陳岐，余江毅

（南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029）

隨著人們生活水平的不斷提高，膳食結(jié)構(gòu)也發(fā)生著巨大改變，糖分和脂肪的攝入越來(lái)越多，再加上人們生活作息規(guī)律的紊亂，糖尿病以及肥胖的患病率也在不斷增加。胰島素抵抗（Insulin resistance，IR）是指胰島素在周圍組織攝取和清除葡萄糖的能力低下，主要臨床表現(xiàn)為皮膚病理性損傷以及餐前低血糖［1］。實(shí)驗(yàn)研究表明，糖尿病、肥胖、代謝綜合征等疾病的重要病理基礎(chǔ)與胰島素抵抗有著密切的關(guān)系，同時(shí)也是其發(fā)病的危險(xiǎn)因素，另外也有研究表明，胰島素抵抗會(huì)造成腎臟損害，并且伴隨著一定的腎功能減退［1－3］。根據(jù)其臨床表現(xiàn)，胰島素抵抗可歸屬于消渴病的范疇，究其發(fā)病機(jī)制，主要是陰虛為本，燥熱為標(biāo)［4］。芪葵顆粒是江蘇省中醫(yī)院自制中成藥，具有養(yǎng)陰益氣、清熱除濕之功效。本實(shí)驗(yàn)主要從氧化應(yīng)激的角度探討芪葵顆粒對(duì)胰島素抵抗豚鼠腎臟保護(hù)作用，以期為臨床治療提供一定的參考。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雌性豚鼠40 只，體質(zhì)量180～200 g，SPF 級(jí)，由南京江寧區(qū)青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng)提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（蘇）2017－0011。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度（26 ±2）℃，濕度50%左右。

1.2 分組、造模及給藥

將40 只雌性豚鼠隨機(jī)分為空白組、高脂組、12H組、24H 組和芪葵顆粒組，每組各8 只。將豚鼠進(jìn)行分籠飼養(yǎng)，4 只豚鼠為一籠。其中，空白組給予普通飼料喂養(yǎng)，其余各組全部給予高脂飼料喂養(yǎng)。空白組、高脂組接受全天候正常的自然光照射，實(shí)驗(yàn)條件要嚴(yán)格堅(jiān)守，避免其他人工光源造成影響。12H 組、24H 組、芪葵顆粒組則被放置于光控箱中進(jìn)行飼養(yǎng)，選取鹵素?zé)糇鳛槿斯す庠础?2H組給予12 h光照/12 h黑暗節(jié)律交替照射，采用光控箱中的控制器控制光照節(jié)律，每天自6時(shí)起開始照射，至18時(shí)自動(dòng)切斷電源，進(jìn)入12 h黑暗階段，周而復(fù)始；24H 組、芪葵顆粒組則給予24 h 光照照射。所有的光經(jīng)檢測(cè)，照度大約為500 Lux。造模時(shí)長(zhǎng)為6周。從第7周開始，芪葵顆粒組豚鼠給予芪葵顆粒治療，連續(xù)給藥4周，其余各組均保持原條件飼養(yǎng)。

藥物制備：芪葵顆粒（江蘇省中醫(yī)院制，蘇藥制字Z20130002，10 g/袋。藥物組成：生黃芪、黃蜀葵花、制何首烏），每只豚鼠需要灌胃5～6 mL 芪葵顆?；旌先芤骸?/p>

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 空腹血糖（Fasting blood glucose，F(xiàn)BG）水平

末次給藥結(jié)束后，豚鼠禁食12 h，運(yùn)用背中足靜脈采血法采血約0.5 mL，而后用魚躍牌一次性血糖試紙檢測(cè)相應(yīng)的FBG值。

1.3.2 血清各項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定

按照ELISA 試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，測(cè)定豚鼠血清中SCR、BUN、CRP 含量及空腹胰島素（Fasting serum lisulin，F(xiàn)INS）的表達(dá)水平。

1.3.3 胰島素抵抗（HOMA－IR）值

根據(jù)公式計(jì)算出各組豚鼠HOMA－IR值。

胰島素抵抗（HOMA－IR）值 = 空腹血糖水平 ×空腹胰島素水平/22.5

1.3.4 氧化應(yīng)激指標(biāo)測(cè)定

按照ELISA 試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，測(cè)定豚鼠腎臟組織中MDA及SOD的表達(dá)。

