程 智，張?jiān)亙x，楊金易，徐振林，王 弘，雷紅濤，孫遠(yuǎn)明，沈玉棟

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院 廣東省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510642）

西地那非（Sildenafil，SD）是美國食品藥品管理局（FDA）于1998年批準(zhǔn)用于治療性功能障礙的一種5型磷酸二酯酶（Phosphodiesterase 5，PDE5）抑制劑［1］，是已批準(zhǔn)的3個(gè)壯陽藥之一，其副作用主要有頭痛、背痛以及視力聽力障礙，與硝酸酯類藥物同時(shí)服用時(shí)會(huì)顯著降低血壓導(dǎo)致意識(shí)喪失甚至死亡等［2］。因此，2012 年3 月中國國家食品藥品監(jiān)督管理總局發(fā)布的“食藥監(jiān)辦?；?012］33 號(hào)”文件中明確禁止在保健食品中添加西地那非。然而，部分保健食品企業(yè)為了加強(qiáng)產(chǎn)品功效，在經(jīng)濟(jì)利益驅(qū)使下，向產(chǎn)品中非法添加那非類藥物，其中以西地那非違禁添加問題最為突出，如上海食品藥品檢驗(yàn)所2016～2018年檢出的458批次非法添加化學(xué)藥物的食品中，西地那非檢出428批次［3］，河北省藥品檢驗(yàn)研究院于2017 年檢出的12 批次非法添加化學(xué)藥物的酒類產(chǎn)品中，西地那非檢出8 批次［4］，深圳市計(jì)量質(zhì)量檢測(cè)研究院2018 年檢出的15 批次非法添加藥物的功能酒中，西地那非陽性8 批次［5］。因此，建立保健食品中西地那非藥物靈敏準(zhǔn)確的檢測(cè)方法，對(duì)食品安全監(jiān)管具有重要實(shí)際意義。

目前，針對(duì)保健食品中那非類藥物的檢測(cè)方法主要是基于色譜－質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的大型儀器確證分析方法［6－12］，該類方法具有準(zhǔn)確、靈敏等特點(diǎn)，但也存在儀器昂貴，前處理復(fù)雜，檢測(cè)成本高等問題，因而難以在基層普及。免疫分析方法［13－18］具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、成本低、快速等優(yōu)點(diǎn)，是儀器分析方法的互補(bǔ)方法。近年來，關(guān)于西地那非殘留的免疫分析方法陸續(xù)有少量報(bào)道，如間接競爭酶聯(lián)免疫吸附分析（Indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay，icELISA）［13－16］和免疫層析分析（Immunochromatography assay，ICA）［17－18］，樣品檢測(cè)靈敏度約在5～80 μg/mL 之間，不能滿足保健食品中禁用藥物西地那非的測(cè)定需求。因此，開發(fā)更為靈敏可靠的技術(shù)方法，對(duì)有效監(jiān)測(cè)保健食品中非法添加西地那非的食品安全問題，保障人體健康具有重要意義。

直接競爭化學(xué)發(fā)光酶免疫分析（Direct competitive chemiluminescence enzyme immunoassay，dcCLEIA）方法是以酶聯(lián)免疫吸附分析原理為基礎(chǔ)發(fā)展起來的新一代超靈敏免疫分析技術(shù)［19－20］。該方法以魯米諾等發(fā)光底物作為信號(hào)輸出探針，在辣根過氧化物酶（HRP）催化下，使過氧化氫釋放出活性氧，從而將底物魯米諾氧化為激發(fā)態(tài)，最后激發(fā)態(tài)躍遷回基態(tài)實(shí)現(xiàn)發(fā)光。dcCLEIA 具有化學(xué)發(fā)光信號(hào)靈敏度高，可有效規(guī)避基質(zhì)背景干擾，檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定等突出優(yōu)勢(shì)［21－22］；同時(shí)，采用基于酶標(biāo)抗體的直接競爭模式，減少了酶標(biāo)二抗的反應(yīng)步驟，簡化了檢測(cè)過程，節(jié)省了檢測(cè)時(shí)間，提高了檢測(cè)效率。因此，本研究利用前期獲得的抗體制備酶標(biāo)抗體，開展了保健食品中西地那非超靈敏檢測(cè)的dcCLEIA 方法研究，以期為保健食品安全監(jiān)管提供技術(shù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

