劉鐵成陳有嗣楊金琛劉洪麗曾 航赫英姿王立石牛雄雷

(1.遼寧省蠶業(yè)科學(xué)研究所,遼寧 鳳城 118100; 2.遼寧省蠶藥專業(yè)技術(shù)創(chuàng)新中心,遼寧 鳳城 118100)

柞蠶空胴病又稱軟化病,俗稱“稀屎腚”[1～5]。柞蠶空胴病致病菌為柞蠶鏈球菌,現(xiàn)歸屬為柞蠶腸球菌(文中按傳統(tǒng)習(xí)慣,均稱之為柞蠶鏈球菌)[6～8]。柞蠶鏈球菌既可通過(guò)卵面?zhèn)鞑?也可較長(zhǎng)時(shí)間存活于蠶場(chǎng)土壤、枯落物中,引起柞蠶世代之間的水平傳播[9],還存在于20余種蠶場(chǎng)共生昆蟲中,可引起蠶場(chǎng)共生昆蟲與柞蠶的交叉?zhèn)魅綶10]。因此,該病害發(fā)生較為普遍,在遼寧蠶區(qū)空胴病發(fā)病率可達(dá)年均30%～40%,嚴(yán)重時(shí)可達(dá)70%以上。

對(duì)于其防治,現(xiàn)有防治措施主要基于嚴(yán)格的選蛾留種和采用醛類或氯制劑進(jìn)行消毒,降低該病菌的卵面?zhèn)鞑ワL(fēng)險(xiǎn)[11～14]。但是,對(duì)于蠶期葉面取食感染環(huán)節(jié)的防控,零星報(bào)道見(jiàn)于蠶得樂(lè)、蠶康寧等,蠶農(nóng)反饋其生產(chǎn)應(yīng)用效果不盡如人意[15～16]。近年,受異噻唑啉酮類型藥劑在家蠶防病領(lǐng)域應(yīng)用的啟發(fā)[17],開(kāi)發(fā)非醛類或非氧化消毒劑類型的防治藥劑引起了我們的關(guān)注。

苯并異噻唑啉酮(Benzisothiazolinone 以下簡(jiǎn)稱BIT)是一類作用溫和的、廣譜、高效殺菌劑[18]。前期工作表明,盡管離體條件下125 mg/L BIT處理可完全殺滅柞蠶鏈球菌,但室內(nèi)養(yǎng)蠶試驗(yàn)表明其活體防治活性不理想,使用濃度1 000 mg/L 1次用藥防效為61.2%,使用濃度500 mg/L 2次用藥防效僅為84.1%。究其原因,從藥物代謝角度分析,或許是因?yàn)锽IT易溶于水,其滯留蠶體難而代謝排出易,藥效作用時(shí)間相對(duì)較短。從結(jié)構(gòu)決定活性角度分析,BIT易溶于水源自其結(jié)構(gòu)中親水性結(jié)構(gòu)——較活潑的N-H鍵。若將其酰化則可提升化合物的疏水性,而疏水性改變?nèi)绾斡绊懟衔锏姆乐位钚詣t值得探索。因此,首先我們采用計(jì)算軟件確證設(shè)計(jì)化合物的疏水性參數(shù)LogP獲得較大范圍的調(diào)控,挑選代表性結(jié)構(gòu)和原料易得的化合物進(jìn)行了合成,然后在確認(rèn)化合物結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上,進(jìn)行了衍生物的離體和活體抑菌活性測(cè)定,相關(guān)結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器與器材

SQP型電子天平、THZ-82振蕩培養(yǎng)箱(常州國(guó)華電器有限公司)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)、電磁攪拌油浴鍋(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司),移液器、E100顯微鏡(日本Nikon)、SC-3610低速離心機(jī)(科大創(chuàng)新中佳分公司)、養(yǎng)蟲盒、100 mm培養(yǎng)皿。

1.1.2 化學(xué)試劑

BIT、乙酰氯、丙酰氯、丁酰氯、戊酰氯、己酰氯、庚酰氯、苯甲酰氯、4-氟苯甲酰氯、2-氟苯甲酰氯、4-甲基苯甲酰氯、4-氯苯甲酰氯、無(wú)水吡啶均購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;蔗糖、蛋白胨、氯化鈉、牛肉粉、硫酸鈉、石油醚和乙酸乙酯購(gòu)自沈陽(yáng)國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 供試菌種及試蠶

試蠶柞蠶品種為9906,由本單位保存繁育;供試菌種柞蠶鏈球菌(Streptocouccuspernyisp.Nov.)由遼寧省蠶業(yè)科學(xué)研究所柞蠶保護(hù)研究室提供。

