宋燕州，張昆，陳琦軍，魏文平，趙新，李志偉，李偉

0 引言

NEK7（NIMA-related kinase 7）作為NEK家族中的重要一員，在紡錘體形成及促進(jìn)有絲分裂過程中發(fā)揮了重要作用：在有絲分裂期間，NEK7主要定位于中心體，通過減少G2/M期的中心體周膜物質(zhì)的丟失及停搏來確保有絲分裂進(jìn)程的準(zhǔn)確執(zhí)行[1-3]。

既往研究表明，相較于正常組織，NEK7在膽囊癌中高表達(dá)，并且與腫瘤分化、轉(zhuǎn)移和患者生存率之間有著顯著關(guān)系[4]。本課題組前期的研究表明NEK7在肝癌組織中呈高表達(dá)，且其表達(dá)水平與患者預(yù)后密切相關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)擬在前期研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步從細(xì)胞學(xué)角度探究NEK7表達(dá)與細(xì)胞生物學(xué)行為之間的關(guān)系，并初步探究引起相關(guān)變化的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及試劑

肝癌細(xì)胞系HepG2、Hep3B、MHCC-97H、Huh-7及人肝永生化THLE-2細(xì)胞系，購自中科院上海生命科學(xué)研究院，RPMI 1640培養(yǎng)基、TRIzol和細(xì)胞裂解液均購自上海賽默飛世爾科技（中國）有限公司，20%胎牛血清購自上海語純生物科技有限公司，胰蛋白酶購自上海雅心生物技術(shù)有限公司，兔抗人NEK7單克隆抗體購自美國Proteintech公司，MTT液購自上海泛科生物有限公司，ECL試劑購自上海圣克魯斯生物技術(shù)有限公司，PCR試劑盒購自大連TaKaRa寶生物工程有限公司，NEK7引物購自北京三博遠(yuǎn)志生物公司，考馬斯亮藍(lán)和辣根標(biāo)記山羊抗兔購自美國Sigma-Aldrich生物公司，PI-Annexin V FITC雙標(biāo)試劑盒購自美國BD公司。

1.2 靶向設(shè)計(jì)NEK7-shRNA

根據(jù)PubMed查詢到的NEK7m RNA基因序列號信息（NM_133494.2），遵守RNAi總體設(shè)計(jì)原則，應(yīng)用shDirectvershon2.0軟件構(gòu)建了三條NEK7-sh RNA寡核苷酸序列及陰性shRNA序列：shRNA-70：Sense-5’-CCGGATATGGGCTATAATACATT-3’,shRNA-269：Sense-5’-ACCATCCAAATGTAATAAAATAT-3’，shRNA-469：Sense-5’-GTCATGCATAGAGA TATAAAACC-3’，陰性shRNA序列：Sense-5’-TACTTTCTATCGTGACATAATGA-3’。以上序列均由上海吉瑪生物制藥技術(shù)有限公司合成及裝載慢病毒轉(zhuǎn)染載體。

1.3 NEK7-shRNA慢病毒轉(zhuǎn)染及篩選

應(yīng)用不同濃度嘌呤霉素進(jìn)行HepG2肝癌細(xì)胞的篩選濃度，將所設(shè)計(jì)的三條不同shRNA序列（shRNA-469、shRNA-269及shRNA-70）及陰性shRNA序列（Negative）進(jìn)行質(zhì)粒組裝，應(yīng)用Western blot及RT-PCR檢測不同shRNA抑制效果，篩選抑制NEK7表達(dá)效果最佳的shRNA序列。將所篩選抑制效果最佳的shRNA進(jìn)行慢病毒組裝，實(shí)驗(yàn)分三組，按HepG2細(xì)胞病毒轉(zhuǎn)染最佳MOI 20 pfu number/cell進(jìn)行shRNA-慢病毒載體、陰性shRNA-慢病毒載體（Negative）及空載慢病毒載體（Blank）轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞，4 μg/ml嘌呤霉素進(jìn)行轉(zhuǎn)染后肝癌細(xì)胞為期一周的篩選，Western blot及RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染慢病毒后抑制NEK7表達(dá)效果。

1.4 RT-PCR檢測細(xì)胞中NEK7 mRNA的表達(dá)

按照飛捷生物公司RNA Fast 2000總RNA提取試劑盒說明書操作步驟，提取不同細(xì)胞中總RNA，以37℃ 15 min→85℃ 5 s→-20℃冰箱中保存反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，PCR 25 μl體系包括cDNA 2.5 μl、Primer1 1 μl、Primer2 1 μl、2×Master Mix 12.5 μl及滅菌蒸餾水8 μl進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件：50℃預(yù)變性2 min,95℃ 30 s,58℃ 30 s,72℃ 1 min，共循環(huán)30次，72℃ 10 min進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測NEK7 mRNA的表達(dá)。

