馬 亮 趙海玲 趙婷婷 趙美美 劉 怡 高 芃 李 平 曹永彤*

(1.中日友好醫(yī)院檢驗科，北京 100029；2.中日友好醫(yī)院臨床醫(yī)學研究所 免疫炎性疾病北京市重點實驗室，北京 100029)

2型糖尿病(diabetes mellitus, DM)是一種復雜的代謝紊亂疾病，長期高血糖會導致機體多器官受累并出現(xiàn)較嚴重的并發(fā)癥。糖尿病相關腎病(diabetic kidney disease, DKD)是DM的主要血管并發(fā)癥，約有30%～40%的DM患者最終發(fā)展為DKD。DKD是多種因素綜合作用的結果，其中糖代謝紊亂、腎血流動力學的改變、微炎癥以及遺傳背景等均起到非常重要的作用[1]。近年來，微炎癥在DKD的發(fā)病機制中受到越來越多的重視。Tuttle等[2]認為DM是一種由代謝紊亂觸發(fā)的炎癥性疾病。長時間微環(huán)境炎癥是DKD發(fā)病的主要原因之一,相關研究[3]表明，抗炎分子能減輕DKD，促炎因子如白細胞介素-1(interleukin-1,IL-1)、IL-6、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)等可以促進DKD進展[4]。

近年來，可溶性環(huán)氧化物水解酶(soluble epoxide hydrolase, sEH)在腎臟疾病尤其是DKD發(fā)病中所起的作用逐漸被重視，sEH抑制劑的研究以及該基因敲除有可能成為DKD治療的新靶點。EPHX2編碼的sEH可水解體內由芳香族和烯類化合物代謝產生的環(huán)氧二十碳三烯酸(epoxyeicosatrienoic acids，EETs)生成相應的二羥基二十碳三烯酸(dihydroxyeicosatrienoic acids，DHETs)，而且多個研究也表明EETs具有抗炎、舒張血管平滑肌、抗凝、促進血管生成、抗凋亡等多種功能。腎臟EETs濃度降低可促進DKD的發(fā)展，給予外源性EETs可以抑制2型糖尿病腎病大鼠腎臟組織中炎癥因子單核細胞趨化蛋白表達，降低尿白蛋白排泄率，減輕腎臟病理改變[5]。腎臟EETs濃度升高可通過阻斷核轉錄因子-κB的活化和減少腎臟巨噬細胞的浸潤來抑制腎臟微炎癥的進展[6]。本課題組前期臨床研究[7]顯示，編碼sEH的EPHX2基因rs751141多態(tài)性(R287Q)與DKD的發(fā)生有關，該多態(tài)性與DKD相關性的具體機制有待于進一步研究。本研究中采用外源基因過表達、重組表達質粒轉染等技術開展體外細胞實驗，探討EPHX2 rs751141基因多態(tài)性(G860A, R287Q)對sEH酶活性的影響及其分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

HK2細胞株(美國ATCC公司)；核酸提取試劑盒(德國QIAGEN公司)；EcoRⅠ限制性內切酶、XhoⅠ限制性內切酶(美國New England Biolab公司)；pcDNA3.1/V5-His真核表達載體(美國Invitrogen 公司)；pUC-T TA連接試劑盒(北京康為世紀生物科技有限公司)；11,12-EET(美國Cayman公司)；11,12-EET DHET免疫測定試劑盒(美國Detroit R&D公司)；sEH和β-actin單克隆抗體(美國Santa Cruz公司)；p-AKT單克隆抗體、AKT單克隆抗體、PI3K單克隆抗體(美國CST公司)、高保真酶2×Es Taq Master Mix(康為世紀)。

1.2 PCR擴增EPHX2基因

Trizol提取HK2細胞株總RNA，取3 μg RNA經反轉錄試劑盒反轉錄為cDNA。根據GeneBank中人EPHX2 mRNA CDS序列，以Oligo 7軟件設計引物，上游引物引入EcoRⅠ酶切位點，下游引物引入XhoⅠ酶切位點。以高保真酶2×Es Taq Master Mix(康為世紀)進行擴增EPHX2 cDNA片段。配制50 μL PCR反應體系：25 μL 2×Mix，上下游引物各2 μL(20 μmol/L)，cDNA 6 μL，無RNase水 15 μL。PCR反應條件：94 ℃ 預變性2 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸45 s，共32個循環(huán)，最后72 ℃10 min滅活Taq酶。

