duì)Fig.3 PRRSV Nsp2 amino acid sequence alignment

2.4 ORF5遺傳進(jìn)化及同源性分析 為了分析PRRSV ORF5基因與其他參考毒株的親緣關(guān)系，應(yīng)用MEGA7.0軟件繪制了ORF5基因系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)（圖4）。結(jié)果顯示：本研究獲得的21株ORF5基因序列被分布于3個(gè)譜系，其中15株屬于譜系8（HPPRRSV類毒株），5株屬于譜系1（NADC30類毒株），1株屬于譜系3（QYYZ類毒株）。對(duì)獲得的21株ORF5基因與參考株進(jìn)行核苷酸和氨基酸同源性分析。結(jié)果顯示：21株ORF5基因之間的核苷酸同源性為82.6%～99.5%；與VR2332、CH-1a經(jīng)典株的核苷酸同源性為84.4%～100%，氨基酸同源性為83.1%～100%；與JXA1、HuN4等HP-PRRSV株的核苷酸同源性為84.6%～99.5%，氨基酸同源性為83.7 %～99.5%；與NADC30、FJM4等NADC30類的核苷酸同源性為83.7%～94.0%，氨基酸同源性為84.1%～95.0%。

圖4 PRRSV陽(yáng)性樣品ORF5基因的進(jìn)化樹(shù)分析Fig.4 Phylogenetic tree analysis of ORF5 gene in PRRSV positive samples

2.5 GP5氨基酸序列比對(duì) 對(duì)21株ORF5基因進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果顯示：ORF5基因?yàn)?03 bp，編碼200個(gè)氨基酸，沒(méi)有氨基酸的插入和缺失。氨基酸比對(duì)結(jié)果顯示：突變主要位于信號(hào)肽和兩個(gè)高變區(qū)，在40～57 aa、67～90 aa、107～120 aa和138～160 aa的區(qū)域相對(duì)保守。在信號(hào)肽區(qū)的F23/S23突變和B細(xì)胞表位中的Q196/R196突變主要存在于Lineage8分離株；而在Lineage1分離株中，其信號(hào)肽區(qū)（1～31 aa）有8個(gè)氨基酸突變，2個(gè)高變區(qū)（HVR）中有4個(gè)氨基酸突變，3個(gè)跨膜區(qū)中有7個(gè)氨基酸突變，與跨膜區(qū)重疊的T細(xì)胞表位有3個(gè)氨基酸突變，另外2個(gè)抗原表位中有5個(gè)氨基酸突變，其他區(qū)域有5個(gè)氨基酸突變，提示Lineage1分離株突變程度高。位于GP5HVR1的第32、33、34、35位N-糖基化位點(diǎn)也存在不同程度的突變，N-糖基化位點(diǎn)對(duì)病毒感染、抗原特性以及病毒對(duì)體外中和抗體的敏感性都很重要。有研究報(bào)道R13和R151與毒力有關(guān)，本研究獲得的Lineage1分離株都存在R13/Q13和R151/K151的突變（除SHtl2/2019的R151沒(méi)有突變而外），在Lineage8中有4株存在R151/K151的突變（圖5）。

圖5 GP5蛋白氨基酸序列分析Fig.5 Amino acid sequence analysis of GP5 protein

2.6 Nsp9氨基酸序列比對(duì)分析 Nsp9蛋白具有RNA依賴性聚合酶活性（RdRp），參與PRRSV的亞基因組mRNA轉(zhuǎn)錄和基因組復(fù)制，為了分析PRRSV Nsp9的變異情況，將12株Nsp9基因進(jìn)行序列比對(duì)分析。結(jié)果顯示：12株Nsp9基因與參考株的核苷酸同源性為85.2%～99.6%，氨基酸同源性為94.2%～99.7%。先前的研究表明Nsp9的519、544、550位是與HP-PRRSV毒力變化相關(guān)的氨基酸，本研究獲得了12株Nsp9，除了1株的544位氨基酸與經(jīng)典株一致而外，其余毒株均保持了與HP-PRRSV類毒株一致的氨基酸特征（圖6）。

圖6 Nsp9與毒力相關(guān)的氨基酸比較Fig.6 Comparison of amino acids related to virulence of Nsp9

