段曉宇，曾 莉，樊 睿，趙治巧，萬(wàn)玉軍，陳 惠，王 剛，唐自鐘*

1四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，雅安 625014；2四川省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計(jì)院，成都 611130

草莓(FragariaxananassaDuch.)為薔薇科薔薇亞科草莓屬宿根性多年生常綠草本植物，其果肉富含維生素和微量元素，具有很高的營(yíng)養(yǎng)經(jīng)濟(jì)價(jià)值，栽培面積和產(chǎn)量?jī)H次于葡萄。菠蘿又稱(chēng)鳳梨(Ananascomosus(L.) Merr.)，屬于鳳梨科鳳梨屬植物，其主要生長(zhǎng)在南美洲等熱帶地區(qū)，屬于世界第三大熱帶水果之一。但他們含水量較高，不宜保存，從而通過(guò)一定技術(shù)延長(zhǎng)其貨架期顯得極為重要。

酵素最初起源于日本，現(xiàn)今日日本酵素一年可達(dá)到1 000億日元以上的市場(chǎng)量[1]。酵素是以一種或多種新鮮蔬菜、水果、菌菇、中草藥等為原材料，與多種益生菌混合培養(yǎng)，最終發(fā)酵而成一種具有特定藥理功能的液體或固體，因其發(fā)酵產(chǎn)物具有較好的抗氧化能力、大分子物質(zhì)分解能力、抗衰老作用，而受到眾多研究者的關(guān)注[2]。而水果酵素因其較好的生物活性逐漸成為熱點(diǎn)，在果蔬發(fā)酵中微生物的選擇尤為重要，如酵母菌(yeast)它能夠提高食品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，而且在生長(zhǎng)過(guò)程中能夠產(chǎn)生一些保健調(diào)理的物質(zhì)，因此深受食品生產(chǎn)者的喜愛(ài)。而乳酸菌在發(fā)酵過(guò)程中能夠產(chǎn)生大量的有機(jī)酸和醇類(lèi)及各種氨基酸等代謝物，具有抑制雜菌生長(zhǎng)、促進(jìn)消化吸收、防癌等生理功效[3,4]。水果果汁的濃度對(duì)發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生酸性物質(zhì)也有重要影響，有研究表明，當(dāng)果汁加入量由30%增加到50%時(shí)，其發(fā)酵產(chǎn)酸性物質(zhì)效率明顯增強(qiáng)。酸度過(guò)高會(huì)對(duì)味覺(jué)和口腔產(chǎn)生較大刺激，而酸度過(guò)低則會(huì)影響酵素給人帶來(lái)的愉悅感，酸度作為衡量酵素發(fā)酵的一個(gè)重要指標(biāo)，將酸度控制在一定的范圍內(nèi)，能有效提高酵素的風(fēng)味。使用多種益生菌混合發(fā)酵可以進(jìn)一步改善酵素的口感風(fēng)味，考慮用乳酸菌與酵母菌共同對(duì)進(jìn)行發(fā)酵，酵母菌發(fā)酵可以產(chǎn)生醇，醇與酸反應(yīng)會(huì)轉(zhuǎn)化為酯，從而改變飲品的風(fēng)味，提高飲品給人帶來(lái)的舒適感。所以本研究采用保加利亞乳桿菌和果酒酵母復(fù)合菌種來(lái)發(fā)酵草莓菠蘿，以獲得對(duì)人體具有更高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的水果酵素。

近年來(lái)，酵素制品已成為國(guó)際市場(chǎng)的主流，目前我國(guó)酵素制品主要在河南一帶發(fā)展較好，但我國(guó)的酵素制品主要以單種蔬菜或者水果發(fā)酵占據(jù)主導(dǎo)。草莓和菠蘿單獨(dú)發(fā)酵獲得的酵素產(chǎn)品已出現(xiàn)[5,6]，但對(duì)其復(fù)合酵素筆者尚未見(jiàn)到。并且由于水果具有含較多檸檬酸和易上火等特點(diǎn)，所以筆者建議，比起單一使用某種水果，將不同種類(lèi)的水果混合搭配。合理的搭配，可以更加全面的改善身體狀況。所以開(kāi)發(fā)新型獨(dú)特的菠蘿草莓復(fù)合酵素制品具有良好的市場(chǎng)前景。因此，本研究以草莓菠蘿混合果汁為原料，同時(shí)添加酵母菌和保加利亞乳桿菌發(fā)酵制備酵素，并對(duì)其發(fā)酵前后的化學(xué)成分含量、功效酶活力、抗氧化活性和抑菌能力進(jìn)行初步研究，旨在提高草莓和菠蘿的附加值并生產(chǎn)一種具有更高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的復(fù)合酵素產(chǎn)品。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

