李歡歡，周鑫，王秋月，于芳芳，王榮，李文雍，張迪

（阜陽師范大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院，安徽 阜陽 236037）

過量飲酒會(huì)導(dǎo)致酒精中毒、酒精依賴及相關(guān)疾病的發(fā)生，并對機(jī)體的各個(gè)系統(tǒng)產(chǎn)生損傷作用。此外，酒精還具有較強(qiáng)的致畸作用，可使發(fā)育中胚胎的神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生凋亡，是導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生缺陷的重要因素之一[1]。隨著近年來孕產(chǎn)期婦女飲酒比例的升高，胎兒罹患胎兒酒精綜合征（FAS）的比例不斷增加，并導(dǎo)致不可逆的胎兒生長發(fā)育損害，表現(xiàn)為一系列病理、生理、行為和智力缺陷，這些缺陷被歸類為“胎兒酒精譜系異常疾病”（FASD）[2-3]。

酒精在人體內(nèi)在乙醇脫氫酶和乙醛脫氫酶的催化下氧化脫氫并產(chǎn)生大量的氧化應(yīng)激物，升高細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平并參與細(xì)胞癌變[4-5]。而妊娠期的氧化應(yīng)激水平升高還會(huì)導(dǎo)致胎兒的表觀遺傳發(fā)生改變，影響胎兒的生長發(fā)育[6]。此外，酒精可以通過母胎屏障直接進(jìn)入子宮及胎兒體內(nèi)，由于胎兒體內(nèi)缺少乙醇脫氫酶，導(dǎo)致酒精在胎兒體內(nèi)富集，對胎兒造成直接的損傷。研究表明，酒精對胎兒的損傷作用具有時(shí)間和劑量依賴性[7-8]，由于酒精在日常生活中被廣泛應(yīng)用，尤其增加了早期胚胎接觸酒精的風(fēng)險(xiǎn)，從而引起嚴(yán)重的后果，包括早期胚胎發(fā)育顯著受到抑制和基因組甲基化的改變[9]。胚胎著床是胎生哺乳類動(dòng)物的胚泡和母體子宮壁結(jié)合，建立母子間聯(lián)系并進(jìn)行物質(zhì)交換的過程。在前期研究中也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)酒精暴露會(huì)顯著影響胚胎的植入[10]。因此，為研究早期胚胎的酒精暴露對胚胎植入的影響，本研究采用體外受精的方法獲得胚胎，在胚胎培養(yǎng)液中添加酒精，采用體外培養(yǎng)的方式建立小鼠早期胚胎酒精暴露模型。通過免疫熒光技術(shù)對囊胚期胚胎的譜系分化進(jìn)行檢測；以及胚胎移植技術(shù)對13.5 d 的胎兒和胎盤的生理病理狀態(tài)進(jìn)行分析，來評價(jià)早期胚胎酒精暴露對胚胎著床后的發(fā)育的的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用SPF 級的8 周齡以上昆明白雌性小鼠和8～10 周齡ICR 雄性小鼠，購自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。保持12 小時(shí)光周期調(diào)控，溫度控制在22～26℃，相對濕度60%～70%。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

實(shí)驗(yàn)中主要試劑有：小鼠胚胎體外培養(yǎng)液（KSOM，美國Sigma 公司），小鼠胚胎操作液（M2，美國Sigma 公司），小鼠胚胎獲能夜（HTF，美國Sigma 公司），Cdx2、Oct4 一抗（Abcam 公司），山羊抗鼠二抗（Abcam 公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)備和儀器

實(shí)驗(yàn)中主要的實(shí)驗(yàn)儀器和設(shè)備有：體式顯微鏡（日本尼康，SMZ745T），三氣培養(yǎng)箱（Themo，3141），激光掃描共聚焦顯微鏡（德國Leica，TCS SP5Ⅱ），超凈工作臺（蘇州凈化，SW-CJ-2E）等。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 體外胚胎的獲得

選取8-10 周齡性昆明白雌鼠，腹腔注射10 IU 的PMSG，48 小時(shí)后腹腔注射10IU 的HCG 進(jìn)行超數(shù)排卵，12 小時(shí)后采用頸椎脫臼法處死雌鼠，取其輸卵管，在體式顯微鏡下用眼科鑷撕開膨大的壺腹部獲得成熟的MⅡ卵母細(xì)胞，將其置于孵育了4-6 小時(shí)的小鼠HTF 獲能液中獲能。半小時(shí)后采用頸椎脫臼法處死正常交配一周內(nèi)的雄鼠，取附睪尾放入HTF 中，在附睪尾中段剪開，使精子流出并在HTF 中獲能，卵子獲能1 小時(shí)后，加入60-70μL 獲能后的精子懸液，在5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4-6 小時(shí)后挑出有雙原核的受精卵進(jìn)行培養(yǎng)。