EPHX2 PCR擴增引物序列：正向引物為5′-GAATTCATGACGCTGCGCGCGGCCGT-3′；反向引物為5′-CTCGAGCATCTTTGAGACCACCGGTG -3′(EcoRⅠ酶切位點:GAATTC，XhoⅠ酶切位點:CTCGAG)。

1.3 合成點突變引物并誘導點突變

運用Primer premier 5.0設計軟件，以加州大學圣克魯茲分校UCSC Feb.2009(GRCh37/hg19)數(shù)據庫提供的EPHX2基因組序列為參照序列，R287Q點突變引物序列正向引物: 5′- TCTGGCCCAGGCAGGTTACCAGGTCCTAGCTATGGACATG-3′; 反向引物: 5′- CATGTCCATAGCTAGGACCTGGTAACCTGCCTGGGC- CAGA-3′。

1.4 EPHX2 DNA亞克隆至pcDNA3.1/V5-His A真核載體

將測序正確的質粒DNA與載體pcDNA3.1/V5-His A分別經EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切，T4連接酶連接后，重新轉化入DH5α感受態(tài)細胞，接種至LB固體培養(yǎng)基，同時接種載體自身連接作為陰性對照。37 ℃培養(yǎng)16 h后挑取單克隆菌，依次經擴增、提取、酶切鑒定、測序等步驟后，得到含有正確插入片段的重組質粒DNA。

1.5 細胞培養(yǎng)液中11,12-DHET含量測定

本實驗共設置3組:空質粒轉染組(NC)、突變型組(EPHX2/R287Q/pcDNA3.1/V5-His，R287Q)、野生型組(EPHX2/pcDNA3.1/V5-His，WT)。實驗結束前2 h加入11,12-EET，終濃度為1 μmol/L。終止實驗收集細胞培養(yǎng)上清。使用ELISA試劑盒檢測11,12-DHET濃度。

1.6 流式細胞儀檢測IL-17A和IL-1細胞因子濃度

標準品用前2 000 g離心10 s，加入250 μL稀釋液，混勻并冰浴10 min，取一個八聯(lián)管，標記1～8，將最高濃度標準品轉入1號管，其余每管加入120 μL 稀釋液，由1號管依次轉移60 μL到下一管混勻，到7號管，8號管不加為本底，完成梯度稀釋。獲取模板的建立，打開一個新程序，建立散點圖及柱狀圖。運行檢測程序樣品的檢測結果分析。

1.7 實時定量PCR法檢測轉染重組質粒后相關指標IL-17A和IL-1表達變化

配置總體積為25 μL/管的PCR反應體系如下：UltraSYBR Mixture(含ROXⅠ) 12.5 μL；上游引物： 1 μL(10 μmol/L)；下游引物：1 μL(10 μmol/L)；cDNA模板 2 μL(10 ng)；無RNase水 8.5 μL。反應條件：95 ℃預變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火/延伸1 min，共計40個循環(huán)，融解曲線95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s。引物序列詳見表1。

表1 Real-time PCR引物序列

1.8 Western blotting檢測細胞轉染重組質粒后相關指標變化

提取R287Q組、WT組、NC組蛋白，BCA法測定蛋白濃度，蛋白上樣量40 μg,經凝膠配置、上樣電泳、轉膜、5%(質量分數(shù))脫脂奶粉封閉1 h，分別加入p-AKT、AKT、PI3K、β-actin抗體4 ℃孵育過夜，TBST洗膜后，滴加HRP標記羊抗鼠/兔 IgG室溫孵育1 h。使用凝膠攝像儀器曝光信號檢測， Image J 1.43軟件進行灰度值分析測量，將相應目的蛋白與內參蛋白(β-actin)灰度值比值作為目的蛋白的相對表達量。

1.9 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 構建EPHX2 WT、R287Q突變型重組表達質粒

EPHX2 WT、R287Q突變型重組表達質粒和空載體轉染至HK2細胞后48 h收集細胞進行實驗。用Western blotting方法檢測融合蛋白的表達(圖1)，sEH蛋白的相對分子質量為62 500。該結果表明WT、R287Q突變型重組表達質粒構建成功。

圖1 構建的重組表達質粒及空載體轉染后sEH蛋白表達情況Fig.1 Expression of sEH protein after transfection with recombinant plasmid and empty vector1: wild type; 2: R287Q mutant; 3: empty vector; sEH: soluble epoxide hydrolase.