1.5 Western blot檢測細(xì)胞中NEK7及細(xì)胞周期相關(guān)因子的表達(dá)

按照說明書操作步驟，收集細(xì)胞，將細(xì)胞加入Pierce 100 μl，振蕩后冰上放置5 min，予以13 000 r/min離心10 min，收集細(xì)胞蛋白至EP管，于聚丙烯凝膠進(jìn)行電泳后轉(zhuǎn)膜于偏聚二氟乙烯膜上，脫脂奶浸泡后分別予以1:1000的一抗（兔抗人NEK7抗體）及1:20000的二抗進(jìn)行封閉與雜交，通過凝膠成像系統(tǒng)對目的蛋白以及內(nèi)參蛋白免疫印跡條帶進(jìn)行分析，探究不同肝癌細(xì)胞系中NEK7及細(xì)胞周期相關(guān)因子的表達(dá)。

1.6 MTT實(shí)驗(yàn)

MTT法檢測不同處理組細(xì)胞增殖活性、β-半乳糖苷酶染色檢測細(xì)胞衰老、Annexin V處理細(xì)胞后流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染后肝癌細(xì)胞的凋亡及細(xì)胞周期的變化。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間差異比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同肝癌細(xì)胞系及THLE-2細(xì)胞系中NEK7的表達(dá)

相較于THLE-2細(xì)胞系，所有肝癌細(xì)胞系NEK7表達(dá)均顯著升高（均P<0.05），其中HepG2細(xì)胞系NEK7表達(dá)高于其余三種細(xì)胞系，見圖1。選取HepG2細(xì)胞系進(jìn)行探究抑制NEK7表達(dá)后對細(xì)胞增殖活性、衰老及凋亡的影響。

圖1 Western blot(A)及RT-PCR(B)檢測不同肝癌細(xì)胞系及THLE-2細(xì)胞系中NEK7表達(dá)情況Figure 1 Expression level of NEK7 in hepatocellular carcinoma cells and THLE-2 cells detected by Western blot(A) and RT-PCR(B)

2.2 轉(zhuǎn)染不同shRNA質(zhì)粒抑制肝癌細(xì)胞中NEK7的表達(dá)

HepG2細(xì)胞株轉(zhuǎn)染不同shRNA質(zhì)粒72 h后，與陰性shRNA組細(xì)胞相比，各干擾組細(xì)胞中NEK7表達(dá)均有不同程度的下降，其中shRNA-70抑制NEK7表達(dá)效果較其他兩組抑制效果更加明顯（P<0.001），見圖2。

圖2 Western blot(A)及RT-PCR(B)檢測轉(zhuǎn)染不同shRNA后肝癌細(xì)胞中NEK7表達(dá)情況Figure 2 NEK7 expression in hepatocellular carcinoma cells after transfection of different shRNA detected by Western blot(A) and RT-PCR(B)

2.3 不同處理組肝癌細(xì)胞中NEK7的表達(dá)

HepG2肝癌細(xì)胞株轉(zhuǎn)染陰性shRNA及shRNA-70慢病毒載體后，與空白對照組及陰性對照組相比，轉(zhuǎn)染shRNA-70慢病毒載體組肝癌細(xì)胞NEK7表達(dá)顯著下降（均P<0.01），見圖3。

圖3 Western blot(A)及RT-PCR(B)檢測不同處理組肝癌細(xì)胞中NEK7表達(dá)情況Figure 3 Expression level of NEK7 in different treatment groups of hepatocellular carcinoma cells detected by Western blot(A) and RT-PCR(B)

2.4 MTT法檢測細(xì)胞增殖活性

與空白對照組、陰性對照組相比，轉(zhuǎn)染shRNA-70組的肝癌細(xì)胞，其增殖活性在24 h時(shí)開始出現(xiàn)降低趨勢，在第72 h增殖活性受到的抑制最為顯著，見圖4、表1。

圖4 MTT法檢測不同處理組肝癌細(xì)胞增殖活性Figure 4 Proliferation activity of hepatocellular carcinoma cells in different treatment groups detected by MTT

表1 不同處理組細(xì)胞增殖活性Table 1 Cell proliferation activity in different treatment groups

