張芬芬，程夢(mèng)迪，周珊珊，柳金可，王 榮

（阜陽(yáng)師范大學(xué) 胚胎發(fā)育與生殖調(diào)節(jié)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 阜陽(yáng) 236037）

急性酒精性肝損傷發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，乙醇及其毒性代謝產(chǎn)物、脂質(zhì)過(guò)氧化、氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)等均參與其中[1]嚴(yán)重者還會(huì)因急性酒精中毒而死亡。急性酒精性肝損傷是由于過(guò)量飲酒所導(dǎo)致肝臟代謝紊亂，且目前其發(fā)病率逐年升高[2]。在我國(guó),酒精性肝病僅次于病毒性肝炎，已成為引起肝功能損害的第二大病因[3]。因此酒精性肝損傷已經(jīng)嚴(yán)重影響人類(lèi)健康?，F(xiàn)代藥理研究表明，甘草具有明顯的抗炎、鎮(zhèn)咳、平喘等作用[4-5]。甘草苷(Liquiritin，LIQ)作為一種單體活性物質(zhì)是甘草中的主要黃酮類(lèi)化合物，具有抗抑郁，保護(hù)神經(jīng)、心臟系統(tǒng)等多種藥理活性[6]。Ji-Yeon Yu[7]等人研究表明甘草苷能抑制叔丁基過(guò)氧化氫模型小鼠肝臟促炎細(xì)胞因子的表達(dá)水平，可用于治療炎癥相關(guān)疾病，陳云華[8]等人研究了甘草苷對(duì)醋氨酚人肝細(xì)胞損傷模型具有一定的保護(hù)作用，但甘草苷對(duì)急性酒精性肝臟損傷是否具有保護(hù)作用尚不明確。因此，本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)檢測(cè)添加甘草苷后急性灌酒小鼠血清中ADH 水平，肝臟中ADH、MDA、SOD水平來(lái)研究甘草苷對(duì)小鼠急性酒精性肝損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康KM 小鼠50 只，雄性，體重30～35 g，由浙江維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司桐鄉(xiāng)分公司提供，許可證號(hào):SCXK(浙)2020-0002，合格證號(hào)：20210126Abzz0600000382。

1.2 主要試劑及儀器

甘草苷(北京索萊寶科技有限公司)，無(wú)水乙醇(阿拉丁加蒸餾水稀釋備用)，Bradford 法蛋白檢測(cè)試劑盒、乙醇脫氫酶(ADH)測(cè)試盒、總超氧化物歧化酶（T-SOD）測(cè)定試劑盒、丙二醛（MDA）測(cè)試盒（南京建成生物工程研究所），精密分析天平（Mettler Toledo）、低溫離心機(jī)（Eppendord）、酶標(biāo)儀（Tecan）。

1.3 動(dòng)物分組、給藥與造模

實(shí)驗(yàn)小鼠飼養(yǎng)環(huán)境21～23℃，50 只健康KM小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周。按體重隨機(jī)分為對(duì)照組、酒精組及給藥組（甘草苷低、中、高三個(gè)劑量組）共五組[9]，每組10 只。每天1 次，連續(xù)7 d 灌服給藥。對(duì)照組、酒精組分別按與給藥組等體積灌服蒸餾水，其余各組分別灌服相應(yīng)劑量甘草苷(分別為低劑量組10 mg/kg，中劑量組20 mg/kg，高劑量組40 mg/kg)，第7 d 末次給藥后1 h，除對(duì)照組外其余各組按12 ml/kg 劑量一次性灌胃50%酒精（用無(wú)水乙醇稀釋?zhuān)峦?造模[10]建立小鼠急性酒精性肝損傷模型，灌胃50%酒精后小鼠禁食不禁水。

1.4 指標(biāo)檢測(cè)及方法

1.4.1 狀態(tài)觀(guān)察

觀(guān)察各組動(dòng)物的一般情況，包括精神、活動(dòng)狀況、飲食、排便等。

1.4.2 血清生化指標(biāo)測(cè)定

第7 d 灌胃酒精造模成功12 h 后，眼球靜脈取血，血液靜置1 h，4℃低溫下進(jìn)行離心，4000 r/min 離心10 min 后取上清液，根據(jù)乙醇脫氫酶(ADH)測(cè)試盒測(cè)ADH 活力。