1.4.2 胚胎培養(yǎng)

將具有雙原核的受精卵分別移至對照組和1.0%酒精組的胚胎培養(yǎng)液中，其中，對照組即為未添加無水乙醇的正常1mL KSOM 培養(yǎng)液；1.0%酒精組即為吸取10 μL 無水乙醇加入到990 μL 正常KSOM 培養(yǎng)液中并吹打均勻后的胚胎培養(yǎng)液，并在5%CO2，37℃的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至囊胚，觀察兩組胚胎在各個(gè)時(shí)期的發(fā)育情況并做好統(tǒng)計(jì)。

1.4.3 假孕鼠準(zhǔn)備

進(jìn)行IVF 實(shí)驗(yàn)的當(dāng)天，選取健康且處于發(fā)情期狀態(tài)的性成熟昆明白雌性小鼠與輸精管切除的雄性小鼠進(jìn)行交配，并于12 小時(shí)后檢查雌鼠陰道栓，見栓的雌鼠作為假孕鼠進(jìn)行標(biāo)記備用。

1.4.4 胚胎移植

根據(jù)假孕鼠體重注射麻醉藥（10-15 μL/g），夾腳趾測試麻醉度，待深度麻醉后，找到其子宮所在位置，剪去毛發(fā)，酒精棉球消毒后，剪開皮肉，拉出卵巢和子宮，在子宮角處用移卵針將胚胎移入，每側(cè)子宮各10 枚胚胎，縫合傷口并消毒，禁水禁食24 小時(shí)觀察其生理狀態(tài)。

1.4.5 免疫熒光

每組選取20 枚形態(tài)相似囊胚，在4%多聚甲醛中室溫固定30 min 以上，0.1%PVA 洗去殘留多聚甲醛，然后用0.5%的TritonX-100 室溫通透30min，0.1% PVA 洗去殘留溶液后在2% BSA 中室溫封閉2 小時(shí)，直接轉(zhuǎn)移至Cdx2 和Oct4 的一抗混合液（1∶200，封閉液稀釋）中，4℃孵育過夜（12-16h），然后用0.1% PVA 清洗3 次，每次5 min，之后轉(zhuǎn)移至二抗混合液（1∶500，封閉液稀釋）中，37℃孵育1 小時(shí)，1% PVA 清洗3 次，每次5 min，Hoechest33342（1∶200，0.1%PVA 稀釋）室溫染核10 min，最后用0.1%PVA 清洗6 次洗去多余染料，將胚胎轉(zhuǎn)移至含有抗熒光淬滅劑的載玻片上進(jìn)行壓片，使用共聚焦顯微鏡來獲得輕微壓縮的囊胚中每個(gè)熒光團(tuán)的圖像，其中Hoechst33342激發(fā)波長為405 nm，Cdx2 激發(fā)波長為647 nm，Oct4 激發(fā)波長為488 nm，通過掃描染色后的囊胚調(diào)整到飽和熒光強(qiáng)度，同時(shí)保持參數(shù)：像素值102 4x1 024，物鏡40x，line3，frame1，Zoom Factor2-3，在同一參數(shù)下獲取不同組別染色后的圖片，使用Image Pro-Plus6.0 及SPASS 軟件進(jìn)行熒光強(qiáng)度分析。

1.4.6 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS16.0 對各期胚胎形成率差異進(jìn)行分析，單因素方差分析，p＜0.05，差異顯著；p＜0.01，差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 E13.5 胚胎發(fā)育情況

在假孕母鼠子宮兩側(cè)分別移植10 枚正常組與1.0%酒精組囊胚，避免小鼠后代數(shù)量不因移植囊胚數(shù)量不同而產(chǎn)生顯著性差異。胚胎移植后第10 天剖取胎盤及胎兒，與正常組相比，酒精暴露的早期胚胎移植后難以發(fā)育為成型的胎兒和胎盤（圖1），對兩組胚胎移植后的成型胎兒獲得率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析（圖2 A B）發(fā)現(xiàn)，相較于正常組，植入前酒精處理的胚胎的植入率顯著降低（p＜0.01）,胎兒獲得率也顯著降低（p＜0.01）。接下來對所得兩組胎兒和胎盤進(jìn)行稱重統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示（圖2 C），與正常組相比，酒精組的胎兒體重顯著降低（p＜0.01）；隨后根據(jù)胎盤形態(tài)和質(zhì)量對所得胎盤進(jìn)行分類，其中形態(tài)較好、質(zhì)量大于0.9 g 的胎盤記為Ⅰ類胎盤，形態(tài)一般、質(zhì)量小于0.9 g 的胎盤記為Ⅱ類胎盤，在Ⅰ類胎盤中，酒精組胎盤質(zhì)量顯著低于正常組（p＜0.01）,在Ⅱ類胎盤中，兩組的胎盤質(zhì)量無顯著差異，酒精組的Ⅱ類胎盤數(shù)量明顯多于正常組。由此說明植入前胚胎的短期酒精暴露會(huì)影響胚胎植入后的生長發(fā)育，對其造成損傷。