新鮮草莓和菠蘿市售；果酒酵母、保加利亞乳桿菌(Lactobacillusbulgaricus)(四川省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計(jì)院)；枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa)、金黃色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus)、大腸桿菌(Bacilluscoli)(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)室)。

1.2 試劑與培養(yǎng)基

1，1-二苯基-2-苦基肼(DPPH)(上海源葉生物有限公司)；水楊酸(成都科龍化工試劑有限公司)；鄰苯三酚(四川西隴化工有限公司)；酚酶試劑盒和總超氧化物歧化酶試劑盒(南京建成生物工程研所)。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

LB培養(yǎng)基(液體)：蛋白胨1 g，酵母粉0.5 g，NaCl 1 g，水100 mL，121 ℃滅菌30 min；固體培養(yǎng)基在每100 mL液體培養(yǎng)基中加1.7 g瓊脂粉。

1.3 儀器與設(shè)備

DK-8D電熱恒溫水槽(上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司)；XZ18K-T高速冷凍離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司)；Multiskan Sky酶標(biāo)儀(上海合商科學(xué)儀器有限公司)；HZQ-F160振蕩培養(yǎng)箱(哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司)。其他均為實(shí)驗(yàn)室常規(guī)儀器。

1.4 方法

1.4.1 酵素制作工藝

挑選新鮮無(wú)壞的草莓和菠蘿。在無(wú)菌條件下取其果肉，對(duì)果肉進(jìn)行切塊處理，將處理好的果肉裝入已滅菌的榨汁機(jī)中榨汁，將榨汁完成的果肉按照1∶1的比例的裝入無(wú)菌發(fā)酵瓶中，再往發(fā)酵瓶中依次加入無(wú)菌水、白砂糖、酵母菌、保加利亞乳桿菌，密封復(fù)合發(fā)酵6個(gè)月后獲得草莓菠蘿復(fù)合酵素。

1.4.2 草莓菠蘿復(fù)合酵素化學(xué)成分研究

1.4.2.1 草莓菠蘿復(fù)合酵素總糖研究

參考文獻(xiàn)[7]，吸取2 mL不同濃度梯度(0～0.7 mg/mL)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別置入8只已標(biāo)號(hào)的25 mL比色管中，加1.5 mL 3，5-二硝基水楊酸(DNS)溶液，混合均勻后于100 ℃水浴鍋中水浴加熱5 min，取出，冷卻至室溫，用水稀釋至25 mL，采用酶標(biāo)儀于520 nm處測(cè)定吸光度，0號(hào)管為空白。以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為y=0.769 6x-0.007 8，R2=0.995 5。

取0.5 mL酵素液，加入2 mL 6 mol/L的鹽酸溶液，沸水浴15 min，冷卻后加入1.8 mL 6 mol/L氫氧化鈉溶液，取2 mL液體于25 mL容量瓶中，后續(xù)步驟同標(biāo)曲測(cè)定一樣。按照標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)線(xiàn)性方程y=0.769 6x-0.007 8，R2=0.995 5計(jì)算出總糖含量。

1.4.2.2 草莓菠蘿復(fù)合酵素總酚研究

參考文獻(xiàn)[7]，取8支已標(biāo)號(hào)的20 mL比色管，分別加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)液，用蒸餾水稀釋至比色管10 mL刻度線(xiàn)，每管加1 mL Folin試劑及2 mL 20% NaCO3，于100 ℃水浴鍋中水浴加熱1 min，冷卻并用水稀釋至20 mL刻度線(xiàn)，室溫放置30 min，采用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)為650 nm時(shí)，測(cè)定吸光度A為橫坐標(biāo)，濃度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為y=15.899 1x-0.202 1，R2=0.993 5。

取0.5 mL酵素液，后續(xù)步驟同標(biāo)曲測(cè)定一樣?？偡雍恳詻](méi)食子酸計(jì)，按標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程y=15.899 1x-0.202 1，R2=0.993 5計(jì)算總酚含量。