1.4.3 肝臟生化指標(biāo)測(cè)定

第7 d 灌胃酒精造模成功12 h 后，脫頸處死解剖取肝臟，研磨成10%的肝組織勻漿4℃低溫下進(jìn)行離心，4000 r/min 離心10 min 后取上清液，根據(jù)乙醇脫氫酶(ADH)測(cè)試盒、總超氧化物歧化酶（T-SOD）測(cè)定試劑盒、丙二醛（MDA）測(cè)試盒測(cè)ADH、MDA、SOD 含量和活力。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPadPrism8 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行差異顯著性分析，計(jì)量資料以(Mean&SEM)表示，各組間比較采用(one-way ANOVA)檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn):a=0.05，雙側(cè)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 狀態(tài)觀(guān)察

造模前小鼠生活狀態(tài)正常，毛色光澤，黑褐色顆粒樣大便;進(jìn)食及飲水均正常。給予酒精造模后，除正常對(duì)照組外，其余各組小鼠先表現(xiàn)為行動(dòng)緩慢，轉(zhuǎn)而進(jìn)入嗜睡醉酒狀態(tài)，進(jìn)食少，毛散亂。

圖1 血液各組ADH 活力。A.正常組，B.酒精組，C.甘草苷低劑量組，D.甘草苷中劑量組，E.甘草苷高劑量組。

2.2 血清指標(biāo)的比較

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，酒精組與對(duì)照組比較，其血清ADH 水平均有升高，表明造模成功，小鼠經(jīng)一次性灌胃50%酒精后出現(xiàn)肝臟損傷；甘草苷各劑量組與酒精組比較，小鼠的血清ADH 水平均升高(p＜0.05)；甘草苷各劑量組之間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 肝功能指標(biāo)的比較

酒精組與對(duì)照組比較，其肝臟ADH 水平有所升高，甘草苷低、高劑量組與酒精組比較，小鼠的肝臟ADH 水平均升高(均p＜0.05)；酒精組與對(duì)照組比較，其肝臟SOD 水平有所降低，甘草苷中劑量組與酒精組比較，小鼠的肝臟ADH 水平差異不明顯。甘草苷各劑量組與酒精組比較，小鼠的肝臟SOD 水平均升高(均p＜0.05)；酒精組及給藥組與對(duì)照組比較，其肝臟MDA 水平整體趨勢(shì)呈現(xiàn)無(wú)顯著性差異，甘草苷中劑量組MDA 值升高可能存在一定的偏差。綜合表明甘草苷對(duì)酒精損傷的肝臟有一定的保護(hù)作用。

