劉青青

（蘇州大學劍橋-蘇大基因組資源中心 江蘇·蘇州 215123）

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

顯微鑷子、眼用手術剪刀和鑷子、26G留置針、70 m濾網、0.45 m過濾器、50mL離心管、10cm細胞培養(yǎng)皿、蠕動泵（LongerPump）、體式解剖鏡（Nikon）、顯微鏡（Olympus）、臺式離心機（Thermo）、高壓滅菌鍋（廈門致微）、細胞培養(yǎng)箱（Thermo）。

1.2 試劑

D-Hank’s平衡鹽溶液（PB180321）、DMEM 低糖（PM150246）、DMEM/F12（PM150313）、DMEM 高糖（PM150210）、200mM的Glutamine（PB180419）、1M 的HEPES（PB180325）、PBS、FBS、100×雙抗、0.25%Trypsin購自武漢普諾賽生命科技有限公司。DNaseI（KGF008）購自凱基生物。三溴乙醇（T48402）、2-甲基-2-丁醇（240486）、乳酸鈉（L4263）、地塞米松（D4902）、CollagenI（C3867）、膠原酶 IV（C5138）、EGTA（E3889）購自 Sigma 公司。無水乙醇購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.3 溶液配制

（1）麻醉液：稱取10g的三溴乙醇，加入10mL的2-甲基-2-丁醇，4℃溶解過夜，使之充分溶解。取出上述溶液1.2mL，加ddH2O定容至100mL，顛倒混勻，4℃避光保存。

（2）100mM EGTA：稱取3.804g的EGTA，加入50mL的ddH2O攪拌溶解，攪拌過程中加入2M的NaOH促溶，待 EGTA完全溶解后，調節(jié) pH至7.2后，溶液定容至100mL。高壓滅菌后備用。

（3）地塞米松：25mg的地塞米松，加入25mL的無水乙醇，配制成2.55mM（1mg/mL）。取出1mL加入49mL的DMEM高糖培養(yǎng)基，稀釋成51 M（20 g/mL）的儲存濃度。

（4）Collagen I包被培養(yǎng)板：5mg/mL的Collagen I取出1mL，加入49mL的PBS溶液，將Collagen I稀釋為0.1mg/mL。10cm培養(yǎng)皿中加入10mL的0.1mg/mL的Collagen I，室溫靜置2小時以上或者4℃過夜包被。包被后的培養(yǎng)皿使用前在室溫恢復30min，吸棄包被液，用PBS洗滌1次后，可接種細胞。

（5）2%膠原酶IV：稱取0.5g的酶，加入25mL的DHank’s平衡鹽溶液，攪拌溶解30min，用0.45 m濾器過濾去除不溶顆粒，以免灌流時堵塞血管。

（6）灌流液I：吸取0.5mL1M的HEPES，0.5mL的100mM的EGTA，0.5mL 的100×雙抗，用 D-Hank’s補足至 50mL。

（7）灌流液II：吸取0.5mL1M的HEPES，0.5mL的2%膠原酶IV，0.5mL的100×雙抗，DMEM低糖補足至50mL。

（8）洗滌液：吸取2.5mL的FBS，10 L的60%w/w乳酸鈉，4 L 的 DNase I，0.5mL 的 100×雙抗，DMEM/F12補至50mL。

（9）肝細胞培養(yǎng)基：吸取5mL的FBS，0.5mL的100×Glutamine，0.1mL的51 M地塞米松，0.5mL的100×雙抗，DMEM高糖補至50mL。

1.4 實驗動物

9-12周齡的SPF級C57BL/6J雄鼠購自上海斯萊克實驗動物公司，飼養(yǎng)于蘇州大學實驗動物中心SPF級屏障系統(tǒng)。溫度控制在23±2℃，晝夜明暗交替時間12/12h。動物實驗操作嚴格遵守蘇州大學實驗動物倫理委員會的要求。

2 方法

（1）灌流液I、II在水浴鍋內37℃預熱10min。

（2）留置針連接到蠕動泵硅膠管，以5mL/min流速先灌流75%酒精，灌流5min。然后灌流D-Hank’s平衡鹽溶液5min。最后以2mL/min流速灌流5min灌流液I，直至管內無氣泡，全部充盈灌流液I，暫停蠕動泵，備用。

