王海燕，李 碩，馬愛團 (河北農業(yè)大學 中獸醫(yī)學院，河北 保定 071001)

便秘是獸醫(yī)臨床常見病，西醫(yī)治療常用莫沙必利，該藥為5-羥色胺4受體(5-HT4R)激動劑，通過刺激胃腸運動，改善胃腸道癥狀，但長期使用效果并不理想。針灸治療便秘療效確切，且復發(fā)性低[1]。后海穴(GV-1)是獸醫(yī)臨床治療便秘的主要穴位[2]，GV-1位于動物尾根與肛門之間，操作方便，各種針術(如白針、火針、水針、電針及激光針)均有相關報道[3-5]。但是不同針術的療效比較及其相應的作用途徑和機理尚不明確。

血管活性腸肽(VIP)作用于平滑肌，可影響胃腸黏膜分泌液體；存在腸肌間神經叢的P物質(SP)調控胃腸道運動；5-羥色胺(5-HT)是腸神經系統(tǒng)中重要介質[6]，與不同受體結合產生不同作用。在胃腸道中，5-羥色胺3受體(5-HT3R)主要分布于平滑肌細胞、腸神經元、迷走神經和脊髓初級傳入神經元[7]，在突觸間隙與5-HT結合后，引起神經遞質的分泌和釋放增加。5-HT4R主要分布于平滑肌細胞和腸神經元中[8]，參與蠕動反射，激活后也可導致中間神經元與運動神經元釋放乙酰膽堿，從而促進胃腸運動[9]。CHEN等[10]研究證實5-HT重攝取轉運體(SERT)基因敲除的小鼠出現的水樣瀉，可能是增強了5-HT信號通路的作用，而便秘的發(fā)生是由于5-HT過度釋放導致5-HT受體不敏感。

本試驗應用后海穴，選擇臨床常用的白針、水針和埋線，通過鹽酸洛哌丁胺建立便秘模型，比較3種針術對便秘的治療效果，明確不同針術對便秘大鼠腸道傳輸功能的影響，同時探索不同針術對神經遞質的作用以及對5-HT信號途徑的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物成年清潔級SD大鼠60只，購自北京斯貝福有限公司。

1.2 藥物鹽酸洛哌丁胺膠囊(2 mg/粒，西安楊森制藥有限公司)，枸櫞酸莫沙必利分散片(5 mg/片，浙江京新藥業(yè)股份有限公司)，VB12，速眠新。

1.3 主要試劑TB Green Premix ExTaqTM熒光定量試劑盒購自TaKaRa公司，5-HT3R、5-HT4R、SERT定量PCR引物購自北京六合通經貿有限公司，總RNA提取試劑盒、SP、VIP、5-HT ELISA試劑盒購自北京普洛麥格生物技術有限公司。

1.4 模型制備飼養(yǎng)條件為室溫22～24℃，濕度50%～60%，12 h交替照明，大鼠自由飲食。適應性飼養(yǎng)1周后，體質量為(215±10)g，抽簽隨機分為A～F組，分別為對照組、模型組、西藥組、白針組、水針組、埋線組。參照文獻[11]的方法復制便秘大鼠模型，除對照組灌服生理鹽水外，其余5組均予鹽酸洛哌丁胺混懸液灌胃3 mg/(kg·d)，每天上午1次，直至試驗結束。

1.5 動物處理在上述模型制備基礎上，每天下午進行不同處理，連續(xù)7 d。由圖1可見，其中對照組和模型組在大腿內側肝經和腎經循行路線之間的非穴位處(該部位穴位較少，遠離脾經和胃經)進行白針刺激。西藥組用莫沙必利(蒸餾水配成1 g/L懸濁液)1.3 mg/(kg·d)灌胃。白針組在后海穴(尾根和肛門之間的凹陷)用0.25 mm×25 mm一次性針灸針(北京中研太和醫(yī)療器械有限公司)刺入穴位，維持20 min，每10 min進行1次捻轉提插行針，針刺后大鼠放回鼠籠，維持自然放松狀態(tài)。水針組在后海穴注射0.1 mL VB12。埋線組將0.2 mm酒精浸泡消毒的可吸收羊腸線埋入后海穴。除埋線組單次治療外，其他各組每天1次。