圖2 肝臟各組ADH 活力。A.正常組，B.酒精組，C.甘草苷低劑量組，D.甘草苷中劑量組，E.甘草苷高劑量組。）

圖3 肝臟各組SOD 活力。A.正常組，B.酒精組，C.甘草苷低劑量組，D.甘草苷中劑量組，E.甘草苷高劑量組。）

圖4 肝臟各組MDA 含量。A.正常組，B.酒精組，C.甘草苷低劑量組，D.甘草苷中劑量組，E.甘草苷高劑量組。）

3 討論

酒精性肝病的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，肝臟是酒精代謝最主要的器官，酒精進(jìn)入肝臟首先在乙醇脫氫酶的作用下代謝為乙醛，再通過(guò)乙醛脫氫酶代謝成乙酸，最后分解成水和二氧化碳排出體外[11]。過(guò)量飲酒肝臟代謝負(fù)荷增大，不能及時(shí)將有害物質(zhì)分解排除體外，因此會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)相關(guān)代謝通路紊亂，使肝細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致肝臟脂質(zhì)化、纖維化等，從而誘發(fā)肝細(xì)胞損傷[12-13]。過(guò)量的乙醇攝入可降低肝臟內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的活性，減弱SOD 等抗氧化能力，破壞機(jī)體的氧化和抗氧化平衡，引起氧化應(yīng)激，導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化的連鎖反應(yīng)，以及線(xiàn)粒體功能損傷、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和免疫炎性反應(yīng)等引起的肝損傷[14]。MDA 是脂質(zhì)過(guò)氧化的重要產(chǎn)物，其含量高低可反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化的強(qiáng)度[15]，酒精性肝損傷過(guò)程中肝臟內(nèi)氧化應(yīng)激標(biāo)志物如MDA、SOD 等的含量均明顯改變。短時(shí)間大量飲酒會(huì)損傷肝組織，主要和抗氧化損傷、脂質(zhì)過(guò)氧化及免疫損傷等因素相關(guān)[16]，降低肝臟的氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而達(dá)到醒酒護(hù)肝作用是近年來(lái)中醫(yī)藥研究的熱點(diǎn)[17]中藥及其有效成分[18]具有改善肝功能、減輕氧化應(yīng)激損傷[19]、調(diào)節(jié)免疫功能、減少炎癥、減少細(xì)胞凋亡、保護(hù)肝臟免受損傷的作用。這些研究為今后開(kāi)發(fā)保肝藥物奠定了基礎(chǔ)[20]。甘草中的主要成分為三萜類(lèi)和黃酮類(lèi)，其中甘草苷是黃酮類(lèi)化合物中重要的單體活性成分，具有很強(qiáng)的藥理活性[6]。甘草苷通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞凋亡以劑量依賴(lài)的方式抑制腫瘤生長(zhǎng)[21]。甘草苷能夠通過(guò)雙重抑制TRPV_1 和TRPA_1 通道介導(dǎo)，表現(xiàn)出抗炎鎮(zhèn)咳作用[22]。甘草苷通過(guò)ROS 介導(dǎo)的絲裂原活化蛋白激酶/Akt/NFκB 信號(hào)通路抑制肝癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡[23]。因此探究甘草苷對(duì)急性灌酒小鼠肝損傷的保護(hù)作用具有重要的研究意義。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示應(yīng)用甘草苷可以顯著提高血清和肝組織中ADH 和SOD 水平，當(dāng)血液中的乙醇濃度過(guò)高時(shí)，乙醇主要通過(guò)ADH 代謝系統(tǒng)進(jìn)行氧化，而提高ADH 活力可以加速乙醇的代謝過(guò)程，可見(jiàn)甘草苷具有解酒功能。檢測(cè)肝臟各組ADH 活力時(shí)，甘草苷中劑量組與酒精組相比差異不明顯，但相對(duì)于酒精組還是有一定的提高，可能是由于一定的偏差造成，但具體原因還需進(jìn)一步探究。SOD 是作用于超氧陰離子自由基的專(zhuān)一歧化反應(yīng)催化劑，SOD 作為醫(yī)藥產(chǎn)品，在治療因自由基作用而導(dǎo)致的炎癥、自身免疫性、心腦血管疾病等都有著顯著療效。[24]SOD 可利用其抗氧化作用抑制炎癥反應(yīng)，甘草苷能夠提高機(jī)體SOD 活力，表明其能增強(qiáng)機(jī)體抗氧化作用，說(shuō)明甘草苷對(duì)肝臟損傷具有一定的保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)采用的方法是單次大量高濃度酒精灌胃構(gòu)建急性酒精性肝損傷模型，結(jié)果顯示酒精組小鼠血清和肝臟中ADH水平均有所升高，說(shuō)明機(jī)體在接受大量酒精時(shí)，自身進(jìn)行了一定的代謝過(guò)程。酒精組肝臟SOD 活力有所下降，說(shuō)明機(jī)體一次性飲用大量酒精會(huì)降低自身的抗氧化能力。給藥組SOD 活力升高說(shuō)明給藥后提高了機(jī)體清除氧自由基的能力，而各組MDA 含量未顯示出顯著性差異，可能是由于急性灌酒后短時(shí)間內(nèi)機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度差異還未明顯表現(xiàn)。甘草苷對(duì)急性酒精性肝損傷具有一定的保護(hù)作用，這可能與甘草苷可在一定程度上改善脂質(zhì)過(guò)氧化、增強(qiáng)受損肝臟抗氧化能力、減少炎癥反應(yīng)有關(guān)，其作用機(jī)制需要更進(jìn)一步的研究探索。