王豐琳，周新穎，王文晶，楊三東，唐 濤，李 彤*

（1.大連依利特分析儀器有限公司，遼寧 大連 116023；2.大連市色譜工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連 116023；3.中國(guó)科學(xué)院 蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所，江蘇 蘇州 215163）

熒光檢測(cè)方法主要利用被檢測(cè)物質(zhì)在紫外光照射時(shí)產(chǎn)生熒光，通過測(cè)試熒光響應(yīng)達(dá)到檢測(cè)目的，此方法能有效消除其它基質(zhì)的干擾，并具有很好的響應(yīng)穩(wěn)定性。因此熒光檢測(cè)器具有靈敏度高、選擇性好的特點(diǎn)，在高效液相色譜中得到廣泛應(yīng)用。如周雯鸝等［1］使用高效液相色譜－熒光檢測(cè)法測(cè)定塑料兒童玩具中4種苯并唑類熒光增白劑。余曉琴等［2］使用高效液相色譜－熒光檢測(cè)法測(cè)定水果中乙氧基喹啉。陳坤等［3］使用熒光衍生化和高效液相色譜－熒光檢測(cè)法測(cè)定水和蔬菜中揮發(fā)性異味物質(zhì)等。目前使用的熒光檢測(cè)器多依賴于進(jìn)口的通用型熒光檢測(cè)設(shè)備，該類設(shè)備通常由激發(fā)光和發(fā)射光兩組單色器及多個(gè)光柵、狹縫、透鏡組成，其結(jié)構(gòu)復(fù)雜、成本高、占用儀器空間較大［4］。其中，激發(fā)光源是熒光檢測(cè)設(shè)備的關(guān)鍵部件，傳統(tǒng)的激發(fā)光源（如氙燈）存在體積大、能耗高、壽命短等問題［5］。激光由于具有極佳的單色性及高激發(fā)能量，近年來，通過共聚焦光路結(jié)構(gòu)［6－7］將激光作為激發(fā)光源的激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器得到了極為廣泛的應(yīng)用［8－9］。

發(fā)光二極管（LED）作為一種近年來發(fā)展迅速的光學(xué)產(chǎn)品，因具有能耗低、壽命長(zhǎng)、穩(wěn)定性強(qiáng)、體積小以及成本低等優(yōu)點(diǎn)，在熒光檢測(cè)方面得到廣泛應(yīng)用［10－13］。LED 光源的光譜帶寬通常為10～20 nm，而不同物質(zhì)檢測(cè)所需的激發(fā)波長(zhǎng)往往相差幾十甚至上百納米，所以使用單一的LED 光源無法滿足多種物質(zhì)檢測(cè)的需要，僅能作為某單一物質(zhì)的專用檢測(cè)器使用，極大地限制了該類設(shè)備的應(yīng)用范圍。

近年來，國(guó)內(nèi)外有很多關(guān)于誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器的研究，以光路結(jié)構(gòu)區(qū)分，有正交式、共聚焦式、斜入式、透射式四種主要結(jié)構(gòu)。正交式是指激發(fā)光路和發(fā)射光路相互垂直，具有兩套光學(xué)系統(tǒng)，因此其存在的空間位阻問題會(huì)影響熒光信號(hào)的收集［14］；共聚焦結(jié)構(gòu)指激發(fā)光路和發(fā)射光路成180°，其主要優(yōu)點(diǎn)在于光路結(jié)構(gòu)中只有一套光學(xué)體系，因熒光收集率高以及雜散光低等優(yōu)點(diǎn)［15］被廣泛應(yīng)用；斜入射式和透射式結(jié)構(gòu)主要應(yīng)用于微芯片系統(tǒng)中［16］。本文采用經(jīng)典的共聚焦光路結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)了一款新型LED 多波長(zhǎng)熒光檢測(cè)器。通過對(duì)電機(jī)的分步控制，實(shí)現(xiàn)了多波長(zhǎng)檢測(cè)功能，解決了波長(zhǎng)單一問題；并通過電機(jī)多重校準(zhǔn)定位與光源滑動(dòng)定位技術(shù)，解決了多光源的精準(zhǔn)定位問題；以340、365、385 nm 高功率紫外LED 作為激發(fā)光源，共用一套發(fā)射光路，可同時(shí)對(duì)多種真菌毒素和苯并（α）芘進(jìn)行檢測(cè)，拓展了其應(yīng)用領(lǐng)域；并對(duì)研制的檢測(cè)器進(jìn)行了系統(tǒng)評(píng)價(jià)，在基本性能、應(yīng)用實(shí)驗(yàn)和環(huán)境測(cè)試方面均取得了良好的結(jié)果。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