2.2 R287Q突變型重組質粒對HK2細胞培養(yǎng)上清11,12-DHET濃度的影響

將WT組、R287Q組、NC組轉染HK2細胞，并在細胞培養(yǎng)液中加入1 μmol/L 11,12-EET后，細胞培養(yǎng)上清中11,12-DHET的量顯著上調，表明轉染進入細胞的EPHX2重組質粒成功在細胞內表達，并且具有較強的水解酶活性。R287Q組水解11,12-EET活性明顯低于野生型WT(P<0.01)，詳見圖2。

圖2 WT組、R287Q組重組表達質粒和NC組轉染HK2細胞后，給予11，12-EET細胞培養(yǎng)上清中11,12-DHET濃度Fig.2 Concentration of 11,12-DHET in the supernatant of HK2 cells transfected with the recombinant expression plasmids of WT, R287Q and NC was measuredn=3; 11,12-EET: 11,12-epoxyeicosatrienoic acid; 11,12-DHET: 11,12-dihydroxyeicosatrienoic acid; WT：EPHX2/pcDNA3.1/V5-His; R287Q：EPHX2/R287Q/pcDNA3.1/V5-His; NC:pcDNA3.1/V5-His.

2.3 R287Q突變型重組質粒對HK2細胞上清炎癥因子濃度的影響

2.3.1 R287Q突變型重組質粒對HK2細胞上清IL-17A濃度的影響

如圖3所示，突變型R287Q組細胞上清IL-17A濃度低于WT組(P<0.05)，未干預的WT組IL-17A濃度為34.61 pg/mL，突變型R287Q組IL-17A濃度為24.13 pg/mL，NC組IL-17A濃度為29.00 pg/mL。

圖3 突變型R287Q重組質粒對HK2細胞IL-17A濃度以及外源性11,12-EET干預對其影響Fig.3 Effect of mutant R287Q recombinant plasmid on the level of IL-17A and exogenous 11,12-EET intervention in HK2 cellsn=3，*P<0.05; IL: interleukin； 11,12-EET: 11,12-epoxyeicosatrienoic acid;WT：EPHX2/pcDNA3.1/V5-His;R287Q：EPHX2/R287Q/pcDNA3.1/V5-His;NC:pcDNA3.1/V5-His.

加入11,12-EET干預后，11,12-EET可以使WT組IL-17A濃度降低為30.56 pg/mL，低于未加11,12-EET 的WT野生型組(P<0.05)，高于加入11,12-EET 突變型R287Q組IL-17A濃度(26.90 pg/mL)(P<0.05)，NC組IL-17A濃度降低為27.99 pg/mL。

2.3.2 R287Q突變型重組質粒對HK2細胞上清IL-1濃度的影響

如圖4所示，突變型R287Q組細胞上清IL-1濃度低于WT組(P<0.05)，未干預的WT野生型IL-1濃度為0.70 pg/mL，突變型R287Q組 IL-1濃度為0.55 pg/mL， NC組IL-1濃度為0.70 pg/mL。

圖4 突變型R287Q組重組質粒對HK2細胞IL-1濃度以及外源性11,12-EET干預對其影響Fig.4 Effect of mutant R287Q recombinant plasmid on the level of IL-1 and exogenous 11,12-EET intervention in HK2 cells n=3, *P<0.05; IL: interleukin; 11,12-EET: 11,12-epoxyeicosatrienoic acid;WT：EPHX2/pcDNA3.1/V5-His;R287Q：EPHX2/R287Q/pcDNA3.1/V5-His;NC:pcDNA3.1/V5-His.