UV－160A 紫外－可見掃描儀（日本Kyoto 公司）；MK3 多功能酶標(biāo)儀（美國Thermo 公司）；DEM－3自動(dòng)洗板機(jī)（北京拓普分析儀器有限責(zé)任公司）；MS3 旋渦混合器（i國IKA 公司）；96 孔不透明白色發(fā)光板（廈門市云鵬科技發(fā)展有限公司）；AB SCIEX 5500 三重四極桿質(zhì)譜儀（美國AB SCIEX 公司）。

西地那非、瓦地那非（Vardenafil）、米羅那非（Mironafil）、他達(dá)那非（Tadalafil）、紅地那非（Acetildenafil）等藥物購自Alfa Aesar 公司；西地那非多克隆抗體和包被原（SDBA－OVA）由本實(shí)驗(yàn)室［14］自制；魯米諾化學(xué)發(fā)光底物液（A 液：4 mg 魯米諾鈉鹽（Luminol－Na）溶于20 mL 水中）和底物緩沖液（B液：2 mg 對(duì)碘酚溶于100 μL 二甲基亞砜中，加入4 μL 3%的雙氧水）；包被緩沖液（pH 9.6，0.1 mol/L碳酸鹽緩沖液）、封閉液（0.2 g/L KCl，0.2 g/L KH2PO4，2.9 g/L Na2HPO4·12H2O，8.5 g/L NaCl，0.05%Tween－20，5%脫脂奶粉）、洗滌液（2.9 g/L Na2HPO4·12H2O，8.5 g/L NaCl，0.05%Tween－20）、稀釋液（磷酸鹽吐溫溶液，PBST，5%甲醇，0.1% Tween－20，0.01 mol/L pH 7.4 磷酸鹽溶液）、終止液（10%H2SO4溶液）等溶液均為實(shí)驗(yàn)室自配［14，23］；其它試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 辣根過氧化物酶標(biāo)記抗體（HRP－Ab）的制備與評(píng)價(jià) 采用過碘酸鈉法［24］對(duì)西地那非兔多克隆抗體進(jìn)行辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記制備酶標(biāo)抗體HRP－Ab。然后，將酶標(biāo)抗體稀釋成系列濃度，在1 μg/mL包被原濃度下，采用酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）法測(cè)定不同濃度的抗體與包被抗原反應(yīng)的A450nm值（450 nm可見光波長下的吸光度值），將讀數(shù)為1.0左右對(duì)應(yīng)的酶標(biāo)抗體稀釋倍數(shù)定義為效價(jià)。同時(shí)，加入500 ng/mL 西地那非標(biāo)準(zhǔn)品與抗體發(fā)生競爭反應(yīng)，讀取A450nm值，并計(jì)算抑制率（Inhibition rate，IR），計(jì)算公式為：IR（%）=（1－B/B0）×100%，其中，B0為未添加藥物的微孔吸光值，B為添加藥物的微孔吸光值。

1.2.2 dcCLEIA實(shí)驗(yàn)步驟 將包被原用包被液稀釋至適當(dāng)濃度，以每孔100 μL加入到化學(xué)發(fā)光板中，37 ℃下孵育過夜。洗滌液洗板2 次后，拍干備用。每孔加入120 μL 封閉液，37 ℃下封閉3 h 后甩干孔內(nèi)液體，置于37 ℃烘箱內(nèi)烘干備用。用磷酸鹽緩沖液將西地那非標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成0、0.000 2、0.002、0.02、2、20、200 ng/mL，酶標(biāo)抗體稀釋至0.5 mg/mL。每孔分別加入不同濃度的藥物與酶標(biāo)抗體各50 μL，振蕩混勻，37 ℃下孵育40 min，洗板5次后拍干；加入100 μL 等體積混合的化學(xué)發(fā)光A 液和B液，振蕩混勻后，用化學(xué)發(fā)光儀讀取相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度（Relative light units，RLU）。

