梁霞霞，鄒 揚(yáng)，李濤善，陳 紅，曹富瓊,，楊建發(fā)，鄒豐才，孫曉林，朱興全,,4

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，蘭州 730070；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所 家畜疫病病原生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730046；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 云南省高校獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650201；4.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，太谷 030801）

畢氏腸微孢子蟲（Enterocytozoonbieneusi）和芽囊原蟲（Blastocystissp.）可引起人和動(dòng)物的微孢子蟲病和芽囊原蟲病，寄生于人類和多種動(dòng)物包括家畜的胃腸道，引起宿主發(fā)生腹瀉、腹痛、嘔吐等一系列臨床癥狀[1-2]。研究表明，兒童、免疫力低下的人（如艾滋病病人）以及老年人更易感，且癥狀相對(duì)更為嚴(yán)重[1,3]。目前畢氏腸微孢子蟲在我國牛的感染分布較廣，其感染率為2.0%～46.8%[4]，而關(guān)于牛感染芽囊原蟲的報(bào)道較少，只在廣東省、黑龍江省、青海省和陜西省報(bào)道過，感染率分別為1.88%、10.3%、27.07%、24.8%[5-8]。

基于核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer, ITS）序列，目前已報(bào)道的畢氏腸微孢子蟲基因型至少有470個(gè)，分屬于11個(gè)不同的組（Group 1～Group 11）[1]。其中，Group 1和Group 2包含了許多人和動(dòng)物都可感染的基因型，因此被認(rèn)為是人獸共患組，而Group3～Group11通常在特定宿主中被發(fā)現(xiàn)，因此被認(rèn)為是宿主特異組[1,9]。研究發(fā)現(xiàn)，至少有40種畢氏腸微孢子蟲基因型可以感染牛[4]?；诤颂求w小亞基（SSU rRNA）基因序列，目前已在人類、其他哺乳動(dòng)物、鳥類、爬行動(dòng)物和昆蟲中發(fā)現(xiàn)了17種芽囊原蟲基因亞型，其中可感染人的亞型有10種，分別為ST1～ST9及ST12[2]。研究表明，牛可感染的芽囊原蟲基因亞型有7種，分別為ST1、ST3、ST4、ST5、ST6、ST10、ST14[8]。

云嶺牛（Yunling cattle）是由我國科學(xué)家自主培育的首個(gè)三元雜交肉牛品種。育種過程中，以云南黃牛為母本，婆羅門牛和莫累灰牛為父本，形成含二分之一婆羅門牛、四分之一莫累灰牛和四分之一云南黃牛血緣的新品種[10]。云嶺牛綜合了云南黃牛適應(yīng)性強(qiáng)，耐粗飼和莫累灰牛生長(zhǎng)快、繁殖性能高、肉質(zhì)好以及婆羅門牛耐熱抗蜱的優(yōu)良特征，日漸受到廣大養(yǎng)殖戶和消費(fèi)者的喜愛[11]。云嶺?？梢愿腥疚⑿∩阮^蜱，但未見其他寄生蟲感染的報(bào)道[12]。本研究旨在調(diào)查和研究云嶺牛畢氏腸微孢子蟲和芽囊原蟲的感染情況以及基因分布，為防控云嶺牛感染這兩種腸道原蟲病提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 糞便樣品的采集 本研究共隨機(jī)采集云南省云嶺牛新鮮糞便樣本391份，其中昆明市201份，楚雄市190份。所有的糞便是在牛排泄后立即收集，并分別保存于含2.5%重鉻酸鉀溶液的15 mL無菌離心管中，記錄采樣時(shí)間、動(dòng)物的年齡、性別和樣品來源等相關(guān)信息。最后將采集的樣品迅速送至實(shí)驗(yàn)室并保存于4℃冰箱用于提取DNA。