加入11,12-EET干預后，11,12-EET可以使WT野生型IL-1濃度降低為0.60 pg/mL，低于未加11,12-EET 的WT組，但差異無統(tǒng)計學意義(P=0.15)；高于加入11,12-EET的突變型R287Q 組IL-1(0.57 pg/mL)，但差異也無統(tǒng)計學意義(P=0.52)，NC組IL-1濃度為0.65 pg/mL。

2.4 R287Q突變型重組質粒對HK2細胞IL-17A和IL-1β mRNA水平的影響

2.4.1 R287Q突變型重組質粒對HK2細胞IL-17A mRNA表達的影響

如圖5所示，突變型R287Q組相對于WT組HK2細胞IL-17A mRNA表達明顯降低(P<0.01)。加入11,12-EET干預后，WT組低于未加11,12-EET 的WT組(P<0.05)，高于加入11,12-EET的突變型R287Q組(P<0.05)。

圖5 R287Q突變型重組質粒對HK2細胞株IL-17A mRNA表達的影響以及外源性11,12-EET干預后對其影響Fig.5 Effect of mutant R287Q recombinant plasmid on the expression level of IL-17A mRNA in HK2 cell line and after exogenous 11,12-EET intervention n=3, *P<0.05, **P<0.01； IL-17A: interleukin-17A;11,12-EET: 11,12-epoxyeicosatrienoic acid；WT：EPHX2/pcDNA3.1/V5-His;R287Q：EPHX2/R287Q/pcDNA3.1/V5-His;NC:pcDNA3.1/V5-His.

2.4.2 R287Q突變型重組質粒對HK2細胞IL-1β mRNA表達的影響

如圖6所示，突變型R287Q組相對于WT組HK2細胞IL-1β mRNA表達明顯降低(P<0.01)。WT組低于未加11,12-EET 的WT組，但差異無統(tǒng)計學意義(P=0.24)，高于加入11,12-EET的突變型R287Q組(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義。

圖6 R287Q突變型重組質粒對HK2細胞株IL-1β mRNA表達的影響以及外源性11,12-EET干預后對其影響Fig.6 Effect of mutant R287Q recombinant plasmid on the expression level of IL-1β mRNA in HK2 cell line and after exogenous 11,12-EET intervention n=3, *P<0.05, **P<0.01； IL-1β: interleukin-1β; 11,12-EET: 11,12-epoxyeicosatrienoic acid；WT：EPHX2/pcDNA3.1/V5-His;R287Q：EPHX2/R287Q/pcDNA3.1/V5-His;NC:pcDNA3.1/V5-His.

2.5 R287Q突變型重組質粒對HK2細胞p-AKT/AKT蛋白表達的影響

R287Q突變型相對于WT型HK2細胞p-AKT/AKT表達明顯降低(P<0.05)。加入11,12-EET干預后，WT型低于未加11,12-EET 的WT型組(P<0.01)，高于加入11,12-EET的R287Q突變型(P<0.05)，詳見圖7。

圖7 R287Q突變型重組質粒對HK2細胞株p-AKT/AKT蛋白表達的影響以及外源性11,12-EET干預后對其影響Fig.7 Effect of mutant R287Q recombinant plasmid on the expression of p-AKT/AKT protein in HK2 cell line and after exogenous 11,12-EET intervention A: Western blotting; B: data analysis; n=3,*P<0.05, **P<0.01; 11,12-EET: 11,12-epoxyeicosatrienoic acid；WT：EPHX2/pcDNA3.1/V5-His;R287Q：EPHX2/R287Q/pcDNA3.1/V5-His;NC:pcDNA3.1/V5-His.

2.6 R287Q突變型重組質粒對HK2細胞PI3K蛋白表達的影響

R287Q突變型相對于WT型HK2細胞PI3K/β-actin表達明顯降低(P<0.05)。加入11,12-EET干預后，WT型高于未加11,12-EET 的WT型組，但差異無統(tǒng)計學意義(P=0.37)，低于加入11,12-EET的R287Q突變型(P<0.01)差異有統(tǒng)計學意義，詳見圖8。

圖8 R287Q突變型重組質粒對HK2細胞株PI3K表達的影響以及外源性11,12-EET干預后對其影響Fig.8 Effect of mutant R287Q recombinant plasmid on the expression level of PI3K in HK2 cells and the effect of exogenous 11,12-EET intervention A: Western blotting; B: data analysis; n=3, *P<0.05, **P<0.01; 11,12-EET: 11,12-epoxyeicosatrienoic acid；WT：EPHX2/pcDNA3.1/V5-His;R287Q：EPHX2/R287Q/pcDNA3.1/V5-His;NC:pcDNA3.1/V5-His.