LED多波長(zhǎng)熒光檢測(cè)器，P3100高壓恒流泵，S3100自動(dòng)進(jìn)樣器，O3100色譜柱恒溫箱，PD3100光化學(xué)衍生器，Kromstation 色譜數(shù)據(jù)工作站，Supersil ODS2 色譜柱（4.6 mm×150 mm i.d，5 μm）均購于大連依利特分析儀器有限公司。

甲醇、乙腈（色譜級(jí)，美國(guó)Sigma 公司）；乙酸（分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；標(biāo)準(zhǔn)品：黃曲霉毒素B1（2.0 μg/mL，農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所）；赭曲霉毒素A（10.0 μg/mL，O2Si）；苯并（α）芘（純度為98.8%，Dr.Ehrensorfer公司）；純水（Synergy，i國(guó)Millipore公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 赭曲霉毒素A 取1 mL 10.0 μg/mL 的赭曲霉毒素A 置于50 mL 容量瓶中，用甲醇－乙腈（體積比1∶1）稀釋定容，配制為200.0 ng/mL 的儲(chǔ)備液，再用流動(dòng)相稀釋成質(zhì)量濃度分別為1.0、5.0、10.0、20.0、50.0 ng/mL的對(duì)照品溶液。

色譜條件：激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為340 nm 和440 nm；流動(dòng)相為乙腈－水－乙酸（體積比96∶102∶2）；流量為1.0 mL/min；柱溫為40 ℃；進(jìn)樣體積為20 μL；色譜柱為Supersil ODS2（4.6 mm ×150 mm i.d，5 μm）。

1.2.2 黃曲霉毒素B1取1 mL 2.0 μg/mL的黃曲霉毒素B1置于25 mL容量瓶中，用甲醇稀釋定容，配制為80.0 ng/mL 的儲(chǔ)備液，再用流動(dòng)相稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、

20.0 ng/mL的對(duì)照品溶液。

色譜條件：激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為365 nm 和440 nm；流動(dòng)相為甲醇－乙腈－水（體積比20∶20∶60）；其余條件同上。

1.2.3 苯并（α）芘 準(zhǔn)確稱取10.0 mg 苯并（α）芘置于100 mL 容量瓶中，用乙腈溶解、定容至刻度，得到100.0 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用乙腈稀釋得到1 000.0 ng/mL 的儲(chǔ)備液，再用流動(dòng)相稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、5.0、10.0、20.0 ng/mL的對(duì)照品溶液。

色譜條件：激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為385 nm和440 nm；流動(dòng)相為乙腈－水（體積比90∶10）；其余條件同上。

2 結(jié)果與討論

2.1 LED多波長(zhǎng)熒光檢測(cè)器的研制

2.1.1 光路與成像模擬 LED多波長(zhǎng)熒光檢測(cè)光路系統(tǒng)采用共聚焦光路設(shè)計(jì)，使用Zemax光學(xué)設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行光路模擬（圖1）。經(jīng)過優(yōu)化，系統(tǒng)消除了離焦現(xiàn)象，從光線追跡（圖2A）及點(diǎn)列圖（圖2B）可知均方根半徑（RMS）從8 334 μm 減小到154 μm，艾里斑由5.91 μm 減小到1.83 μm，當(dāng)艾里斑直徑小于2.44×F×主波長(zhǎng)時(shí)，系統(tǒng)的設(shè)計(jì)滿足要求，此時(shí)光學(xué)系統(tǒng)的艾里斑直徑理論值大小為1.87 μm，LED多波長(zhǎng)熒光檢測(cè)光路成像的艾里斑直徑小于此值，說明設(shè)計(jì)符合要求，成像分辨率更好，能量更加集中，球差顯著減小。

圖1 光路的模擬結(jié)果Fig.1 Result of optical path simulation

圖2 光路成像分析結(jié)果Fig.2 Result of optical path imaging analysis

2.1.2 光源定位 多LED 光源切換，其核心在于光源切換后，能夠精準(zhǔn)定位，進(jìn)而保證檢測(cè)的重復(fù)性與一致性。本設(shè)備采用粗定位和精定位兩級(jí)光耦確定原點(diǎn)位置；電機(jī)采用128 細(xì)分步方式控制，最小步進(jìn)角度低至0.014°；采用高分辨率編碼器，保證光源系統(tǒng)中心位置的精確定位，當(dāng)位置與設(shè)定不相符時(shí)，硬件電路會(huì)自動(dòng)計(jì)算并進(jìn)行距離補(bǔ)償。