1.2 主要試劑 糞便DNA提取試劑盒（離心柱型）購自美國OMEGA公司；ExTaqDNA 聚合酶（5 U/μL）、10×PCR Buffer (Mg2+free)、dNTP Mixture（2.5 mmol/L each）、MgCl2（25 mmol/L）、6×Loading Buffer、DL1000 DNA marker均購自Takara公司；溴化乙錠（EB）購自美國Sigma公司；50×TAE緩沖液購自北京索萊寶公司。本實(shí)驗(yàn)所用引物均由西安擎科澤西生物科技有限責(zé)任公司合成。

1.3 基因組DNA提取 每個(gè)糞便樣品在DNA提取之前，先取300 mg左右的糞便至2 mL滅菌離心管中，加入約1 mL滅菌ddH2O充分振蕩，11 000 ×g離心5 min，棄去上清液，反復(fù)洗滌以除去重鉻酸鉀溶液。剩余的沉淀（約200 mg）參照糞便基因組DNA提取試劑盒說明書提取DNA，并將提取的DNA置于-20℃保存。

1.4 畢氏腸微孢子蟲ITS序列擴(kuò)增及凝膠電泳鑒定 基于ITS序列，使用參考文獻(xiàn)[13]中的擴(kuò)增ITS序列的引物，對(duì)所提取的DNA樣品進(jìn)行巢氏PCR擴(kuò)增，引物序列見表1，巢式PCR反應(yīng)條件（25 μL）均為：DNA模板1 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）2 μL，MgCl2（25 mmol/L）2 μL，10×ExTaqDNA聚合酶1 μL，上、下游引物各1 μL，ddH2O補(bǔ)至25 μL。兩輪PCR反應(yīng)的退火溫度均為55℃，第一輪反應(yīng)的模板DNA為所提取的糞便基因組DNA，第二輪反應(yīng)的模板DNA則為第一輪PCR反應(yīng)產(chǎn)物。然后，取5 μL第二輪PCR反應(yīng)產(chǎn)物混合1 μL 6×上樣緩沖液于含溴化乙錠的2.0%瓊脂糖凝膠中電泳20 min，陽性PCR樣品送西安擎科澤西生物科技有限責(zé)任公司進(jìn)行測(cè)序。

表1 擴(kuò)增畢氏腸微孢子蟲ITS 序列的 PCR 引物Table 1 Primers for the nested PCR amplification of ITS sequences of E.benisuis

1.5 芽囊原蟲SSU rRNA基因擴(kuò)增及凝膠電泳鑒定 基于芽囊原蟲SSU rRNA 基因，作用參考文獻(xiàn)[14]中的擴(kuò)增引物，采用PCR結(jié)合測(cè)序的方法檢測(cè)和鑒定云嶺牛芽囊原蟲的感染率和基因型，引物序列見表2。PCR 反應(yīng)體系為：dNTP（2.5 mmol/L each）14.25 μL，10×PCR buffer（Mg2+free）2.5 μL，MgCl2（25 mmol/L）2 μL，F(xiàn)1（50 pmol/μL）1 μL，R1（50 pmol/μL）1 μL，ExTaqDNA聚合酶（5 U/μL）0.25 μL，模板DNA 2 μL。PCR反應(yīng)條件參照參考文獻(xiàn)[14]中的反應(yīng)條件并加以改進(jìn)，將退火溫度調(diào)整為65℃，PCR反應(yīng)的模板DNA為所提取的糞便基因組DNA。然后，取5 μL PCR反應(yīng)產(chǎn)物混合1 μL的6×上樣緩沖液于含溴化乙錠的1.0%瓊脂糖凝膠中電泳20 min，陽性PCR樣品送測(cè)序。

表2 擴(kuò)增芽囊原蟲SSU rRNA的PCR引物Table 2 Primers for the amplification of SSU rRNA of Blastocystis sp.