1.4.2.3 草莓菠蘿復(fù)合酵素總黃酮研究

參考文獻(xiàn)[8]，吸取0.2 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0～0.50 mL于6 支干凈試管中，分別加入2.5 mL 70%乙醇，0.15 mL 5%的NaNO2溶液，混合均勻在室溫下靜置6 min；隨后加入0.3 mL 10%的AlCl3溶液搖勻靜置5 min；再加入1.00 mL的1 mol/L的NaOH溶液；最后補(bǔ)水至總體積為5.00 mL，振蕩均勻；于370 nm測(cè)定各管的吸光值。以吸光度(A)作為縱坐標(biāo)，蘆丁濃度作為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)y=1.350 5x-0.004 41，R2=0.995 2。

準(zhǔn)確吸取0.5 mL酵素液；后續(xù)步驟同標(biāo)曲測(cè)定一樣。按標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程y=1.350 5x-0.004 41，R2=0.995 2計(jì)算總黃酮含量。

1.4.2.4 蛋白質(zhì)的測(cè)定

參照Chen等方法[9]測(cè)定草莓菠蘿復(fù)合酵素發(fā)酵液中蛋白質(zhì)含量。以牛血清蛋白濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制線(xiàn)性方程y=0.005 5x+0.064，R2=0.999 4。

1.4.3 功效酶活力的測(cè)定

1.4.3.1 淀粉酶和T-SOD活力測(cè)定

淀粉酶和T-SOD分別嚴(yán)格參照碘-淀粉比色法的試劑盒和總超氧化物歧化酶活力測(cè)定試劑盒的操作步驟進(jìn)行。

1.4.3.2 蛋白酶活力測(cè)定

借鑒酪蛋白消化法測(cè)定酶活性[10]，使用公式(1)計(jì)算蛋白酶活力值。

蛋白酶活力(U/mL)=AK×4/10×N

(1)

式中：A為實(shí)驗(yàn)組酵素液的吸光度；K為吸光度等于1時(shí)酪氨酸的量；4為反應(yīng)溶液的總體積，mL；10為反應(yīng)時(shí)間，min；N酶液稀釋總倍數(shù)。

1.4.3.3 脂肪酶活力測(cè)定

參考Dong等[11]的方法測(cè)定脂肪酶活力，使用公式(2)計(jì)算脂肪酶活力值。

X=(B-A)×C/0.05×50×1/15×n=

200/3×(B-A)×C×n

(2)

式中：X為樣品的酶活力，U/mL；B為滴定樣品時(shí)消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；A為滴定空白時(shí)消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；C為氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，mol/L；0.05為氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度換算系數(shù)；50為0.05 mol/L氫氧化鈉溶液1.00 mL相當(dāng)于脂肪酸50 μmol；1/15為反應(yīng)時(shí)間15 min，以1 min計(jì)；n為稀釋倍數(shù)。

1.4.4 草莓菠蘿復(fù)合酵素抗氧化活性測(cè)定

1.4.4.1 對(duì)DPPH自由基清除能力的測(cè)定

在酶標(biāo)板上，按樣品稀釋倍數(shù)梯度，分別加入0.2 mmol/L DPPH-乙醇溶液100 μL和梯度樣品溶液100 μL混勻，室溫避光靜置30 min后，于λ=517 nm處測(cè)OD值，以無(wú)水乙醇作調(diào)零。每組做三個(gè)平行組，使用公式(3)計(jì)算DPPH自由基清除率。

DPPH自由基清除率=[(A1-A2)/A1]×100%

(3)

式中：A1為對(duì)照組吸光度；A2為樣品組吸光度。

1.4.4.2 對(duì)OH自由基清除能力的測(cè)定

參照Yao等[12]的方法測(cè)定酵素對(duì)OH自由基清除能力，使用公式(4)計(jì)算OH自由基清除率。

OH自由基清除率=[1-(A1-A2)/A0]×100%

(4)

式中：A1為樣品組吸光度；A2為本底吸光度；A0為空白對(duì)照吸光度。

1.4.4.3 對(duì)ABTS自由基清除能力的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)前用無(wú)水乙醇稀釋ABTS儲(chǔ)備液至吸光度A為7±0.02。取10 mL EP管編號(hào)，分別加入1 mL ABTS溶液和100 μL梯度樣品溶液混勻，靜置6 min，吸取上清液200 μL在酶標(biāo)板上進(jìn)行點(diǎn)樣，以無(wú)水乙醇作為空白對(duì)照，在λ=734 nm處測(cè)量各實(shí)驗(yàn)組的吸光度。每組做三個(gè)平行組，使用公式(5)計(jì)算ABTS自由基清除率。