1.2 試驗(yàn)方法

化合物的設(shè)計(jì):利用Molinspiration Cheminformatics網(wǎng)絡(luò)開(kāi)放軟件JME Molecular Editior,輸入擬合成化合物的結(jié)構(gòu),計(jì)算獲得化合物的正辛醇/水分配系數(shù)對(duì)數(shù)值(LogP)[19～21],作為合成選擇依據(jù)。

化合物的合成: 參照文獻(xiàn),以XA1為例,制備BIT乙?；a(chǎn)物[22]。 稱取10.08 g BIT(0.067 mol),置于配備攪拌磁子、溫度計(jì)和冷凝器的100 ml三口瓶,向三口瓶中加入45 ml二氯甲烷、9.0 g無(wú)水吡啶,冰水浴攪拌下,用恒壓滴加器滴加7.13 g乙酰氯(0.090 mol)與5 ml的二氯甲烷混合溶液,30 min滴加完畢,然后室溫反應(yīng)1 h。反應(yīng)結(jié)束將反應(yīng)混合液倒入分液漏斗中,采用60 ml蒸餾水洗滌3次,有機(jī)相經(jīng)無(wú)水硫酸鈉干燥,過(guò)濾,減壓蒸餾脫除溶劑,得到白色固體。按照相似方法,可制備表2中所有化合物;不同的是:反應(yīng)時(shí)將原料乙酰氯變?yōu)楸Ｂ?、丁酰氯、戊酰氯、己酰氯、庚酰氯、苯甲酰氯?-氟苯甲酰氯、2-氟苯甲酰氯、4-甲基苯甲酰氯、4-氯苯甲酰氯,依次編號(hào)為XA2～11。

化合物的表征:采用WRS-1A(1B)數(shù)字熔點(diǎn)儀(上海精科公司產(chǎn))測(cè)定化合物的熔點(diǎn)(溫度未校正);采用AvanceⅢ 400核磁共振儀(Bruker公司產(chǎn))測(cè)定化合物的1H-NMR譜。

1.3 化合物的抑菌活性測(cè)定方法

涂平板數(shù)菌落法測(cè)定衍生物離體抑菌活性 取5 ml離心管,將3 200 μl液體培養(yǎng)基(組成以1 000 ml為例,蔗糖20 g、蛋白胨20 g、氯化鈉5 g、牛肉粉5 g,加蒸餾水至1 000 ml,用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH=9,121 ℃濕熱滅菌30 min。)中 加 入 400 μl菌 液、400 μl不 同 濃 度(500 mg/L、125 mg/L、62.50 mg/L、31.25 mg/L、15.625 mg/L)的化合物DMSO溶液,在漩渦混勻儀上混合均勻,柞蠶鏈球菌的終濃度為1.8×107CFU/ml;加樣操作在2 h內(nèi)完成,以上混合液在振蕩培養(yǎng)箱中37 ℃、130 r/min條件下培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后將混合液分別逐級(jí)稀釋至1 000倍,用移液器取1 000倍稀釋液100 μl涂平板(固體培養(yǎng)基組成以1 000 ml為例,蔗糖20 g、蛋白胨20 g、氯化鈉5 g、牛肉粉5 g,加蒸餾水至1 000 ml,用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH=9,瓊脂20 g,121 ℃濕熱滅菌30 min。較液體培養(yǎng)基比含有2%瓊脂),涂菌平板置于培養(yǎng)箱中37 ℃下培養(yǎng)24 h后取出查數(shù)菌落個(gè)數(shù)?？瞻讓?duì)照CK即將藥液替換為無(wú)菌水。藥劑處理抑菌率計(jì)算公式:

瓊脂孔穴擴(kuò)散法測(cè)定抑菌圈:制備含菌平板(固體培養(yǎng)基組成以1 000 ml為例,蔗糖20 g、蛋白胨20 g、氯化鈉5 g、牛肉粉5 g,加蒸餾水至1 000 ml,用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH=9,瓊脂15 g加熱溶解。)將培養(yǎng)基趁熱分裝到試管中,每試管12.5 ml,封口后121 ℃濕熱滅菌30 min。滅菌后待培養(yǎng)基溫度降至55 ℃時(shí),每試管加入濃度為6.5×106CFU/ml柞蠶鏈球菌液125 μl,迅速震蕩均勻后倒入90 mm培養(yǎng)皿(每皿一次同時(shí)倒2只試管)冷卻后制成含菌平板,于-4 ℃中冷藏備用。用無(wú)菌打孔器在每個(gè)含菌平板上均勻打9個(gè)孔,每孔加入5 μl不同濃度(500 mg/L、1 000 mg/L)的化合物DMSO溶液,每種藥液加3孔。加藥后在室溫下擴(kuò)散2 h,之后于37 ℃培養(yǎng)24h。培養(yǎng)結(jié)束后用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑?？瞻讓?duì)照CK即將藥液替換為DMSO。