1.6 測(cè)序及序列分析 將凝膠成像顯示為陽性的第二輪PCR反應(yīng)產(chǎn)物送測(cè)序，獲得的原始序列首先通過BLASTn與NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫中獲得的序列進(jìn)行比對(duì)，然后參照序列圖譜進(jìn)行校正。再用軟件ClustalX 1.83進(jìn)行校對(duì)，確定畢氏腸微孢子蟲和芽囊原蟲的基因型。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 使用SPSS 24.0軟件中的χ2檢驗(yàn)，對(duì)云嶺牛不同采樣地點(diǎn)、不同年齡和不同性別的畢氏腸微孢子蟲和芽囊原蟲感染率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，當(dāng)P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 云嶺牛畢氏腸微孢子蟲感染情況 基于ITS序列，對(duì)采集的391份云嶺牛糞便樣品進(jìn)行巢氏PCR擴(kuò)增，有17份擴(kuò)增出約392 bp的目的片段（圖1、表3），總感染率為4.35%（17/391）。其中昆明市和楚雄市的感染率分別為4.48%（9/201）和4.21%（8/190），不同采樣地區(qū)云嶺牛的畢氏腸微孢子蟲感染率在統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異不顯著（P＞0.05）；在不同年齡的云嶺牛中，成年牛感染率為2.06%（6/291），而犢牛的感染率為11.00%（11/100），其感染率的差異極顯著（P＜0.01）；雌性牛的感染率為3.50%（11/314），雄性牛的感染率為7.79%（6/77），不同性別的云嶺牛的畢氏腸微孢子蟲差異不顯著（P＞0.05）（表3）。

圖1 畢氏腸微孢子蟲ITS巢氏PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Nested PCR amplification results of ITS gene of E.bieneusi

表3 云嶺牛畢氏腸微孢子蟲感染情況Table 3 The prevalence of E.bieneusi in Yunling cattle

2.2 云嶺牛畢氏腸微孢子蟲基因型鑒定 對(duì)本研究中所獲得的17份畢氏腸微孢子蟲陽性樣品，通過ITS序列中243 bp的序列片段比對(duì)分析，鑒定出兩種已知基因型，BEB8（n=1）和J（n=16），其中基因型J為云南省云嶺牛感染畢氏腸微孢子蟲優(yōu)勢(shì)基因型（表4）。

表4 云嶺牛畢氏腸微孢子蟲基因型分布Table 4 Genotype distribution of E.benisuis in Yunling cattle

2.3 云嶺牛芽囊原蟲感染情況 基于SSU rRNA基因序列進(jìn)行云嶺 牛 芽囊原蟲的檢測(cè)，391份云嶺牛糞便中共檢測(cè)到108份芽囊原蟲陽性樣品，總感染率為27.62%（108/391）（圖2、表5）。其中，楚雄市云嶺牛芽囊原蟲的感染率（30.53%）略高于昆明市（24.88%），但差異不顯著（P＞0.05）；在不同年齡組中，犢牛的感染率（47.00%）明顯高于成年牛（20.96%），差異極顯著（P＜0.01）；在不同性別的云嶺牛中，雌性牛的感染率為25.16%，低于雄性牛的37.66%，差異顯著（P＜0.05）。

圖2 芽囊原蟲SSU rRNA 基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 PCR amplification results of SSU rRNA gene of Blastocystis sp.

表5 云嶺牛芽 囊原蟲感染情況Table 5 The prevalence of Blastocystis sp.in Yunling cattle

2.4 云嶺牛芽囊原蟲基因亞型鑒定 通過序列比對(duì)分析，在對(duì)本研究中測(cè)序成功的108個(gè)芽囊原蟲序列與NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫中的相應(yīng)序列進(jìn)行比對(duì)，共鑒定出4種芽囊原蟲基因亞型，分別為：ST1（n=4）、ST5（n=15）、ST10（n=84）、ST14（n=5）（表6），其中兩種為人獸共患基因亞型（ST1和ST5），兩種為宿主特異基因亞型（ST10和ST14）。

表6 云嶺牛芽囊原蟲基因亞型分布情況Table 6 Subtype distribution of Blastocystis sp.in Yunling cattle