2.5 β-半乳糖苷酶染色檢測肝癌細(xì)胞衰老

與空白對照組及陰性對照組比較，轉(zhuǎn)染shRNA-70組的肝癌細(xì)胞，其衰老細(xì)胞比例顯著升高，見圖5。

圖5 不同處理組細(xì)胞衰老情況Figure 5 Cell senescence in different treatment groups

2.6 不同處理組肝癌細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的變化

應(yīng)用不同處理方法處理肝癌細(xì)胞48 h后，經(jīng)過PI-Annexin V-FITC標(biāo)記雙染，結(jié)果表明，與空白對照組及陰性對照組比，轉(zhuǎn)染shRNA-70組抑制NEK7表達(dá)后，肝癌細(xì)胞凋亡百分率顯著升高，其細(xì)胞周期進(jìn)程受阻，G2/M期細(xì)胞數(shù)目明顯減少，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖6。

圖6 不同處理組細(xì)胞48h后細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡情況Figure 6 Cell cycle and apoptosis in different treatment groups after 48 hours

2.7 Western blot檢測細(xì)胞周期相關(guān)因子表達(dá)

與空白對照組及陰性對照組相比，轉(zhuǎn)染shRNA-70慢病毒載體的肝癌細(xì)胞，其C-myc、c-Fos、cyclin D1及cyclin E表達(dá)明顯降低，而P16及P27的表達(dá)顯著升高，CDK2、CDK4及CDK6在三者中的差別并不明顯，見圖7。

圖7 不同處理組細(xì)胞周期因子的變化Figure 7 Changes of cell cycle-related factors in different treatment groups

3 討論

NEK家族成員在有絲分裂中主要參與了G2/M期關(guān)鍵點(diǎn)的調(diào)控，并在促進(jìn)中心體成熟并影響染色體的濃集和紡錘體形成過程中發(fā)揮重要作用[5]。

NEK7作為NEK家族中重要的一員，既往研究表明在多種實(shí)體腫瘤中，NEK7均呈高表達(dá)狀態(tài)[4,6-7]，為了探究NEK7在肝癌細(xì)胞中的功能，首先我們分析了不同肝癌細(xì)胞及人肝永生化THLE-2細(xì)胞系中NEK7的表達(dá)情況，結(jié)果顯示肝癌細(xì)胞中NEK7呈高表達(dá)狀態(tài)。

針對NEK7，我們設(shè)計(jì)了不同的shRNA序列，并篩選出最佳抑制序列，進(jìn)而構(gòu)建慢病毒載體轉(zhuǎn)染所篩選出的肝癌細(xì)胞，抑制NEK7的表達(dá)水平。與實(shí)驗(yàn)預(yù)期的設(shè)想一致，抑制NEK7表達(dá)后，肝癌細(xì)胞的增殖活性受到顯著抑制，同時(shí)肝癌細(xì)胞在不同時(shí)象出現(xiàn)了細(xì)胞衰老的表現(xiàn)，凋亡實(shí)驗(yàn)則表明NEK7的表達(dá)受到抑制后，肝癌細(xì)胞凋亡的比例顯著升高。

進(jìn)一步研究結(jié)果表明，抑制NEK7表達(dá)后，細(xì)胞周期進(jìn)程受阻，處于S期及G2/M期的細(xì)胞比例顯著下降。研究表明細(xì)胞周期中P16及P27可與細(xì)胞周期素D競爭性結(jié)合CDK2/4/6，阻止細(xì)胞從G1期進(jìn)入到S期，從而對有絲分裂進(jìn)行負(fù)調(diào)節(jié)[8-9]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣表明，抑制NEK7后P16及P27的表達(dá)均有所升高，而在細(xì)胞增殖中通過結(jié)合形成活化蛋白1，進(jìn)而誘導(dǎo)或抑制相關(guān)基因或蛋白的表達(dá)而對細(xì)胞周期起到正調(diào)控作用的C-myc、c-Fos因子[10-11]，其表達(dá)則受到了抑制。與設(shè)想不一致的是與對照組細(xì)胞相比，抑制了NEK7表達(dá)的肝癌細(xì)胞其CDK的表達(dá)似乎并未受到影響，我們推測可能由于P16、cyclin D1/CDK4(6)及P27、cyclin E/CDK2復(fù)合物作為抑制劑，其表達(dá)的下降可能遮掩了NEK7對于CDK的單獨(dú)抑制影響。

基于本研究結(jié)果，我們推斷NEK7在肝癌細(xì)胞的發(fā)生及發(fā)展中可能起到了一定的推動(dòng)作用，進(jìn)一步的體內(nèi)研究及探究其在肝癌細(xì)胞發(fā)生及發(fā)展過程中的具體機(jī)制，可能會(huì)為肝癌的早期診斷及分子靶向治療提供新的靶位點(diǎn)。