圖1 BIT酰胺衍生物合成路線

化合物柞蠶體內(nèi)抑菌活性測(cè)定:5月于遼寧鳳城市室外,將柞蠶品種9906的無(wú)菌種卵置于柞樹(shù)孵化,得到蟻蠶試蟲,記作試蟲A。室內(nèi),將新采摘的帶葉樹(shù)枝置于含水的海綿底座,將新培養(yǎng)分離提純的鏈球菌加無(wú)菌水稀釋至1×108CFU/ml后,噴施上述柞葉,待葉面菌液晾干后將1～2日齡的蟻蠶分散于樹(shù)葉,待柞蠶取食含菌樹(shù)葉48 h后得到添食柞蠶鏈球菌的蟻蠶試蟲,記作試蟲B。

藥劑處理:每處理隨機(jī)挑選試蟲B 15頭,置于單個(gè)養(yǎng)蟲盒中;在噴壺中將實(shí)施例2或?qū)嵤├?中制備的化合物乳油加無(wú)菌水稀釋至相應(yīng)濃度,噴施于柞樹(shù)葉面至布滿霧滴,0.5 h內(nèi)晾干后采摘加入養(yǎng)蟲盒,由試蟲取食48 h以上,每處理設(shè)3次重復(fù);每個(gè)化合物分別設(shè)置2個(gè)處理濃度(500 mg/L、1 000 mg/L)。養(yǎng)蟲盒中試蟲經(jīng)過(guò)一次藥劑處理之后,放置不經(jīng)藥物處理的新鮮柞樹(shù)葉飼養(yǎng)至四齡期。期間,跟蹤標(biāo)記,清除蠶沙和雜物,適時(shí)添食新鮮柞樹(shù)葉,及時(shí)剔除發(fā)病或死亡試蠶,調(diào)查各處理剩余蠶數(shù),累計(jì)空胴病發(fā)病或死亡蠶總數(shù)N,計(jì)算發(fā)病率。

對(duì)照處理:在單個(gè)養(yǎng)蟲盒放置試蟲B 15頭,采用不經(jīng)藥劑處理的新鮮柞樹(shù)葉喂養(yǎng),設(shè)3次重復(fù),作為空胴病毒對(duì)照CK-D;在養(yǎng)蟲盒正常飼養(yǎng)試蟲A 15頭,采用不經(jīng)藥劑處理的新鮮柞樹(shù)葉喂養(yǎng),3次重復(fù),作為空胴病空白對(duì)照CK-0。跟蹤標(biāo)記,清除蠶沙和雜物,適時(shí)添食新鮮柞樹(shù)葉,及時(shí)剔除發(fā)病或死亡試蠶,飼養(yǎng)至四齡期,調(diào)查各處理剩余蠶數(shù),累計(jì)空胴病發(fā)病或死亡蠶總數(shù)N。

空胴病發(fā)病率、防效計(jì)算公式如下:

2 結(jié)果與討論

2.1 BIT酰胺衍生物的設(shè)計(jì)合成與結(jié)構(gòu)表征

2.1.1 BIT酰胺衍生物的設(shè)計(jì)合成

采用JME Molecular Editior計(jì)算得到的化合物參數(shù)如表1所示,可見(jiàn),對(duì)于取代基R為烷基,隨著碳鏈數(shù)從1增長(zhǎng)至8,擬合成化合物L(fēng)ogP值以每增加1個(gè)碳數(shù)增加～0.5遞增,且當(dāng)碳數(shù)超過(guò)7時(shí),LogP數(shù)值大于5;對(duì)于R基為取代苯基時(shí),擬合成化合物L(fēng)ogP值均介于3.32～4.17。文獻(xiàn)表明藥物L(fēng)ogP高于5時(shí)口服生物利用度很低[21],因此,取代基R為烷基鏈時(shí),選取鏈長(zhǎng)碳數(shù)為1～6進(jìn)行合成;取代基R為表中芳基時(shí),理論上可悉數(shù)合成,實(shí)際合成時(shí)兼顧原料的可及性(化合物No.14,15因合成原料昂貴而舍棄)。

表1 擬合成化合物的LogP計(jì)算值

2.1.2 BIT酰胺衍生物的表征

按照文獻(xiàn)方法,合成BIT酰胺衍生物如表2所示,其熔點(diǎn)熔程均介于2～5 ℃,說(shuō)明化合物純度較高,1H-NMR譜分析表明,所得化合物的氫原子種類和數(shù)量均與目標(biāo)設(shè)計(jì)理論結(jié)構(gòu)相符[22]。這說(shuō)明,所得化合物即為目標(biāo)設(shè)計(jì)結(jié)構(gòu)。