ABTS自由基清除率=[(A1-A2)/A1]×100%

(5)

式中：A1為對(duì)照組吸光度；A2為樣品組吸光度。

1.4.4.4 對(duì)超氧陰離子自由基清除能力的測(cè)定

取10 mL EP管編號(hào)，分別加入3 mL的濃度為0.05 mol/L的Tris-HCl緩沖液(pH 8.2)和不同稀釋濃度的酵素樣品1 mL，充分混合均勻在25 ℃的恒溫水浴鍋中水浴20 min后，加入同樣預(yù)溫至25 ℃的25 mmol/L的鄰苯三酚0.4 mL，混合均勻后反應(yīng)4 min，最后加入0.5 mL濃鹽酸終止反應(yīng)，在325 nm處測(cè)吸光度值A(chǔ)1，以蒸餾水代替樣品，同樣條件反應(yīng)測(cè)A2，蒸餾水調(diào)零。每組作三個(gè)平行，使用公式(6)計(jì)算超氧陰離子自由基清除率。

超氧陰離子自由基清除率=

[1-(A1-A2)/A0]×100%

(6)

式中：A1為樣品組吸光度；A2為本底吸光度；A0為空白對(duì)照吸光度。

1.4.5 草莓菠蘿復(fù)合酵素體外抑菌活性研究

本研究以枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和綠膿桿菌四種病原菌為指示菌，根據(jù)實(shí)驗(yàn)測(cè)量得到的抑菌圈直徑大小來(lái)評(píng)估樣品對(duì)不同病原菌的抑菌能力。取直徑85.00 mm左右平板，每個(gè)平板倒入15 mL完成配置的LB瓊脂備用。取200 μL病原菌菌懸液，用無(wú)菌曲玻棒使之均勻鋪于培養(yǎng)基表面，然后將滅菌牛津杯(內(nèi)徑6.00 mm，外徑7.80 mm，高10.00 mm)置于平板內(nèi)，每板3只。用滅菌移液器分別將200 μL樣品液、200 μL 10 mg/mL氨芐青霉素工作液(陽(yáng)性對(duì)照)和200 μL無(wú)菌水(陰性對(duì)照)注入牛津杯內(nèi)，將平碟蓋好，置于37 ℃恒溫箱培養(yǎng)24 h后用游標(biāo)卡尺(精度為0.02 mm)量取抑菌圈大小，觀(guān)察抑菌效果。平行實(shí)驗(yàn)三次，測(cè)量實(shí)驗(yàn)抑菌圈的直徑，取三次平行實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值作為最終結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 草莓菠蘿復(fù)合酵素功能營(yíng)養(yǎng)成分