3 討論

由于PRRSV基因組易于變異，可導(dǎo)致PRRSV發(fā)生免疫逃逸，因此PRRS成為影響全球養(yǎng)豬業(yè)的重要傳染病之一[10]。盡管在當(dāng)前為了防控非洲豬瘟疫情而采取了嚴(yán)格的生物安全措施的情況下，一些養(yǎng)豬場(chǎng)依然存在PRRSV感染，對(duì)生豬生產(chǎn)造成不利的影響。目前在我國(guó)先后流行的有經(jīng)典的CH-1a類毒株、HP-PRRSV類毒株以及NADC30類毒株等具有不同致病力的毒株[11-12]，因此有必要及時(shí)監(jiān)測(cè)PRRSV的基因組變異情況。本研究檢測(cè)并分析了2017-2020年從上海市、浙江省、江蘇省等7個(gè)省市的部分發(fā)病豬場(chǎng)采集的臨床樣品，發(fā)現(xiàn)樣品中PRRSV陽(yáng)性率仍然較高。Nsp2是PRRSV中變異最大的非結(jié)構(gòu)蛋白，對(duì)病毒復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、病毒毒力以及調(diào)節(jié)宿主免疫應(yīng)答具有重要作用。Nsp2基因中存在缺失、重組、插入等多種突變方式，使得Nsp2基因片段的大小存在很大差異[13]。因此，Nsp2常作為分析PRRSV遺傳變異與進(jìn)化分析的目的基因，本研究對(duì)31株Nsp2基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析，證明PRRSV陽(yáng)性樣品中除了具有HP-PRRSV類毒株和NADC30類毒株的常見(jiàn)氨基酸缺失模式外，還出現(xiàn)了“111+5+1+19 aa”、“1+29+14 aa”的缺失模式，這種缺失模式是否對(duì)其致病性產(chǎn)生影響尚不清楚。其中23株流行株保留了HP-PRRSV類毒株的缺失特征，6株具有NADC30類毒株的缺失特征，只有2株與VR2332類毒株一樣，沒(méi)有氨基酸缺失或插入。PRRSV流行株的遺傳變異分析結(jié)果表明，本研究獲得的PRRSV主要分布在譜系L8、L1、L5，其中大部分為L(zhǎng)8，其次是L1，表明在2017-2020年采集樣品的豬場(chǎng)中流行的PRRSV主要是以HP-PRRSV類毒株為主，其次是NADC30類毒株。

PRRSV ORF5基因也是常用于分析病毒遺傳變異的靶基因，其編碼的GP5蛋白是結(jié)構(gòu)蛋白中變異最大的蛋白，GP5蛋白存在多個(gè)N-糖基化位點(diǎn)和中和性抗原表位，在病毒的復(fù)制、毒力以及誘導(dǎo)宿主的中和抗體產(chǎn)生中發(fā)揮重要作用[14-15]。在本研究我們對(duì)獲得的21株ORF5基因進(jìn)行序列分析，發(fā)現(xiàn)有14株與HP-PRRSV類毒株同屬一個(gè)亞群（L8），5株與NADC30類毒株同屬于一個(gè)亞群（L1），1株與CH-1a類毒株同屬于一個(gè)亞群，1株與QYYZ毒株同屬于一個(gè)于亞群（L3）。表明除了HP-PRRSV流行毒株外，NADC30類毒株的流行逐漸增多。此外，本研究發(fā)現(xiàn)有14株在中和表位37～44 aa處發(fā)生L39/I39的氨基酸突變，有1株存在H38/L39/Y38S39的氨基酸突變，而中和表位的突變可能有助于病毒逃避疫苗免疫誘導(dǎo)的中和作用，進(jìn)而降低疫苗免疫保護(hù)效率。有研究報(bào)道GP5中的R13和R151氨基酸與毒力有關(guān)[16]，Nsp9的519、544、550位氨基酸殘基是HP-PRRSV毒力的關(guān)鍵氨基酸[17]，本研究獲得的毒株中，有5株病毒在GP5蛋白存在R13/Q13的突變，8株存在R151/K151的氨基酸突變；而12株Nsp9中，除了1株在544位氨基酸與經(jīng)典毒株相同而外，而其他毒株毒力相關(guān)氨基酸均與HP-PRRSV類毒株一致，這些關(guān)鍵氨基酸的變異可能會(huì)影響PRRSV致病性。此外，發(fā)現(xiàn)同一毒株的ORF5和Nsp2基因分別屬于不同譜系，表明其可能存在潛在的重組事件。由此可見(jiàn)，突變和重組是PRRSV進(jìn)化的重要策略，只有實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和掌握PRRSV的變異情況及流行動(dòng)態(tài)，才能有效預(yù)防PRRSV疫情的發(fā)生。