曾雅惠,楊文艷，楊連玉 (吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/動(dòng)物醫(yī)學(xué)院/吉林省動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué) 重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130118)

銅(Cu)是生物體必不可少的過(guò)渡金屬元素，作為金屬酶的組成成分，直接參與體內(nèi)代謝、神經(jīng)遞質(zhì)合成、自由基清除等過(guò)程，對(duì)機(jī)體的生理功能和生長(zhǎng)發(fā)育起著重要的作用[1-2]。高銅可促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，因此被作為添加劑廣泛應(yīng)用于畜牧行業(yè)生產(chǎn)中，但高劑量的銅代謝緩慢，易導(dǎo)致動(dòng)物慢性銅中毒[3-6]。關(guān)于銅負(fù)荷的肝毒性、腎毒性、免疫抑制等導(dǎo)致機(jī)體氧化損傷均有報(bào)道，亦有研究表明銅負(fù)荷對(duì)機(jī)體生殖系統(tǒng)的毒性作用也非常明顯[7-8]。李英等[9]研究發(fā)現(xiàn)高銅可引起銅在睪丸中沉積，影響精子數(shù)量及其活力，損傷雄性生殖。然而目前，母體銅營(yíng)養(yǎng)水平是否對(duì)出生后其子代的生殖系統(tǒng)發(fā)育和功能產(chǎn)生影響，尚未可知。因此本試驗(yàn)建立親代大鼠長(zhǎng)期銅暴露模型，觀察子代大鼠睪丸組織形態(tài)、精子活力，探究親代不同銅水平對(duì)子代大鼠血清抗氧化指標(biāo)及睪丸功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用SPF清潔級(jí)，健康程度良好、胎次相同、體質(zhì)量相近(44.04±3.05) g 的21日齡斷奶雌性SD大鼠24只，購(gòu)自長(zhǎng)春市寬城區(qū)宏達(dá)動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)。隨機(jī)分為3個(gè)日糧處理組，每組8只雌性大鼠，每天12 h光照，飼養(yǎng)溫度24℃，相對(duì)濕度50%，自由飲水采食。

1.2 主要試劑酶聯(lián)免疫分析試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司，飼料級(jí)含銅25% CuSO4·5H2O(廣澤，中國(guó))，PrimeScript TM RT reagent Kit with gDNAEraser(TaKaRa，日本)，硝酸(HNO3)，無(wú)水乙醇購(gòu)自長(zhǎng)春商貿(mào)添侯生物科技有限公司。

1.3 動(dòng)物模型及日糧設(shè)計(jì)3個(gè)日糧處理組分別飼喂A、B、C 3種不同銅水平日糧。A 組飼喂AIN-93G基礎(chǔ)日糧，B 組飼喂AIN-93G基礎(chǔ)日糧+CuSO4120 mg/kg，C組飼喂AIN-93G基礎(chǔ)日糧+CuSO4240 mg/kg。試驗(yàn)過(guò)程中，每天定時(shí)飼喂1次(17:00)，自由采食和飲水，預(yù)飼7 d，試驗(yàn)期8周，與全同胞性成熟雄性SD大鼠和籠交配，妊娠后單籠飼養(yǎng)，并繼續(xù)染銅至子代大鼠斷乳后。日糧配方見(jiàn)表1。

表1 日糧成分及營(yíng)養(yǎng)水平 %

1.4 樣本采集及數(shù)據(jù)收集子代大鼠3周齡后，每組均繼續(xù)飼喂AIN-93G基礎(chǔ)日糧，待子代雄性大鼠10周齡每組隨機(jī)取8只作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，分別標(biāo)記A0、B0、C0組?？崭寡矍虿裳瑪囝i處死，分離雙側(cè)睪丸和附睪，左側(cè)分離后稱(chēng)量睪丸和附睪濕重，計(jì)算臟器指數(shù)，用于睪丸石蠟切片，右側(cè)于4℃預(yù)冷4%多聚甲醛中固定，用于組織銅的測(cè)定。附睪用于精液質(zhì)量檢測(cè)。

1.5 血清銅、睪丸組織銅的測(cè)定取1 mL血清樣品于三角瓶中，加5 mL濃HNO3和2 mL HClO4于電熱板上消煮至透明，有少量白煙。靜置冷卻，加2.5 mL 10% HNO3，轉(zhuǎn)入50 mL容量瓶中，用去離子水定容，搖勻待測(cè)，同時(shí)做空白試驗(yàn)。待測(cè)液用電感耦合等離子發(fā)射光譜(ICP-7500)測(cè)定。睪丸組織同上。

1.6 血清中抗氧化指標(biāo)的測(cè)定將血液離心，收集上清，試劑盒采用雙抗體夾心法測(cè)定大鼠血清中谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)及超氧化物歧化酶(SOD)活力、丙二醛(MDA)含量、銅藍(lán)蛋白(CP)水平，并嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作。

1.7 精液質(zhì)量檢測(cè)脫頸法處理大鼠后，切除附睪尾，用眼科剪剪開(kāi)，置于1 mL預(yù)熱的PBS的離心管中，37℃培養(yǎng)箱孵育3 min，使精子游出，用精子稀釋液將精子懸液稀釋20倍，取10 μL稀釋后的精子懸液滴在精子計(jì)數(shù)板上在光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)，用活動(dòng)的精子數(shù)與總精子數(shù)的比值表示精子活力。