酵素品質(zhì)的好壞與其內(nèi)所含的化學(xué)成分密切相關(guān)。如圖1所示，發(fā)酵6個(gè)月后獲得的草莓菠蘿酵素中總糖、總酚和蛋白質(zhì)的含量分別從起初的0.65±0.044、0.06±0.002和0.10±0.005 mg/mL降低了75%、50%和80%。發(fā)酵過(guò)程中，微生物一般利用原料中的蔗糖、葡萄糖和果糖等單糖或雙糖作為碳源。在發(fā)酵初期，微生物會(huì)利用水果自身的糖類(lèi)和外源糖類(lèi)進(jìn)行生理活動(dòng)，在適宜的發(fā)酵條件下微生物繁殖較快，并通過(guò)一系列代謝反應(yīng)消耗了大量的可溶性糖，從而使總糖含量下降。從理論上講，作為抗氧化物質(zhì)的總酚，其在發(fā)酵過(guò)程中的含量應(yīng)該表現(xiàn)為先上升后下降的趨勢(shì)。因?yàn)榘l(fā)酵前期原料中酚類(lèi)物質(zhì)溶出，而隨著發(fā)酵的進(jìn)行，在有氧情況下被發(fā)酵液中酚類(lèi)會(huì)被多酚氧化酶氧化，從而使酵素中總酚含量的降低。Yang等[13]在蘋(píng)果酵素的研究中發(fā)現(xiàn)，總酚含量在發(fā)酵第21天達(dá)到最大值，之后持續(xù)下降?？偡雍康臏p少的可能是因?yàn)榉宇?lèi)化合物與發(fā)酵液中的蛋白質(zhì)結(jié)合或吸附起來(lái)形成沉淀，導(dǎo)致離心后的酵素液中總酚含量變少或者是因?yàn)榉宇?lèi)化合物可以和發(fā)酵液中的有機(jī)酸發(fā)生反應(yīng)，生成其他物質(zhì)[14]。研究也表明，在發(fā)酵過(guò)程中一定濃度的酚類(lèi)物質(zhì)會(huì)抑制微生物的生長(zhǎng)代謝，而微生物為了維持自身生長(zhǎng)會(huì)降解酚類(lèi)，從而使總酚含量降低[13]。發(fā)酵后期蛋白質(zhì)對(duì)微生物的生理活動(dòng)極為重要，此時(shí)糖類(lèi)基本已耗盡，蛋白質(zhì)作為氮源被微生物利用，也有可能在發(fā)酵過(guò)程中，微生物通過(guò)代謝活動(dòng)產(chǎn)生蛋白酶，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)含量的降低。在微生物的生長(zhǎng)過(guò)程中，時(shí)常伴隨著活性肽、短鏈脂肪酸和多糖等物質(zhì)生成，糖類(lèi)物質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)減少，酚類(lèi)物質(zhì)被分解利用，最終轉(zhuǎn)化為具有附加生物價(jià)值的物質(zhì)如黃酮等具有良好生物活性的物質(zhì)[15]，所以復(fù)合酵素中用來(lái)表征酵素抗氧化活性的一個(gè)重要指標(biāo)黃酮類(lèi)化合物從最初的0.07±0.004 mg/mL提高了63%。黃酮類(lèi)化合物因結(jié)構(gòu)的不同而具有不同的生理功能，當(dāng)作為抗氧化劑時(shí)，可以提高機(jī)體清除自由基能力，減少組織細(xì)胞的氧化損傷并且可以調(diào)節(jié)DNA、蛋白質(zhì)等物質(zhì)的合成，免受衰老因子的損傷；當(dāng)作為信號(hào)因子時(shí)，可以調(diào)節(jié)基因表達(dá)，改善衰老機(jī)體代謝情況[15]。因此，在草莓菠蘿復(fù)合酵素中黃酮類(lèi)化合物含量的上升的情況下，我們可以初步推測(cè)其具有清除體內(nèi)自由基、延緩衰老的潛能。

圖1 草莓菠蘿復(fù)合酵素化學(xué)成分Fig.1 Chemical constituents of strawberry-pineapple complex Jiaosu注：未發(fā)酵指草莓菠蘿混合果汁；發(fā)酵指草莓菠蘿酵素，下同。 Note:Unfermented means strawberry and pineapple mixed juice; Fermentation refers to strawberry-pineapple Jiaosu.The same below.

2.2 草莓菠蘿復(fù)合酵素的功效酶

蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶可以將大分子的蛋白質(zhì)、脂肪和淀粉分解為小分子物質(zhì)，從而更有利于腸胃消化吸收；而具有抗氧化作用的一種金屬酶SOD可以清除機(jī)體產(chǎn)生的超氧陰離子，使后者發(fā)生歧化反應(yīng)產(chǎn)生對(duì)機(jī)體無(wú)害的氧氣和過(guò)氧化氫。由圖2可知，發(fā)酵6個(gè)月后，草莓菠蘿復(fù)合酵素中的淀粉酶、T-SOD和脂肪酶分別由起初的0.076±0.005、53.86±1.52和1.31±0.214 U/mL增加至0.086±0.006、95.57±4.58和6.24±1.781 U/mL。與Wang[16]、Zhang[17]等對(duì)青梅酵素和市售酵素的SOD活性測(cè)定分別為75.64 U/mL和41.7 U/mL相比，草莓菠蘿復(fù)合酵素的SOD酶活力更高。并且在發(fā)酵后，T-SOD活力接近增加了一倍，因此本研究所得的復(fù)合酵素在體內(nèi)具有很好的清除自由基的能力，具有很好的保健和美容功效；與Dong等[11]對(duì)火龍果酵素的脂肪酶活力測(cè)1.8±0.3U/mL相比，草莓菠蘿復(fù)合酵素的脂肪酶活力較高，這說(shuō)明草莓菠蘿復(fù)合酵素對(duì)脂肪的消化能力更強(qiáng)。所以草莓菠蘿復(fù)合酵素在醫(yī)藥、美容行業(yè)具有很大的推廣應(yīng)用價(jià)值。但其蛋白酶活力由起初的57.14±4.45 U/mL降低到2.67±0.57 U/mL，這便與前面蛋白質(zhì)含量變化所一致，即蛋白酶活力的下降減少了對(duì)樣品中蛋白質(zhì)的分解能力，從而使其含量增加。分析原因可能是發(fā)酵過(guò)程中加入的酵母菌與乳酸菌大規(guī)模生長(zhǎng)導(dǎo)致酵素pH值急劇下降，最終導(dǎo)致蛋白酶活力大幅度降低。