為增強(qiáng)多LED 光源切換的可靠性，設(shè)計(jì)坐標(biāo)板定位系統(tǒng)（圖3）。采用紅外激光器替換LED 光源的方式，其中，激光器的發(fā)散角度為1°，將光程放大至1 m 的距離，激光器投影至坐標(biāo)板上的縱向位移為8.75 mm，針對(duì)LED 光源切換機(jī)構(gòu)進(jìn)行不間斷連續(xù)切換?？傆?jì)運(yùn)行周期為3 萬個(gè)周期時(shí)，光源系統(tǒng)中多個(gè)光源中心定位重復(fù)性良好，激光器的靶點(diǎn)位置誤差在±0.2 mm以內(nèi)，實(shí)現(xiàn)了LED光源定位的準(zhǔn)確性和良好的重復(fù)性。

圖3 多波長(zhǎng)LED光源自動(dòng)切換系統(tǒng)切換周期可靠性測(cè)試Fig.3 The reliability test of automatic switching cycle of multi-wavelength LED light source

2.1.3 結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì) 本設(shè)備主要由多波長(zhǎng)LED 光源自動(dòng)切換系統(tǒng)、共聚焦專用樣品池、共聚焦式熒光光路系統(tǒng)、熒光探測(cè)系統(tǒng)、數(shù)據(jù)放大采集系統(tǒng)及計(jì)算機(jī)組成。

光源采用高功率紫外LED 燈，具有單色性好、能耗低、壽命長(zhǎng)、封裝小及節(jié)能環(huán)保和散熱結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。其包含多個(gè)LED 光源，可實(shí)現(xiàn)光源和濾光片的智能切換，以及高精度定位的功能（圖4）。因此可以根據(jù)實(shí)際需求選配指定波長(zhǎng)的光源。本系統(tǒng)中主要包括340、365、385 nm 波長(zhǎng)的高功率紫外LED 光源，并通過共聚焦光路系統(tǒng)將激發(fā)光聚焦至樣品處，再對(duì)樣品發(fā)射出的熒光進(jìn)行高效收集，從而既保證激發(fā)光的能量足夠強(qiáng)，又極大地降低了背景光。最后將激發(fā)出的熒光弱信號(hào)采用高靈敏度、低暗電流的光電倍增管進(jìn)行探測(cè)。數(shù)據(jù)放大采集系統(tǒng)對(duì)探測(cè)的熒光弱信號(hào)進(jìn)行放大、濾波、模數(shù)轉(zhuǎn)換，再由高效率單片機(jī)系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理運(yùn)算，并與上位機(jī)計(jì)算機(jī)擬定合理的通訊協(xié)議，對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行采集。

圖4 多波長(zhǎng)LED熒光檢測(cè)器的光源切換系統(tǒng)Fig.4 Light source swithching system diagram of multi-wavelength LED fluorescence detector

2.2 LED多波長(zhǎng)熒光檢測(cè)器的評(píng)價(jià)

2.2.1 噪聲與漂移 噪聲與漂移是衡量熒光檢測(cè)器性能的主要指標(biāo)。本文參考國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《JJG 705－2014 液相色譜儀》［17］及《GB/T 26792－2011 高效液相色譜儀》［18］，以甲醇為流動(dòng)相，基線噪聲以“峰對(duì)峰計(jì)算法”計(jì)算，漂移為1 h 內(nèi)基線的最高峰值與最低峰值之差。通過試驗(yàn)，得到LED 多波長(zhǎng)熒光檢測(cè)器在340、365、385 nm 3個(gè)激發(fā)光源的基線噪聲在每個(gè)靈敏檔均低于5×10－4FU，漂移低于5×10－3FU/h（見表1）。

表1 LED多波長(zhǎng)熒光檢測(cè)器的噪聲與漂移Table 1 Noise and drift of LED multi-wavelength fluorescence detector

2.2.2 線性范圍與檢出限 分別以赭曲霉毒素A、黃曲霉毒素B1、苯并（α）芘為檢測(cè)對(duì)象，考察檢測(cè)器對(duì)其線性范圍和檢出限情況。取“1.2”的對(duì)照品濃度，按照“1.2”色譜條件，對(duì)3 個(gè)激發(fā)光源（340、365、385 nm）進(jìn)行線性考察，以峰面積為縱坐標(biāo)（Y，mFU·s），對(duì)照品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X，ng/mL）進(jìn)行線性回歸。由表2可知，赭曲霉毒素A、黃曲霉毒素B1、苯并（α）芘分別在1.0～50.0、0.1～20.0、0.5～20.0 ng/mL 范圍內(nèi)均呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（r2）均大于0.999 9；3種待測(cè)物的色譜圖如圖5所示，以3倍信噪比（S/N=3）為基準(zhǔn)，將標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級(jí)稀釋，得到3種待測(cè)物的檢出限（LOD）分別為0.06、0.01、0.02 ng/mL，方法的靈敏度符合分析要求［19－21］。