1.3.5 HE染色檢測(cè)豚鼠腎臟組織病理學(xué)變化

取豚鼠腎臟組織，HE染色法檢測(cè)其病理學(xué)變化。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)所得的數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 8.0.2 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用單因素方差法（One－way analysis of variance，One－way ANOVA）進(jìn)行分析，P＜0.05 代表差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組豚鼠FBG、FINS及HOMA－IR值比較

在計(jì)算HOMA－IR 值時(shí)，24H 組的HOMA－IR 值明顯高于其他組，說(shuō)明本次實(shí)驗(yàn)胰島素抵抗豚鼠模型構(gòu)建成功。各組豚鼠的FBG、FINS 及HOMA－IR 值水平經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)，高脂組高于空白組，12H 組高于高脂組，24H組顯著高于12H組（P＜0.05）；與24H組比較，芪葵顆粒組豚鼠經(jīng)治療后，各項(xiàng)指標(biāo)均明顯改善，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組豚鼠FBG、FINS及HOMA－IR值比較（±s）

表1 各組豚鼠FBG、FINS及HOMA－IR值比較（±s）

注：與12H組比較，#P ＜0.05；與24H組比較，*P ＜0.05。

組別空白組高脂組12H組24H組芪葵顆粒組HOMA－IR 2.2±0.1 2.7±0.3 3.1±0.3 4.0±0.5#3.0±0.3*n8 8 8 8 8 FBG（mmol/L）6.0±0.3 6.6±0.2 7.1±0.3 7.9±0.3#7.1±0.4*FINS（mIU/L）8.0±0.4 9.3±1.1 9.9±0.6 11.4±1.4#9.5±0.9*

2.2 各組豚鼠血清中BUN、SCR及CRP水平比較

與12H 組豚鼠相比，24H 組豚鼠血清SCR、BUN 及CRP 水平明顯升高（P＜0.05），表明24H 組豚鼠腎功能下降，腎損傷及炎癥反應(yīng)明顯。而與24H組比較，芪葵顆粒組豚鼠經(jīng)治療后，血清SCR、BUN 及CRP 水平明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組豚鼠BUN、SCR及CRP水平比較（±s）

表2 各組豚鼠BUN、SCR及CRP水平比較（±s）

注：與12H組比較，#P ＜0.05；與24H組比較，*P ＜0.05。

組別空白組高脂組12H組24H組芪葵顆粒組CRP（μg/L）158.2±12.1 165.9±15.1 176.0±10.6 90.0±13.8#161.3±6.9*n8 8 8 8 8 SCR（pmol/L）42.53±3.55 45.53±2.29 46.38±2.91 50.55±1.75#43.38±2.71*BUN（μmol/L）1137±95 1251±60 1272±56 1380±52#1212±59*

2.3 各組豚鼠腎臟組織SOD及MDA水平比較

與12H 組比較，24H 組豚鼠腎臟組織中MDA 水平明顯升高，SOD 水平明顯下降（P＜0.05）。而與24H組比較，芪葵顆粒組豚鼠經(jīng)治療后，腎組織MDA 水平明顯下降，SOD 水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 各組豚鼠腎組織氧化應(yīng)激水平比較（±s）

表3 各組豚鼠腎組織氧化應(yīng)激水平比較（±s）

注：與12H組比較，#P ＜0.05；與24H組比較，*P ＜0.05。

組別空白組高脂組12H組24H組芪葵顆粒組MDA（nmol/L）12.95±1.41 13.54±1.64 14.34±1.20 16.37±0.21#13.29±0.61*n8 8 8 8 8 SOD（U/mL）7.13±0.16 5.91±1.01 5.16±1.01 3.83±0.19#6.21±0.74*