圖1 正常組與1.0%酒精組E13.5 解剖觀察。A.子宮解剖圖,B.胎兒胎盤解剖圖,C.胎盤解剖圖。

2.2 囊胚分化檢測

胚胎細(xì)胞命運(yùn)決定和分化是胚胎發(fā)育的基礎(chǔ),其調(diào)控機(jī)制是發(fā)育生物學(xué)重要的研究領(lǐng)域。內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（Inner cell mass,ICM）和滋養(yǎng)層（Trophectoderm,TE）的形成是哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育命運(yùn)決定的關(guān)鍵。在小鼠早期胚胎發(fā)育過程中，Cdx2 是TE細(xì)胞的標(biāo)記基因之一，在TE 形成過程中，Cdx2 是TE 發(fā)育所必需的同源盒轉(zhuǎn)錄因子，Cdx2 敲除胚胎因?yàn)闊o法形成成熟的TE 導(dǎo)致植入失敗，而滋養(yǎng)層的缺失則會(huì)導(dǎo)致胚胎無法擴(kuò)大成腔[11]；Oct4 是內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的標(biāo)記基因，也是維持胚胎干細(xì)胞多能性的關(guān)鍵因子，在沒有Oct4 存在的情況下胚胎無法形成ICM,桑葚胚內(nèi)部細(xì)胞被驅(qū)動(dòng)進(jìn)入滋養(yǎng)層細(xì)胞分化。Cdx2 和Oct4 在譜系分化的角色扮演中維持相對地表達(dá)平衡，是維持ICM 和ES 所必需的[12]。我們通過檢測Cdx2 和Oct4 在囊胚期細(xì)胞中的表達(dá)來評價(jià)酒精暴露對小鼠早期胚胎發(fā)育和胚層分化的影響。

圖2.E13.5 解剖結(jié)果統(tǒng)計(jì)。A.胚胎植入率，B.胚胎植入后獲得胎兒比率，C.13.5d 胎兒稱重，D.13.5dⅠ類、Ⅱ類胎盤稱重。使用單向ANOVA 檢驗(yàn)分析組間差異。其中，*表示p＜0.05,差異顯著；**表示p＜0.01，差異極顯著。誤差線顯示標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）。

圖3 正常組，1.0%酒精組囊胚細(xì)胞免疫熒光染色圖

我們前期的研究已經(jīng)證明酒精暴露會(huì)導(dǎo)致早期胚胎的囊胚率降低，且對胚胎發(fā)育的損傷具有劑量依賴性[8]，為弄清酒精暴露對早期胚胎譜系分化的影響，分別對囊胚期細(xì)胞的TE 和ICM 的標(biāo)記基因Cdx2 和Oct4 進(jìn)行免疫熒光染色觀察，并應(yīng)用Imagepro Plus 6 對其結(jié)果進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，1.0%酒精組的囊胚細(xì)胞的總?cè)旧?xì)胞數(shù)顯著低于正常組（圖4.A，P＜0.01），1.0%酒精組Cdx2染色細(xì)胞數(shù)顯著低于正常組（圖4.B，P＜0.01），1.0%酒精組Cdx2 染色細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)目之比顯著低于正常組（圖4.C，p＜0.01）。接下來對Cdx2 和Oct4 的單位熒光強(qiáng)度進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)兩種轉(zhuǎn)錄因子的單位熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)不同的結(jié)果，酒精組的Oct4 的單位熒光強(qiáng)度顯著高于正常組（圖5.A，p＜0.05）而Cdx2 的單位熒光強(qiáng)度則顯著低于正常組（圖5.B，P＜0.01）,且相較于Oct4，Cdx2 的熒光變化更顯著，酒精組Cdx2 與Oct4 單位熒光強(qiáng)度比值顯著低于正常組（圖5.C,p＜0.01）。兩種轉(zhuǎn)錄因子Cdx2 和Oct4 作為譜系分化的標(biāo)志物，在正常胚胎中存在相互抑制平衡[13]，從本研究結(jié)果來看，這種平衡在酒精暴露的早期胚胎中明顯被打破，導(dǎo)致其基因表達(dá)的改變，而這種改變必然對胚胎的發(fā)育產(chǎn)生嚴(yán)重影響。

圖4 正常組，1.0%酒精組囊胚細(xì)胞計(jì)數(shù)。A.囊胚總細(xì)胞數(shù)；B.Cdx2 染色細(xì)胞數(shù)；C.Cdx2 染色細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)比例.