A.白針；B.水針；C.埋線圖1 動物處理

1.6 指標檢測

1.6.1腸道傳輸功能檢測與糞便數量的比較 動物處理7 d后，收集各組大鼠的糞便進行計數。禁食24 h后，墨汁2 mL/只灌胃，20 min后肌肉注射速眠新0.08 mL/kg，開腹分離腸系膜暴露腸管，剪取幽門至回盲部腸管，輕輕拉成直線，測量小腸總長及墨汁在小腸的推進長度，計算各組墨汁在小腸的推進率。

墨汁推進率=墨汁推進長度/小腸總長度×100%。

1.6.2結腸組織中5-HT、SP、VIP的含量 釆集各組大鼠結腸組織，生理鹽水沖洗腸道，置于-80℃保存，利用ELISA試驗檢測結腸組織中5-HT，SP，VIP的含量。

1.6.3Q-PCR測定結腸組織中5-HT3R，5-HT4R，SERT mRNA的含量 使用總RNA提取試劑盒從結腸中提取RNA，逆轉錄得到cDNA。通過實時定量熒光PCR方法檢測結腸中5-HT3R，5-HT4R，SERT的mRNA轉錄水平，引物由TaKaRa設計合成(表1)。預變性處理為95℃ 30 s，擴增進行40個循環(huán)，包括95℃ 5 s，60℃ 30 s。內參基因為β-actin，由2-ΔΔCt計算每個基因的相對轉錄水平。

表1 實時定量 PCR引物信息

2 結果

2.1 大鼠表現與空白組大鼠相比，模型組大鼠出現食欲下降，糞便顆粒減少、便粒黑小、沒有光澤，精神不振、活動度下降，毛色無光。3個針刺組及西藥組大鼠的表現比模型組均有所好轉，進食量及活動度增加、皮毛有光澤、排便增多、糞便顆粒增大、有一定光澤度。各組糞粒比較見圖2。

A.對照組；B.模型組；C.西藥組；D.白針組；E.水針組；F.埋線組圖2 大鼠20粒糞便長度比較

2.2 大鼠結腸組織結構各組大鼠結腸黏膜完整，未見炎性細胞浸潤，黏膜上皮層細胞呈單層柱狀，細胞排列整齊。A組固有層腸腺結構完整，腸腺長而直，有腸腔，腺上皮有杯狀細胞(黑色箭頭所指)，且分布均勻，細胞形態(tài)完整；B組固有層少量腸腺結構不完整，杯狀細胞破損或消失，細胞基質增大；C～F組固有層杯狀細胞與腸腺結構清晰完整，細胞基質均勻(圖3)。

A.對照組；B.模型組；C.西藥組；D.白針組；E.水針組；F.埋線組；黑色箭頭.杯狀細胞;紅色箭頭.腸腺圖3 3種針術對大鼠結腸組織結構的影響(400×)

2.3 大鼠糞粒數量與小腸推進率模型組小腸推進率顯著低于對照組(P<0.01)，白針、水針與埋線3組均提高小腸推進率，達到西藥組水平，與對照組無顯著性差異。

與對照組比較，模型組大鼠的糞便粒數減少29.5%；與模型組相比，西藥組提高23.2%，白針組提高18.7%，水針組提高31.3%，埋線組提高25.9%，以水針組最佳(表2)。

表2 3種針術對便秘大鼠小腸推進率和糞便粒數的影響

2.4 3種針術對大鼠結腸組織中神經遞質的影響對于結腸組織中VIP、SP、5-HT的水平，由表3結果可見,與對照組比較，模型組SP降低40.6%，有極顯著性差異(P<0.01)；與模型組相比，西藥組、白針組、水針組和埋線組均上調SP的水平，分別提高55.0%，40.6%，58.5%，60.6%，其中水針組與埋線組效果最佳，優(yōu)于西藥組。與對照組比較，模型組結腸組織中VIP的水平有極顯著性差異(P<0.01)；與模型組相比，西藥組、白針組、水針組和埋線組均下調VIP的水平，分別降低26.4%，23.5%，14.7%，25.4%，白針組和埋線組效果可達到西藥組效果。模型組結腸組織中5-HT水平顯著高于對照組(P=0.012)；與模型組比較，西藥組和埋線組可顯著下調5-HT水平(P=0.014和0.021)。