1.2.3 dcCLEIA 方法的建立 參照文獻(xiàn)［23］步驟，對(duì)包被原濃度、抗體稀釋倍數(shù)、封閉液和洗滌液的吐溫含量、稀釋液PBST 的甲醇添加量以及競爭反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行考察。按照“1.2.2”步驟操作，以西地那非濃度負(fù)對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，RLU 值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過比較最大化學(xué)發(fā)光值RLUMAX、IC50、RLUMAX/IC50選擇最佳工作條件。確定最佳工作條件后以RLU 值為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品濃度負(fù)對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，采用四參數(shù)擬合繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算西地那非的檢出限（LOD，IC10）、半抑制濃度（IC50）和線性范圍（IC20～I(xiàn)C80）。

1.2.4 方法特異性 采用交叉反應(yīng)率（Cross-reactivity，CR）評(píng)價(jià)方法的特異性，根據(jù)“1.2.3”方法擬合獲得西地那非藥物及其類似物的IC50，計(jì)算CR，計(jì)算公式如下：

1.2.5 樣品前處理方法 ①口服液類：準(zhǔn)確吸取1 mL 樣品置于50 mL 離心管中，加入10 mL 二氯甲烷，振蕩5 min 后超聲10 min，4 000 r/min 離心5 min 后取上清液，旋蒸后用1 mL 甲醇復(fù)溶并稀釋10倍，備用。②膠囊、片劑類：準(zhǔn)確稱取研細(xì)的樣品1 g于50 mL離心管中，加入5 mL pH 5.0～6.0的鹽酸水溶液，振蕩5 min后超聲10 min，4 000 r/min離心5 min后取上清液，調(diào)至pH 9.0，加入10 mL二氯甲烷萃取，振蕩5 min后超聲10 min，4 000 r/min離心5 min，反復(fù)萃取3次，合并有機(jī)層，旋蒸后用1 mL甲醇復(fù)溶并稀釋20倍，備用。

1.2.6 加標(biāo)回收與儀器驗(yàn)證 根據(jù)所建立dcCLEIA 方法的檢測(cè)范圍，在經(jīng)過前處理的陰性樣品中加入低、中、高3 個(gè)濃度水平的西地那非標(biāo)準(zhǔn)品后用dcCLEIA 方法測(cè)定，計(jì)算出各樣品的加標(biāo)回收率以及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（Relative standard deviation，RSD）。同時(shí)，利用dcCLEIA 與HPLC－MS/MS 標(biāo)準(zhǔn)確證法（SN/T 4054－2014）［25］對(duì)隨機(jī)盲樣進(jìn)行比對(duì)檢測(cè)，評(píng)價(jià)方法可靠性。

2 結(jié)果與討論

2.1 酶標(biāo)抗體性質(zhì)的鑒定

將“1.2.1”制得的5 mg/mL 酶標(biāo)抗體稀釋10 倍至0.5 mg/mL 后，測(cè)定并計(jì)算酶標(biāo)抗體HRP－Ab 的效價(jià)及抑制率。結(jié)果顯示在500 ng/mL的西地那非藥物質(zhì)量濃度下抑制率達(dá)到90%以上，此時(shí)效價(jià)為1∶400（圖1），考慮初始的10倍稀釋，其原始酶標(biāo)抗體效價(jià)應(yīng)為1∶4 000，說明抗體酶標(biāo)后保持了良好的分析性能。

圖1 HRP－Ab的效價(jià)抑制曲線Fig.1 Titer and inhibition curve of HRP－Ab

2.2 dcCLEIA工作條件的優(yōu)化

對(duì)影響dcCLEIA 的實(shí)驗(yàn)參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，以RLUMAX/IC50值作為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，比值越大，說明靈敏度越高，重復(fù)性越好［24］。對(duì)包被原濃度、抗體稀釋倍數(shù)、封閉液和洗滌液的吐溫－20 含量、稀釋液PBST 甲醇添加量以及競爭反應(yīng)時(shí)間等條件進(jìn)行優(yōu)化。最終選擇RLUMAX/IC50較高、RLUMAX適中、IC50較低的條件作為最佳工作條件。結(jié)果表明，最佳工作條件為：包被原質(zhì)量濃度為41.67 ng/mL，酶標(biāo)抗體質(zhì)量濃度為1.25 μg/mL，封閉液和洗滌液吐溫－20 含量為0.05%，稀釋液甲醇添加量為5%，競爭反應(yīng)時(shí)間為40 min。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