圖2 草莓菠蘿復(fù)合酵素功效酶活力Fig.2 Efficacy enzyme activity of strawberry-pineapple complex Jiaosu

2.3 草莓菠蘿復(fù)合酵素的體外生物學(xué)活性研究

2.3.1 草莓菠蘿復(fù)合酵素對(duì)DPPH自由基的清除能力

本研究將發(fā)酵前后的樣品用溶劑稀釋成一定的體積濃度梯度(0.8%～10.4%)，由圖3可知，各樣品隨著其體積濃度的增加對(duì)DPPH自由基(DPPH·)的清除能力也有所增加。發(fā)酵前樣品對(duì)DPPH自由基的清除能力從6.44%±0.88%增加至96.24%±0.305%，發(fā)酵后的草莓菠蘿酵素對(duì)DPPH自由基的清除能力從61.18%±0.23%降低至14.14%±3.08%。因此我們發(fā)現(xiàn)在微生物的生長(zhǎng)過(guò)程中，樣品中對(duì)DPPH自由基具有清除能力的物質(zhì)被分解或消耗。Chen等[5]研究草莓酵素的抗氧化性變化發(fā)現(xiàn)酵素液對(duì)DPPH自由基清除率與發(fā)酵液中總酚含量具有相似的變化趨勢(shì)，說(shuō)明酵素對(duì)DPPH自由基的清除能力與酚酸類(lèi)化合物之間有一定的相關(guān)性。所以發(fā)酵降低了樣品對(duì)DPPH自由基的清除能力可能與發(fā)酵過(guò)程中酵素液中總酚含量下降有關(guān)。

圖3 草莓菠蘿復(fù)合酵素對(duì)DPPH自由基的清除能力Fig.3 Scavenging activity of strawberry-pineapple complex Jiaosu on DPPH·

2.3.2 草莓菠蘿復(fù)合酵素對(duì)OH自由基的清除作用

OH自由基(·OH)是活性氧中化學(xué)性質(zhì)最活潑的自由基，它能夠與活細(xì)胞中大多數(shù)具有還原性的生物大分子發(fā)生劇烈反應(yīng)，是對(duì)機(jī)體危害最大的自由基。由圖4可知，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)(2%～14%)，樣品對(duì)·OH的清除率呈濃度依賴(lài)性。發(fā)酵前樣品對(duì)·OH的清除能力從34.10%±0.46%增加至59.99%±2.16%，發(fā)酵后的草莓菠蘿酵素對(duì)·OH的清除能力26.74%±3.04%增加至85.91%±2.69%。Ng等[18]研究表明，黃酮類(lèi)化合物對(duì)·OH有較好的清除能力，其清除能力的強(qiáng)弱取決于芳香環(huán)上羥基的數(shù)目和位置。由圖1可知草莓菠蘿酵素發(fā)酵后總黃酮含量提升為發(fā)酵前的三倍，在發(fā)酵過(guò)程中可能由于微生物的生長(zhǎng)使發(fā)酵液中的酚類(lèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)化為黃酮類(lèi)物質(zhì)，同時(shí)導(dǎo)致了黃酮類(lèi)化合物芳香環(huán)上羥基的數(shù)目和位置發(fā)生相應(yīng)改變，最終使發(fā)酵后酵素對(duì)·OH的清除率變高。

圖4 草莓菠蘿復(fù)合酵素對(duì)OH自由基的清除能力Fig.4 Scavenging activity of strawberry-pineapple complex Jiaosu on ·OH