3 討論

畢氏腸微孢子蟲和芽囊原蟲是兩種常見的可引起人畜共患腸道原蟲疾病的病原，在全球已有許多關(guān)于牛感染這兩種腸道原蟲的研究報(bào)道，但目前還沒有任何關(guān)于云嶺牛感染畢氏腸微孢子蟲和芽囊原蟲的數(shù)據(jù)。有鑒于此，本研究首次調(diào)查研究了云嶺牛畢氏腸微孢子蟲和芽囊原蟲的感染情況，其研究結(jié)果填補(bǔ)了云嶺牛感染畢氏腸微孢子蟲和芽囊原蟲的空白，對(duì)云嶺牛腸道原蟲病的防控具有一定的指導(dǎo)意義。

3.1 云嶺牛畢氏腸微孢子蟲的感染情況 本研究發(fā)現(xiàn)云嶺牛畢氏腸微孢子蟲的總感染率為4.35%（17/391）（表3），高于甘肅省白牦牛（1.13%）[15]、湖南省水牛（2.2%）[4]以及西藏黃牛的感染率（2.5%）[16]，但低于龍江和牛（7.09%）[17]、西藏牦牛（5.0%）[18]、秦川牛（19.65%）[19]以及河北省和天津市的奶牛的感染率（19.4%）[20]，這些差異提示不同品種的牛對(duì)畢氏腸微孢子蟲的易感性存在差異。研究還發(fā)現(xiàn)，在不同地區(qū)牛畢氏腸微孢子蟲的感染率也存在差異，與其他省份和其他國家的牛畢氏腸微孢子蟲的感染率相比，云嶺牛畢氏腸微孢子蟲的感染率高于甘肅?。?.13%）[15]和山東省的牛畢氏腸微孢子蟲的感染率（2.0%）[4]，低于河南省（21.2%）[4]、上海市（26.5%）[4]、黑龍江?。?0.1%）[4]、巴西（17.5%）[21]、阿根廷（14.3%）[22]、韓國（15%）[23]牛畢氏腸微孢子蟲感染率。造成這種差異的原因可能與采樣時(shí)間、檢測(cè)方法、地理位置、樣本量大小等有關(guān)。此外，本研究中犢牛畢氏腸微孢子蟲的感染率顯著（P＜0.01）高于成年牛（表3）。Hu等[21-22]也發(fā)現(xiàn)犢牛畢氏腸微孢子蟲的感染率比成年牛的更高，與我們的研究結(jié)果一致。這可能是因?yàn)闋倥５拿庖吡Φ拖滤鶎?dǎo)致的。

3.2 云嶺牛畢氏腸微孢子蟲基因型分布 為了揭示云嶺牛畢氏腸微孢子蟲的基因型分布，本研究對(duì)測(cè)序成功的17份畢氏腸微孢子蟲陽性序列進(jìn)行序列分析，發(fā)現(xiàn)存在兩種已知的基因型，其中1個(gè)樣品為基因型BEB8，16個(gè)樣品為J，其中J為優(yōu)勢(shì)基因型，占陽性總數(shù)的94.12%（16/17）（表4），與Xue等[17]報(bào)道的中國東北地區(qū)龍江和牛和Del等[22]報(bào)道的阿根廷奶牛的優(yōu)勢(shì)基因型一致，但與甘肅省白牦牛和西藏牦牛的優(yōu)勢(shì)基因型BEB4不同[15,18]；提示品種和地域的差異可能會(huì)造成基因型分布的差異。而基因型J作為云嶺牛感染的優(yōu)勢(shì)基因型，廣泛分布在雌性（10個(gè)）和犢牛（10個(gè)）中（表4），這提示J基因型可能是雌性犢牛的易感基因型。此外，在云南省云嶺牛中只檢測(cè)到一個(gè)畢氏腸微孢子蟲BEB8基因型，且分布在昆明地區(qū)，說明該基因型對(duì)所調(diào)查地區(qū)的云嶺牛不易感。