根據(jù)確定的優(yōu)化條件，以RLU 值為縱坐標(biāo)，西地那非標(biāo)準(zhǔn)品濃度的負(fù)對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并采用四參數(shù)擬合得到西地那非檢測(cè)的IC50為0.17 ng/mL，線性檢測(cè)范圍（IC20～I(xiàn)C80）為0.024～1.21 ng/mL，檢出限IC10為0.008 ng/mL，達(dá)到了pg/mL 水平，相比報(bào)道的ELISA 與ICA 方法［13－18］，靈敏度顯著提高。另外，由于采用直接競爭法，減少了酶標(biāo)二抗捕獲一抗步驟（一般需要30 min以上），將檢測(cè)時(shí)間縮短至40 min，較ELISA 檢測(cè)方法縮短了20 min以上，節(jié)省了時(shí)間，提高了檢測(cè)效率（表1）。

表1 已報(bào)道的西地那非ELISA檢測(cè)方法與本方法的比較Table 1 Comparison between the proposed dcCLEIA and other ELISA methods for detection of sildenafil

2.4 方法特異性

選擇主要的結(jié)構(gòu)或功能類似物，利用dcCLEIA測(cè)定交叉反應(yīng)率。以西地那非作為參照（交叉反應(yīng)率100%），結(jié)果顯示（表2），該方法對(duì)主要結(jié)構(gòu)功能類似物瓦地那非以及米羅那非的交叉反應(yīng)率分別為48.5%與62.5%，與他達(dá)那非和紅地那非類藥物無明顯交叉反應(yīng)（CR ＜0.1%）。瓦地那非、米羅那非與西地那非的結(jié)構(gòu)類似度較高，說明抗體主要識(shí)別其共有結(jié)構(gòu)部分，因而此方法可用于這3 類結(jié)構(gòu)藥物的半定量檢測(cè)。

表2 西地那非結(jié)構(gòu)功能類似物的交叉反應(yīng)率Table 2 Cross-reactivity of sildenafil analogues by dcCLEIA

2.5 基質(zhì)效應(yīng)的消除

樣品經(jīng)“1.2.5”前處理后用PBST 稀釋適當(dāng)倍數(shù)，以西地那非為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行dcCLEIA 測(cè)定并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，考察基質(zhì)效應(yīng)消除情況。結(jié)果表明（圖2）：口服液基質(zhì)以PBST稀釋10倍，膠囊和片劑基質(zhì)以PBST稀釋20倍后，抑制曲線與西地那非標(biāo)準(zhǔn)曲線均能基本重合，表明樣品基質(zhì)效應(yīng)基本消除。

圖2 實(shí)際樣品基質(zhì)效應(yīng)的消除Fig.2 Elimination of matrix effect in real samples

2.6 實(shí)際樣品分析

根據(jù)所建方法的靈敏度和線性范圍，向口服液、片劑、膠囊3種陰性樣品中添加低、中、高3個(gè)濃度水平的西地那非藥物，采用建立的dcCLEIA 方法進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（表3）。結(jié)果表明：西地那非樣品的加標(biāo)回收率為82.0%～114%，RSD 均小于15%。同時(shí)采用dcCLEIA 方法與HPLC－MS/MS 方法對(duì)隨機(jī)盲樣進(jìn)行檢測(cè)，兩種方法的檢測(cè)結(jié)果具有良好一致性（表4），相關(guān)系數(shù)（r2）為0.991。說明該方法準(zhǔn)確性良好，可滿足實(shí)際樣品檢測(cè)需求。

表3 實(shí)際樣品中西地那非的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=3）Table 3 Recoveries of sildenafil in spiked samples by dcCLEIA（n=3）

表4 隨機(jī)盲樣中西地那非的測(cè)定（n=3）Table 4 Determination of sildenafil in random blind samples by dcCLEIA and HPLC－MS/MS（n=3）

3 結(jié) 論

本研究建立了保健食品中西地那非的dcCLEIA 檢測(cè)方法，方法檢出限達(dá)pg/mL 級(jí)，與他達(dá)那非和紅地那非等類似物無交叉反應(yīng)。實(shí)際樣品的加標(biāo)回收率為82.0%～114%，RSD 均小于15%。盲樣檢測(cè)結(jié)果與HPLC－MS/MS方法相關(guān)性良好，檢測(cè)時(shí)間為40 min，可用于實(shí)際樣品的快速檢測(cè)。