3 討論

1973年Gill等[8]在研究類似昆蟲保幼激素萜類環(huán)氧化物的代謝時發(fā)現(xiàn)sEH，因其主要位于細胞的可溶性成分如細胞質和過氧化酶體中而命名，主要分布于細胞質及過氧化物酶體中，在肝臟、腎臟、內皮細胞、胰島和心肌細胞中表達最為豐富。sEH以同源二聚體的形式存在，具有氨基端和羧基端兩個活性結構域，羧基端具有氧化水解的活性，而氨基端可能與sEH穩(wěn)定性有關，具有磷酸酶活性。sEH須以二聚體的形式發(fā)揮其生物活性[9]，該二聚體的三維結構模式圖提示，兩個羧基末端相互靠近，氨基末端之間不直接接觸而是與相應的羧基末端聯(lián)系，空間結構的破壞將導致其功能的喪失。

人類sEH編碼基因EPHX2有19個外顯子的長約45 kb，定位在8p21-p12[10]。Sandberg等[11]于2000年首次在25例肝臟組織中發(fā)現(xiàn)4例EPHX2基因cDNA序列860位堿基G突變?yōu)锳(c.860G>A)，相對應的氨基酸由精氨酸變?yōu)楣劝滨０?R287Q)，并進一步應用t-SO(trans -[3H ]stilbene oxide)作為底物對該突變酶活性研究發(fā)現(xiàn)R287Q突變型酶活性明顯低于野生型。

本研究中，本課題組首先構建了sEH野生型和R287Q突變型表達質粒，將其在HK2細胞株中過表達，在實驗結束前2 h加入11,12-EET，終濃度1 μmol/L，通過檢測其代謝產物11,12-DHET，可以反映sEH不同突變類型代謝11,12-EET的能力，另一方面也間接反映不同突變類型sEH水解酶活性。研究結果顯示，R287Q重組質粒水解11,12-EET的酶活性在所有構建的重組質粒中最低，并且明顯低于野生型，這與之前的研究[9]較一致。R287Q不位于催化活性中心，表明sEH的催化作用并不能用簡單的催化活性中心與底物相互作用來解釋。Nelson等[9]sEH二聚體的研究顯示，R287Q多態(tài)性與野生型相比并不改變二聚體結構狀態(tài)，但是卻呈現(xiàn)不穩(wěn)定的二聚體狀態(tài)，導致其水解能力降低，所以sEH二聚體結構狀態(tài)對其水解活性具有非常重要的作用。

本研究的細胞實驗結果顯示，通過野生型和突變型外源基因過表達，在IL-1、IL17A等炎癥因子水平上，R287Q突變型低于野生型，說明R287Q突變型具有減緩炎癥作用。在mRNA水平表達上，R287Q突變型也能夠降低炎癥因子的表達。

蛋白激酶B(protein kinase B, PKB/Akt)是一種絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白激酶，在葡萄糖代謝，細胞凋亡、存活、增殖以及細胞骨架的變化等活動中發(fā)揮重要的生物學功能。Akt廣泛表達于體內各種組織，磷酸化的蛋白激酶B(p-Akt)是其活性形式。之前的研究[12]證實，在糖尿病大鼠中，胰島素樣生長因子刺激Akt的磷酸化，導致Akt通路的激活。而磷酸化的Akt能夠激活IκB激酶，使IκB與核轉錄因子-κB形成具有活性的核轉錄因子-κB p65亞基，使得其進入細胞核，促進相關炎癥因子的轉錄，從而導致炎癥反應的發(fā)生[13]。而在本研究中，R287Q突變型相對于野生型p-Akt/Akt明顯降低，說明R287Q突變型可以通過下調p-Akt減緩炎癥。

當加入過量外源11,12-EET時，野生型炎性指標水平差距變小，但仍高于加入過量外源11,12-EET的R287Q突變型，說明野生型與R287Q之間差距部分可以被外源11,12-EET減弱，但并沒有完全消除，這可能與sEH還代謝其他炎癥相關活性物質有關，相關研究[14]也顯示與EETs相比，新發(fā)現(xiàn)的sEH的底物EEQs具有更強的抗炎作用，因此R287Q減緩炎癥的具體機制尚有待于進一步研究。

本研究首次構建了R287Q突變型重組表達質粒對該突變型酶活性進行了研究，與國外其他研究[8]該酶活性的方法不同，但結論一致。并通過外源基因過表達的方法證實了該酶點突變可以影響炎癥水平及相關信號通路，為R287Q多態(tài)性的臨床應用奠定了實驗基礎。