（3）小鼠按照30 L/1g體重的劑量，腹腔注射麻醉液，等待2-3min小鼠進入深度麻醉。

（4）拎起鼠耳，將小鼠軀干浸泡于75%酒精30s，拎出在吸水紙上吸去多余酒精。

（5）固定小鼠四肢，使之呈“大”字形。在小鼠下肢腹部中線位置剪開皮膚和肌肉層，暴露腹腔。用鑷子把胃腸部撥到右邊，找到門靜脈和下腔靜脈。

（6）體式解剖鏡下邊觀察邊用眼科鑷與顯微鑷配合，輕輕剝離下腔靜脈處的白色薄膜和脂肪層，將留置針水平刺入下腔靜脈。

（7）開啟蠕動泵，灌流液I以2mL/min灌流約10s，肝臟顏色微微變淺、輕微膨脹時立即剪開門靜脈血管。

（8）持續(xù)灌流2min后，調整流速為3mL/min灌流2min。以后每灌流2min，流速增加1mL/min，直至最大灌流速度5mL/min。持續(xù)灌流至肝臟變成沙黃色，無血液留出。灌流液I總灌流時間約8-10min。

（9）灌流液轉換成灌流液II繼續(xù)灌流7-10min。灌流過程中，可以用鑷子夾閉門靜脈剪破口前端30s然后再松開，讓消化液充盈肝臟，使其充分消化。待肝臟微微膨脹，鑷子輕輕按壓肝臟后，按壓痕跡不會回彈時，即為肝臟消化完成。

（10）剪下肝臟放到含有10mL洗滌液的培養(yǎng)皿中，用眼科剪或200uL槍頭撕開肝臟外包膜，在溶液中抖動肝臟從而釋放肝臟細胞。

（11）上述細胞懸液用70 m細胞濾網過濾。過濾液按照50g/min轉速離心2min，使肝細胞沉淀下來。

（12）棄上清，加入15mL洗滌液重懸，50g/min離心2min，吸棄上清。重復洗滌2-3次。

（13）加5mL肝細胞培養(yǎng)基重懸，取細胞懸液加臺盼藍染色，統(tǒng)計細胞數及活率。

（14）按照3×105個/mL有活性的肝細胞密度接種于Collagen I包被的培養(yǎng)皿中，細胞置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6-8h。

（15）培養(yǎng)6-8h后，吸棄舊培養(yǎng)基，PBS洗滌2次，去除未貼壁的肝細胞。

（16）加入新鮮的肝細胞培養(yǎng)基，細胞置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2天更換培養(yǎng)基。

3 結果

9-12周齡C57BL/6J雄鼠經過肝臟灌流消化，平均每只小鼠可獲得3×107個肝細胞，細胞活率達80%。原代肝細胞培養(yǎng)6-8小時，細胞貼壁；培養(yǎng)24小時內，肝細胞呈現有邊界的多邊形，大部分細胞為兩個或多個細胞核（Fig1）。肝細胞培養(yǎng)超過24小時，細胞形態(tài)逐漸發(fā)生變化，變?yōu)椴灰?guī)則形（見圖1）。

Fig1 原代肝細胞（200×放大倍數）

4 討論

肝臟是機體最大的消化器官、解毒器官，也是重要的免疫器官。肝臟中，80%的細胞是肝細胞（肝實質細胞），大約20%細胞為非實質細胞，主要由肝竇內皮細胞、肝星狀細胞、巨噬細胞、膽管細胞、淋巴細胞等多種細胞組成。

肝細胞對pH、滲透壓以及ROS等極其敏感，直接剪碎肝臟并用消化酶消化很難獲得有活性的肝細胞，必須通過肝門靜脈或下腔靜脈灌流的方式來消化肝組織。而小鼠的肝臟小，門靜脈細，導致灌流技術較難掌握，阻礙了小鼠原代肝細胞的體外研究，譬如原代肝細胞能量代謝分析等。

本方法使用DMEM低糖、DMEM/F12作為灌流洗滌液，與部分文獻報道使用Williams’培養(yǎng)基E相比，兩者提取出的肝細胞數量和活率差異不大，并且使用DMEM系列培養(yǎng)基還具有價格便宜、采購周期短等優(yōu)點。

在灌流過程中，發(fā)現灌流速度對肝細胞的活率有較大影響，推測是灌流速度太快，導致肝臟過度膨脹，肝內壓增大，使肝細胞活率下降。因此，灌流時，流速調整寧慢勿快。灌流法常用肝門靜脈或下腔靜脈作為進針處，經過比較試驗發(fā)現，下腔靜脈比門靜脈粗大，血管走向清晰筆直，進針相對容易，下腔靜脈進針法較易掌握。