3.3 云嶺牛芽囊原蟲的感染情況 本研究中，云嶺牛芽囊原蟲的感染率為27.62%（表5），與王莎莎[8]報(bào)道的秦川犢牛（27.2%）和Ren等[7]報(bào)道的青海省牦牛（27.07%）芽囊原蟲感染率接近，但高于王璐陽等[5]在廣東省報(bào)道的奶牛（1.88%）和Zhu等[6]等在黑龍江省報(bào)道的奶牛的感染率（10.3%），這些感染率的差異可能與牛的不同品種有關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)，云南省云嶺牛芽囊原蟲的感染率高于廣東?。?.88%）[5]、黑龍江?。?0.3%）[6]、土耳其（11.25%）[24]，韓國（6.7%）[25]和伊朗（9.6%）[26]牛芽囊原蟲感染率，但卻低于泰國（37.2%）[27]、日本（54.1%）[28]、哥倫比亞（80.0%）[29]等地的牛芽囊原蟲感染率。這些牛芽囊原蟲感染率的差異可能與不同地區(qū)有關(guān)，但也可能受季節(jié)、檢測(cè)方法和飼養(yǎng)方式等其他因素的影響。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，芽囊原蟲的感染率與年齡密切相關(guān)，犢牛的感染率（47.00%）顯著（P＜0.01）高于成年牛感染率（20.96%），這與王璐陽等[5-6]報(bào)道的結(jié)果相一致。我們推測(cè)犢?？赡苁茄磕以x的易感群體，但這一結(jié)果仍需要進(jìn)一步驗(yàn)證。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)不同性別的云嶺牛芽囊原蟲感染率存在顯著差異（P＜0.05），雄性牛的感染率（37.66%）顯著高于雌性牛（25.16%）（表5），但之前關(guān)于牛感染芽囊原蟲的研究未見有此類結(jié)果的報(bào)道，導(dǎo)致這種差異的原因尚不明確，還需進(jìn)一步研究。

3.4 云嶺牛 芽囊原蟲基因亞型分布 本研究通過序列比對(duì)在云嶺牛中共鑒定出4種芽囊原蟲基因亞型（ST1、ST5、ST10、ST14），其中ST10（77.78%，84/108）為優(yōu)勢(shì)基因亞型（表6），這與廣東省、黑龍江省和陜西省報(bào)道的牛感染芽囊原蟲的優(yōu)勢(shì)基因亞型一致[5-6,8]。此外，本研究中發(fā)現(xiàn)的ST1和ST5基因亞型屬于人獸共患基因亞型，這兩種基因亞型也分別在云南地區(qū)的人和羊中報(bào)道[30-31]，這些發(fā)現(xiàn)也提示云嶺?？赡苁侨嘶蚱渌麆?dòng)物感染芽囊原蟲的潛在傳染源，提醒當(dāng)?shù)仞B(yǎng)殖人員應(yīng)當(dāng)注意防范。云嶺牛感染芽囊原蟲的優(yōu)勢(shì)基因亞型ST10廣泛分布于雌性云嶺牛（79.75%，63/79），而在雄性牛該基因亞型分布較少（72.41%，21/29）；成年云嶺牛ST10的感染率（80.32%，49/61）也高于犢牛（74.47%，35/47）（表6），因此我們推測(cè)ST10基因亞型可能對(duì)成年雌性云嶺牛更易感，但這一結(jié)論仍需后續(xù)的驗(yàn)證。

綜上所述，本研究首次對(duì)云南省云嶺牛的畢氏腸微孢子蟲和芽囊原蟲的感染情況進(jìn)行了分子生物學(xué)調(diào)查，研究發(fā)現(xiàn)云南省云嶺牛畢氏腸微孢子蟲的感染率為4.35%，芽囊原蟲的感染率為27.62%；共鑒定出2種已知的畢氏腸微孢子基因型（BEB8和J）以及共鑒定出4種不同的芽囊原蟲基因亞型，分別為ST1、ST5、ST10、ST14，均為已在牛上報(bào)道過的基因亞型。本研究結(jié)果不僅擴(kuò)展了畢氏腸微孢子蟲和芽囊原蟲的宿主范圍，而且也為防控云嶺牛的這兩種腸道原蟲病提供了有用的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。