表3 3種針術對便秘大鼠腸道組織5-HT、SP 、VIP水平的影響

2.5 3種針術對大鼠結腸組織中5-HT3R、5-HT4R、SERT mRNA轉錄水平的影響結果顯示，與對照組比較，模型組大鼠結腸組織中5-HT3R、5-HT4R、SERT mRNA的轉錄水平均呈下降趨勢(P<0.01)，各治療組的轉錄水平上升(P<0.01或P<0.05)，3個針刺組的5-HT3R轉錄水平與西藥組無顯著性差異，其中埋線組最佳；同時各針刺組SERT的轉錄水平優(yōu)于對照組(P分別為0.126，0.064，0.047)，以埋線效果最佳；埋線組的5-HT4R轉錄水平顯著高于C、D、E組(P分別為0.006，0.004，0.015)(圖4)。

圖4 3種針術對結腸組織5-HT3R(A)、5-HT4R(B)、SERT(C) 表達水平的影響

3 討論

便秘是動物臨床常見疾病，嚴重降低動物的生活質量。GV-1是督脈的起始穴位，同時是肛門、陰門的局部穴位。研究表明，GV-1廣泛治療各種動物消化系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)的疾病[12-15]。研究證實，針刺GV-1可上調腹瀉家兔血漿VIP含量，下調SP含量[16]，有效緩解腹瀉，同時針刺GV-1還廣泛治療動物便秘[17]，因此GV-1具有雙向調節(jié)作用，治療多種消化系統(tǒng)疾病。

本研究結果顯示，3種針術均可改善腸道傳輸功能，有效緩解便秘。針刺后結腸組織中VIP 含量較模型組大鼠顯著下降，以水針效果最佳；而SP含量較模型組明顯升高，以埋線組效果最佳，與西藥組有顯著性差異。已有研究表明，便秘的發(fā)病機制與胃腸神經遞質的改變有關[18]，針灸治療便秘可有效改善結腸動力[19-20]。SP 能有效促進腸道平滑肌的收縮，并可刺激腸道黏膜分泌水和電解質，從而促進胃腸蠕動[21]。VIP 是一種抑制性神經遞質，其參與腸道舒張，調節(jié)腸道水液代謝，降低結腸和直腸的緊張性[22]，本試驗證實，3種針術均可調節(jié)結腸組織中SP和VIP水平，改善腸道功能。

實時定量熒光PCR結果表明，與模型組相比，3種針刺方法均上調5-HT3R、5-HT4R、SERT轉錄水平，與西藥組無顯著性差異，但不同針刺方法的結果有一定差異。埋線是在傳統(tǒng)針灸的基礎上進行的改良和延伸，研究證實埋植羊腸線對穴位進行持續(xù)刺激，進而調節(jié)機體的內分泌系統(tǒng)，促進胃腸運動以達到通便作用[23]。本試驗GV-1埋線顯著調節(jié)5-HT在轉錄水平的表達。5-HT 在腸道運動、分泌和感覺功能中起著重要作用[24]，有研究表明便秘發(fā)病原因與5-HT信號通路改變有關[25]。對便秘小鼠進行穴位電針，能夠上調5-HT3R、5-HT4R、SERT的mRNA轉錄水平，調節(jié)便秘[26]，本試驗結果與報道一致，通過針刺調節(jié)5-HT信號通路的異常，SERT的表達上升，5-HT重攝取速度加快，降低結腸作用于5-HT受體的5-HT含量，提高了5-HT受體表達。

綜上，水針、白針和埋線均能緩解便秘癥狀，改善腸道組織結構，調節(jié)腸道運動和神經遞質的含量。其中，水針與埋線效果更佳，推測水針發(fā)揮了針和藥的協同作用；埋線可以長期刺激穴位，同時對大鼠的應激反應較小。