2.3.3 草莓菠蘿復(fù)合酵素對(duì)ABTS自由基的清除作用

ABTS自由基(ABTS+·)清除法被廣泛用于生物樣品的總抗氧化能力測(cè)定。在反應(yīng)體系中，ABTS經(jīng)氧化后生成相對(duì)穩(wěn)定的藍(lán)綠色的ABTS水溶性自由基，當(dāng)其遇到自由基清除劑時(shí)，ABTS的顏色變淺，特征吸光度降低，吸光度越低。因此，通過(guò)測(cè)定吸光度的變化來(lái)體現(xiàn)對(duì)ABTS自由基的清除效果，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 草莓菠蘿復(fù)合酵素對(duì)ABTS自由基的清除能力Fig.5 Scavenging activity of strawberry-pineapple complex Jiaosu on ABTS+·

由圖5可知，在ABTS測(cè)試體系中未發(fā)酵的樣品和發(fā)酵后的草莓菠蘿復(fù)合酵素清除ABTS自由基能力的差異顯著。當(dāng)體積濃度為2%時(shí)，未發(fā)酵的樣品對(duì)ABTS自由基清除率為9.74%±1.60%，而發(fā)酵后的草莓菠蘿復(fù)合酵素對(duì)ABTS自由基的清除率為4.28%±1.63%；且當(dāng)體積濃度為14%時(shí)，未發(fā)酵樣品的清除率65.32%±1.06%仍強(qiáng)于草莓菠蘿酵素的清除能力23.52%±0.75%。Jiang等[19]對(duì)葡萄酵素天然發(fā)酵過(guò)程中體外抗氧化活性研究發(fā)現(xiàn)，總酚含量與ABTS自由基清除能力具有顯著的相關(guān)性。發(fā)酵過(guò)程中ABTS自由基清除能力的變化可能與總酚含量的變化有關(guān)。由圖1可知，未發(fā)酵樣品中總酚含量為發(fā)酵后樣品的兩倍，且未發(fā)酵樣品對(duì)ABTS自由基的清除能力約為發(fā)酵后樣品的兩倍，所以發(fā)酵后酵素對(duì)ABTS自由基清除能力下降可能是由于微生物的生長(zhǎng)使發(fā)酵液中的酚類(lèi)物質(zhì)被分解，導(dǎo)致酚類(lèi)物質(zhì)的產(chǎn)量小于消耗量，最終體現(xiàn)為發(fā)酵后樣品對(duì)ABTS自由基清除能力下降。

2.3.4 草莓菠蘿復(fù)合酵素對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用

由圖6知，發(fā)酵后草莓菠蘿復(fù)合酵素對(duì)超氧陰離子清除能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于未發(fā)酵的樣品。當(dāng)體積濃度為10%時(shí)，未發(fā)酵樣品對(duì)超氧陰離子的清除率為26.75%±1.54%，而此時(shí)草莓菠蘿復(fù)合酵素的清除率已達(dá)到79.72%±1.17%。隨著體積濃度的增加(20%～70%)，未發(fā)酵樣品對(duì)自由基的清除率與體積濃度呈正相關(guān)，而復(fù)合酵素對(duì)超氧陰離子的清除能力趨于平穩(wěn)狀態(tài)。當(dāng)體積濃度達(dá)到最大(70%)時(shí)，兩者的清除率分別為45.58%±1.77%和98.34%±0.57%。Zhang等[20]研究表明，隨著苯環(huán)上羥基數(shù)目的增加，黃酮類(lèi)化合物抑制超氧陰離子的能力增強(qiáng)，并且SOD對(duì)清除超氧陰離子自由基也有著重要作用。由圖2可知發(fā)酵后草莓菠蘿復(fù)合酵素中T-SOD活力增加了近一倍，所以樣品發(fā)酵后對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力大幅提升可能與發(fā)酵過(guò)程中微生物產(chǎn)生大量SOD和多羥基取代或3羥基取代的黃酮類(lèi)化合物的大量合成有關(guān)。

圖6 草莓菠蘿復(fù)合酵素對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力Fig.6 Scavenging activity of strawberry-pineapple

本研究采用常見(jiàn)的四種自由基體系對(duì)發(fā)酵前后的草莓菠蘿復(fù)合酵素體外抗氧化能力進(jìn)行較為全面的研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照相比，草莓菠蘿酵素對(duì)羥自由基和超氧陰離子自由基的清除能力增強(qiáng)，對(duì)DPPH和ABTS自由基的清除能力減弱。復(fù)合酵素對(duì)不同自由基清除效果表現(xiàn)出差異，這是因?yàn)榭寡趸瘎┗衔锟梢酝ㄟ^(guò)不同的機(jī)制，在反應(yīng)基質(zhì)中每個(gè)有其特定的目標(biāo)。因此，在各種化學(xué)測(cè)試不同的化學(xué)反應(yīng)活性可能導(dǎo)致不同程度的抗氧化能力[21]。