表2 赭曲霉毒素A、黃曲霉毒素B1及苯并（α）芘的線性范圍、相關(guān)系數(shù)及檢出限Table 2 Linear ranges，regression equations，correlation coefficients（r2）and LODs of ochratoxin A，aflatoxin B1，and benzo（α）pyrene

圖5 赭曲霉毒素A（A）、黃曲霉毒素B1（B）及苯并（α）芘（C）的色譜圖Fig.5 Chromatograms of ochratoxin A（A），aflatoxin B1（B）and benzo（α）pyrene（C）

2.2.3 重復(fù)性與可靠性 為了進(jìn)一步驗(yàn)證檢測(cè)器的重復(fù)性和可靠性，以赭曲霉毒素A（50.0 ng/mL）、黃曲霉毒素B1（40.0 ng/mL）、苯并（α）芘（20.0 ng/mL）為測(cè)試樣品，在“1.2”色譜條件下，分別考察檢測(cè)器在3 個(gè)激發(fā)光源（340、365、385 nm）下的重復(fù)性。結(jié)果顯示，保留時(shí)間的重復(fù)性（RSDn=11）小于0.5%，峰面積的重復(fù)性（RSDn=11）小于1.0%。

以340 nm 光源為測(cè)試對(duì)象，分別考察檢測(cè)器在震動(dòng)、高溫和低溫環(huán)境下的本身性能和對(duì)樣品響應(yīng)值的變化情況。結(jié)果顯示，在這3種環(huán)境下，檢測(cè)器的基本性能未發(fā)生明顯變化（見表3）。

表3 檢測(cè)器的可靠性測(cè)試結(jié)果Table 3 The reliability test results of detector

2.2.4 與市售熒光檢測(cè)器的對(duì)比 對(duì)比了本文的熒光檢測(cè)器（以下簡(jiǎn)稱本檢測(cè)器）與市售商品化進(jìn)口通用性熒光檢測(cè)器A 和B（以下簡(jiǎn)稱進(jìn)口A 和進(jìn)口B）的基本性能及其檢測(cè)赭曲霉毒素A、黃曲霉毒素B1、苯并（α）芘的差異性。

進(jìn)口A 的基線噪聲和漂移測(cè)試方法參考國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《JJG 705－2014 液相色譜儀》［17］及《GB/T 26792－2011 高效液相色譜儀》［18］，與本檢測(cè)器在3 個(gè)光源下的基線噪聲和漂移對(duì)比結(jié)果見表4。結(jié)果顯示，本文的熒光檢測(cè)器在3個(gè)光源下的基線噪聲和漂移指標(biāo)相當(dāng)。

表4 本檢測(cè)器與進(jìn)口A基線噪聲和漂移的對(duì)比結(jié)果Table 4 Comparison of the baseline noise and drif for the instrument in this paper and the import A

以赭曲霉毒素A、黃曲霉毒素B1和苯并（α）芘為檢測(cè)對(duì)象，對(duì)比本檢測(cè)器與進(jìn)口A 和進(jìn)口B 對(duì)其檢測(cè)的差異性。結(jié)果顯示，在實(shí)驗(yàn)條件一致的情況下，本檢測(cè)器對(duì)赭曲霉毒素A、黃曲霉毒素B1和苯并（α）芘的檢出限與進(jìn)口A 和進(jìn)口B 均在同一數(shù)量級(jí)（見表5）。表明本檢測(cè)器對(duì)3種物質(zhì)的檢測(cè)靈敏度與市售進(jìn)口通用性熒光檢測(cè)器A和B相當(dāng)。

表5 本儀器與與進(jìn)口儀器測(cè)試結(jié)果的對(duì)比Table 5 Comparison results of the instrument in this paper and the imported instruments

3 結(jié) 論

本文研制了一款LED 光源的多波長(zhǎng)誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器，以真菌毒素及苯并（α）芘作為探針進(jìn)行了系統(tǒng)評(píng)價(jià)，并與市售商品化進(jìn)口通用性熒光檢測(cè)器進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果表明，該檢測(cè)器對(duì)赭曲霉素A、黃曲霉毒素B1、苯并（α）芘的檢出限分別為0.06、0.01、0.02 ng/mL，且基線噪聲低于5.0×10－4FU，漂移小于5.0×10－3FU/h；與市售商品化通用性熒光檢測(cè)器的檢測(cè)性能相當(dāng)。本文的檢測(cè)器具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、波長(zhǎng)覆蓋范圍更寬、性能良好和成本低的特點(diǎn)，對(duì)真菌毒素和苯并（α）芘的檢測(cè)具有良好的應(yīng)用前景。