2.4 各組豚鼠腎臟組織HE染色比較

空白組豚鼠腎臟組織結(jié)構(gòu)清晰，腎小球體積正常，厚薄均勻，腎組織未見(jiàn)明顯異常；高脂組豚鼠腎小球體積增加，腎小管管壁細(xì)胞體積增大，管腔變窄；12H 組豚鼠腎組織可見(jiàn)系膜細(xì)胞及系膜基質(zhì)細(xì)胞增生，腎球囊變窄，腎小管管腔變小，管壁增厚；與12H 組相比，24H 組豚鼠腎組織除腎小球體積增大、系膜細(xì)胞及系膜基質(zhì)細(xì)胞增生、腎球囊變窄、腎小管管腔變小、管壁增厚之外，管壁還可見(jiàn)顯著空泡變性；而芪葵顆粒組經(jīng)治療后，腎臟結(jié)構(gòu)明顯改善，只見(jiàn)腎小管細(xì)胞略腫脹，腎小管形態(tài)未見(jiàn)明顯異常。見(jiàn)圖1。

圖1 各組豚鼠腎臟HE染色圖（×400）

3 討論

豚鼠又名天竺鼠，常被作為研究心臟病、動(dòng)脈粥樣硬化、關(guān)節(jié)炎、免疫疾病以及藥物研發(fā)的模型［5－6］。豚鼠具有十分敏銳的視覺(jué)系統(tǒng)，作為嚙齒類動(dòng)物，豚鼠的視錐細(xì)胞十分豐富，占光感受器的8%～17%［7］。同時(shí)，豚鼠對(duì)高脂食物的反應(yīng)與人類極為相似，飼料中加入少量的膽固醇（最低可達(dá)0.04%）即可形成較為明顯的高膽固醇血癥，尤其血漿LDL－C 升高變化最為顯著，這種較低劑量膽固醇攝入形成的高脂血癥與人類高脂血癥患者的日常膳食膽固醇攝入量相當(dāng)［8］。不僅如此，豚鼠對(duì)高脂飲食比一般大鼠、小鼠更為敏感［9］，因此，用高脂飼料喂養(yǎng)豚鼠構(gòu)建模型比一般的SD大鼠時(shí)間短，而且豚鼠體型較大，取材也更加方便。因此，本次研究選取豚鼠作為建立胰島素抵抗的動(dòng)物模型。

氧化應(yīng)激（Oxidative stress，OS）是指機(jī)體在遭受內(nèi)外環(huán)境的刺激后，活性氧簇（Reactive oxygen species，ROS）和其類似物產(chǎn)生過(guò)多，從而導(dǎo)致機(jī)體氧化系統(tǒng)與抗氧化系統(tǒng)之間的嚴(yán)重失衡，最終導(dǎo)致機(jī)體的損傷［10－11］。機(jī)體在高血糖狀態(tài)下可通過(guò)兩種途徑誘導(dǎo)氧化應(yīng)激：一是高血糖誘導(dǎo)自身氧化，這是體內(nèi)ROS增多的主要原因；二是誘導(dǎo)體內(nèi)抗氧化酶糖基化［12］，導(dǎo)致體內(nèi)抗氧化酶活性降低或消失。氧化應(yīng)激可減少血管內(nèi)皮舒張因子的生成以及生物利用度，引發(fā)腎小球血管內(nèi)皮功能受損，加速腎小球硬化，此外還可促進(jìn)糖化產(chǎn)物的生成，造成腎小球結(jié)節(jié)性病變［13］。另一方面，腎臟是一個(gè)高度代謝的器官，在線粒體中富含氧化反應(yīng)，這也使得它容易受到氧化應(yīng)激造成的損害，一些研究也證明了氧化應(yīng)激可以加速腎臟疾病的進(jìn)展［14－15］。SOD為抗氧化系統(tǒng)的重要一員，可清除氧自由基，阻斷其對(duì)機(jī)體造成的損害，通常認(rèn)為SOD 水平可以代表機(jī)體的抗氧化水平［16］。MDA是ROS與生物膜脂質(zhì)中多聚飽和脂肪酸發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)，由脂質(zhì)過(guò)氧化物分解而成的［17］，因此常用MDA 與SOD 水平來(lái)評(píng)價(jià)機(jī)體抗氧化應(yīng)激的能力。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，芪葵顆?？擅黠@改善豚鼠胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)，改善腎臟損傷癥狀，降低血清BUN、SCR 及CRP 水平，降低腎組織中MDA 水平，上調(diào)SOD水平。由此可見(jiàn)，芪葵顆粒具有明顯的改善腎臟損傷、抗炎和抗氧化的作用，能通過(guò)調(diào)控氧化應(yīng)激反應(yīng)對(duì)胰島素抵抗豚鼠的腎臟起到保護(hù)作用。