表2 供試BIT酰胺衍生物(XA1～11)

2.2 BIT酰胺衍生物的生物活性評(píng)價(jià)

2.2.1 BIT酰胺衍生物抑菌率涂平板數(shù)菌落數(shù)法測(cè)定結(jié)果

涂平板數(shù)菌落法定量測(cè)定了BIT酰胺衍生物對(duì)柞蠶鏈球菌的抑菌率,結(jié)果表明(表3),化合物使用濃度不低于62.5 mg/L時(shí), XA1～11的抑菌效果均超過(guò)99%,無(wú)明顯差異。當(dāng)化合物濃度為31.25 mg/L時(shí), XA1～4,XA6～8抑菌活性可達(dá)到96%以上,其中XA2、XA6,XA7、XA8均達(dá)到99%,與母體化合物BIT相當(dāng),XA5,XA9～11四個(gè)化合物抑菌活性低于95%。結(jié)果說(shuō)明: BIT酰胺衍生物抑菌活性總體低于母體化合物,且隨著濃度降低,抑菌活性出現(xiàn)分化。

表3 由涂平板數(shù)菌落法測(cè)得BIT酰胺衍生物的抑菌活性

2.2.2 BIT酰胺衍生物抑菌圈試驗(yàn)結(jié)果

設(shè)定處理濃度為500 、1 000 mg/L,采用瓊脂孔穴擴(kuò)散法測(cè)定了BIT酰胺衍生物的抑菌活性,結(jié)果(表4)表明,當(dāng)處理濃度為500 mg/L時(shí),XA1～XA5,即取代基R為烷基時(shí),衍生物抑菌圈可測(cè)得,其中XA1抑菌圈直徑最大,為9.3 mm;XA7～11,即取代基R為芳基時(shí),其抑菌圈未測(cè)得。當(dāng)處理濃度增加至1 000 mg/L時(shí),除了XA8外均存在抑菌圈,衍生物中XA1抑菌圈直徑最大,為12.20 mm,與母體化合物BIT抑菌圈數(shù)值(12.56 mm)最為接近。

表4 由瓊脂孔穴擴(kuò)散法測(cè)得BIT酰胺衍生物的抑菌活性

2.2.3 BIT酰胺衍生物柞蠶體內(nèi)防治活性測(cè)定結(jié)果

由表5數(shù)據(jù)可知,處理濃度為500 mg/L時(shí),BIT酰胺類衍生物的治療活性較低,化合物XA3防效最大,為10.7%,遠(yuǎn)低于對(duì)照母體化合物的防治活性59.1%。當(dāng)使用濃度為 1 000 mg/L時(shí),化合物的防治活性有所增加,但總體活性不足20%,遠(yuǎn)不及相同濃度下母體化合物BIT的防效(61%)。

表5 BIT酰胺衍生物在柞蠶體內(nèi)空胴病防治活性比較

3 結(jié)論

采用Molinspiration Cheminformatics網(wǎng)絡(luò)開(kāi)放軟件JME Molecular Editior輔助設(shè)計(jì),合成了11個(gè)BIT酰胺衍生物,其中取代R基為直鏈烷烴基6個(gè),取代芳香基5個(gè),其結(jié)構(gòu)經(jīng)熔點(diǎn)測(cè)試和1H-NMR分析確認(rèn)。

涂平板數(shù)菌落數(shù)法測(cè)定結(jié)果表明,BIT酰胺衍生物較之BIT抑菌活性降低:要達(dá)到99%以上抑菌活性(對(duì)柞蠶鏈球菌有預(yù)防作用),使用濃度應(yīng)達(dá)到62.5 mg/L。瓊脂孔穴擴(kuò)散法結(jié)果表明,處理濃度較低(500 mg/L)時(shí),衍生物的抑菌圈較小或未測(cè)得,抑菌活性顯著弱于BIT;處理濃度提高至1 000 mg/L,衍生物抑菌圈有所增加,總體低于母體化合物,僅衍生物XA1抑菌活性最接近母體化合物。初步的活體抑菌實(shí)驗(yàn)表明,不同處理濃度(500、1 000 mg/L)下,BIT酰胺衍生物的空胴病治療活性均不及母體化合物BIT。說(shuō)明BIT酰胺化改造不能提升其對(duì)柞蠶鏈球菌的防治活性。為提高抑菌活性特別是柞蠶體內(nèi)的抑菌活性,進(jìn)一步的BIT衍生改造不但要考慮疏水性問(wèn)題,還要考慮化合物的電性等其他內(nèi)在影響因素。