圖5 正常組，1.0%酒精組免疫熒光強(qiáng)度分析。A.Oct4 單位熒光強(qiáng)度；B.Cdx2 單位熒光強(qiáng)度；C.Cdx2/Oct4 單位熒光強(qiáng)度比值。

討論

妊娠期間酒精暴露導(dǎo)致的胎兒發(fā)育異常統(tǒng)稱為胎兒酒精綜合征（FAS），包括胎兒中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）功能障礙和可識別的面部異常[14]。近年來，女性妊娠期飲酒比例大幅度上升，而早期胚胎的短期酒精暴露將對植入后胚胎發(fā)育產(chǎn)生怎樣的影響尚不清楚。因此，我們選擇植入前胚胎體外暴露于酒精，觀察其植入后的發(fā)育情況來探索短期的酒精暴露對植入后胚胎發(fā)育的影響。

妊娠期間不良的宮內(nèi)環(huán)境也會(huì)造成胎兒的宮內(nèi)發(fā)育遲緩，對其相應(yīng)基因的全血甲基化分析發(fā)現(xiàn)其啟動(dòng)子區(qū)的甲基化狀態(tài)發(fā)生改變從而導(dǎo)致胎兒的生長發(fā)育受到影響[15]。植入前胚胎受到外界環(huán)境的毒性效應(yīng)也會(huì)對植入后胚胎的宮內(nèi)發(fā)育造成損傷。胚胎移植后10 天的小鼠胚胎解剖結(jié)果顯示，酒精組胚胎的植入率和胎兒發(fā)育率顯著降低，胎盤的發(fā)育也呈現(xiàn)出明顯的改變。酒精組胎盤重量顯著減少，且胎盤成型率降低。胎盤作為胎兒和母體聯(lián)系的紐帶，在胎兒發(fā)育過程中負(fù)責(zé)向胎兒輸送養(yǎng)料以及運(yùn)輸廢物，胎盤發(fā)育受損將直接影響胎兒在母體子宮內(nèi)的發(fā)育,胎盤結(jié)構(gòu)和功能的損傷直接影響胎兒以及出生后的后代的生長發(fā)育[16-17]。然而植入前酒精暴露的胚胎在植入后的胎兒和胎盤損傷的具體機(jī)制以及胎兒和胎盤間是否存在相互作用尚不清楚，需要進(jìn)一步探究。

在小鼠胚胎中，Cdx2 被認(rèn)為是TE 的特異性轉(zhuǎn)錄因子，Oct4 被認(rèn)為是ICM 的特異性轉(zhuǎn)錄因子[18]。細(xì)胞譜系的正確建立決定著細(xì)胞命運(yùn)，研究發(fā)現(xiàn)，Cdx2 和Oct4 的表達(dá)具有拮抗作用，Cdx2可以結(jié)合到Oct4 基因的啟動(dòng)子區(qū)抑制其表達(dá)，同樣Oct4 也可以結(jié)合到Cdx2 基因的啟動(dòng)子區(qū)抑制其表達(dá)，這種相互作用決定了早期胚胎中ICM/TE譜系的分化[19-20]。在暴露于酒精的早期胚胎中，囊胚期細(xì)胞的免疫熒光染色結(jié)果顯示，Cdx2 和Oct4的表達(dá)平衡改變，酒精暴露的早期胚胎的譜系分化發(fā)生改變，我們推測，早期胚胎酒精暴露可能通過影響譜系分化而影響植入后胚胎在子宮內(nèi)的生長發(fā)育。

結(jié)論

胚胎發(fā)育是一個(gè)神秘而又復(fù)雜的過程，環(huán)境的微小改變都會(huì)對其造成不可逆轉(zhuǎn)的影響。本研究探究了早期胚胎酒精暴露對植入后胚胎在母體子宮內(nèi)的發(fā)育的影響，研究發(fā)現(xiàn)早期胚胎酒精暴露后會(huì)造成植入后胎兒和胎盤的發(fā)育損傷，導(dǎo)致囊胚期細(xì)胞譜系分化改變，對胚胎發(fā)育產(chǎn)生極大的影響。