2.4 草莓菠蘿復(fù)合酵素的抑菌活性

如圖7所示，發(fā)酵前的樣品對(duì)四種病原菌均無(wú)抑菌能力而發(fā)酵后的草莓菠蘿復(fù)合酵素對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和枯草芽孢桿菌均有一定的抑制效果，且抑菌效果為金黃色葡萄球菌(29.60±1.41 mm)>大腸桿菌(29.33±1.66 mm)>綠膿桿菌(27.67±1.34 mm)>枯草芽孢桿菌(14.63±2.11 mm)。發(fā)酵后樣品抑菌能力增加可能與發(fā)酵過(guò)程中醋酸、皂苷和硫化物等物質(zhì)的產(chǎn)生有關(guān)[22,23]，而且也可能與乳酸菌合成具有抗菌性能的代謝產(chǎn)物如乳酸和乙酸、脂肪酸、過(guò)氧化氫或雙乙酰以及抗菌蛋白如細(xì)菌素肽聚糖水解酶等發(fā)揮抗菌作用有關(guān)[24]；而對(duì)革蘭氏陰性菌(大腸桿菌)和革蘭氏陽(yáng)性菌(金黃色葡萄球菌)的抗菌活性較強(qiáng)，主要是由于有機(jī)酸中存在乙酸所致[25]。枯草芽孢桿菌細(xì)胞壁表面附有莢膜且能產(chǎn)生孢子，由此推測(cè)，具有抑菌特性的生物活性物質(zhì)很難穿過(guò)莢膜作用于細(xì)菌內(nèi)部，所以草莓菠蘿復(fù)合酵素對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制效果最弱。

圖7 發(fā)酵前后草莓菠蘿復(fù)合酵素的抑菌實(shí)驗(yàn)Fig.7 Inhibition experiment of strawberry-pineapple complex Jiaosu on bacteria注：A：10 mg/mL氨芐青霉素；S：樣品液；H：無(wú)菌水。Note:A:10 mg/mL ampicillin;S:Sample solution;H:Sterile water.

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)乳酸菌和酵母菌復(fù)合發(fā)酵讓發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的酸類(lèi)物質(zhì)和醇類(lèi)物質(zhì)盡量中和，使復(fù)合酵素口味和風(fēng)味都得到了改善。復(fù)合發(fā)酵后草莓菠蘿復(fù)合酵素中總黃酮含量提升1.5倍，對(duì)羥自由基和超氧陰離子自由基的清除能力均有較大提升，10.4%的草莓菠蘿復(fù)合酵素對(duì)DPPH自由基的清除率達(dá)到58%，與Chen[5]報(bào)道的發(fā)酵30天后的草莓酵素對(duì)DPPH自由基的清除率相當(dāng)，14%的草莓菠蘿復(fù)合酵素對(duì)·OH的清除率高達(dá)88%，而Zhao[6]報(bào)道的56%菠蘿酵素對(duì)·OH的清除率僅有60%左右，與Chen[5]對(duì)草莓酵素發(fā)酵后的羥自由基清除作用測(cè)定為除率達(dá)到最高值76.44%相比，草莓菠蘿復(fù)合酵素的羥自由基清除率更高，20%的草莓菠蘿酵素對(duì)超氧陰離子自由基的清除率已達(dá)100%，而Zhao[6]報(bào)道的70%的菠蘿酵素對(duì)超氧陰離子自由基的清除率不到90%，并且在發(fā)酵后其T-SOD活力接近增加了一倍，脂肪酶活力大幅度提升。以上說(shuō)明草莓菠蘿復(fù)合酵素與草莓酵素和菠蘿酵素相比具有更好的清除自由基的能力，能夠在保健和美容方面發(fā)揮較好功效。草莓菠蘿復(fù)合酵素融合了草莓和菠蘿這兩種水果各自的特性，取長(zhǎng)補(bǔ)短，可以更全面地調(diào)理使用者身體。因此這種新型功能性酵素飲料不僅對(duì)人體清除自由基、分解大分子物質(zhì)上具有一定的效果，而且在醫(yī)藥研發(fā)和化妝品等領(lǐng)域具有一定的推廣應(yīng)用價(jià)值，除此之外其還有助于加深人們對(duì)于天然功能性食品的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)。