1.8 睪丸組織的切片觀察左側(cè)睪丸組織于4%多聚甲醛中固定超過(guò)24 h后置于包埋盒中，在自動(dòng)脫水機(jī)中按照70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、100%乙醇、二甲苯、二甲苯Ⅱ的順序進(jìn)行脫水，用石蠟包埋，準(zhǔn)備切片，再用蘇木精-伊紅染色，用中性樹(shù)膠封片，最后在顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 子代大鼠體質(zhì)量、睪丸濕重、附睪濕重、睪丸及附睪臟器指數(shù)由表2可知，子代大鼠體質(zhì)量、睪丸濕重、附睪濕重、睪丸臟器指數(shù)及附睪臟器指數(shù)隨著親代日糧銅水平的升高而降低，且與A0 組相比，C0組呈顯著降低趨勢(shì)(P<0.05)。附睪濕重B0組顯著低于A0組(P<0.05)。

表2 子代大鼠體質(zhì)量、睪丸濕重、附睪濕重、睪丸及附睪臟器指數(shù)的影響

2.2 血清銅、睪丸組織銅水平由圖1可知，子代大鼠血清銅、睪丸銅含量隨日糧銅水平的增加而增加。與A0組相比，B0組血清中銅含量顯著升高(P<0.05)，C0組血清中銅含量極顯著升高(P<0.01)。與A0組相比，C0組睪丸中銅濃度顯著升高(P<0.05)。

注：與A0相比 *P<0.05；**P<0.01圖1 血清銅(左)、睪丸銅含量(右)

2.3 血清中抗氧化指標(biāo)的變化由表3結(jié)果可知，親代日糧添加120，240 mg/kg硫酸銅，能影響子代大鼠血清中抗氧化指標(biāo)水平，與A0組相比，親代添加240 mg/kg的硫酸銅能顯著降低子代大鼠血清GSH-Px、SOD水平(P<0.05)，但均與B0組差異不顯著。與對(duì)照組相比，B0、C0組MDA水平均極顯著升高(P<0.01)。CP水平隨著銅水平增加呈上升趨勢(shì)，且C0組顯著高于A0組(P<0.05)。

表3 子代大鼠血清抗氧化指標(biāo)

2.4 長(zhǎng)期銅暴露對(duì)子代大鼠精子的影響由表4可知，子代大鼠精子數(shù)量、活動(dòng)率隨著親代染銅水平的升高而呈下降趨勢(shì)。與A0、B0組相比，C0組的精子數(shù)量和精子活動(dòng)率顯著降低(P<0.05)；C0組的精子畸形率顯著高于A0、B0組(P<0.05)。

表4 大鼠精子數(shù)量、活力及畸形率

2.5 睪丸組織的形態(tài)學(xué)變化如圖2所示，A0組睪丸內(nèi)部結(jié)構(gòu)正常，生精小管基膜完整，B0組睪丸生精小管擴(kuò)張且排列松散，C0組睪丸發(fā)育不佳，生精小管基膜不完整，生精細(xì)胞排列層次不清晰，精子減少，睪丸間質(zhì)細(xì)胞數(shù)減少。

圖2 大鼠睪丸組織切片(HE × 200)

3 討論

銅可以通過(guò)胎盤(pán)和母乳由母體向后代進(jìn)行轉(zhuǎn)移，胎兒的銅營(yíng)養(yǎng)完全依賴于母體，妊娠期胎盤(pán)作為母體和胎兒之間物質(zhì)傳遞的紐帶，使銅在胎盤(pán)轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中優(yōu)先供給胎兒，導(dǎo)致胎兒體內(nèi)銅的含量較高。HADDAD 等[10]研究發(fā)現(xiàn)用130 mg/kg硫酸銅飼喂妊娠期大鼠，其后代出現(xiàn)生長(zhǎng)和發(fā)育遲緩的現(xiàn)象，本試驗(yàn)也獲得了相似的結(jié)果，不同銅水平日糧飼喂親代大鼠對(duì)子代雄性大鼠體質(zhì)量、睪丸濕重、睪丸系數(shù)有降低的趨勢(shì)，但與吳國(guó)星等[11]的試驗(yàn)結(jié)果不同，這可能與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的種類(lèi)及器官的敏感度不同導(dǎo)致。隨著日糧銅水平的提高和子代大鼠日糧采食時(shí)間的延長(zhǎng)，血清和睪丸中的銅水平均呈升高的趨勢(shì)，通過(guò)相關(guān)性分析表明，兩組數(shù)據(jù)顯著正相關(guān)。表明，親代飼喂不同水平銅日糧會(huì)導(dǎo)致銅在子代大鼠體內(nèi)蓄積，影響大鼠體質(zhì)量及組織濕重。

動(dòng)物日糧添加銅能顯著提高血清銅SOD活性[12]，但高劑量的銅可引起機(jī)體組織的病理?yè)p傷，導(dǎo)致血清中Cu/Zn-SOD活性降低[13]。GSH-Px能將H2O2分解，產(chǎn)生水和O2，有效防止自由基的生成。血清銅95%是CP結(jié)合銅，CP具有氧化酶活性，由肝臟合成，并參與鐵代謝和運(yùn)輸銅，血清內(nèi)的CP水平會(huì)隨著銅攝入量的增加而顯著升高[14]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，親代覆蓋120，240 mg/kg的銅，子代大鼠血清中SOD和GSH-Px的活性均隨銅水平的增加而逐漸降低，而MDA含量和CP水平逐漸升高，且在親代添加240 mg/kg銅的子代大鼠中顯著升高，這可能是由于親代銅攝入增加了子代肝臟銅濃度，肝臟通過(guò)某一途徑繼續(xù)合成CP。MDA水平上升，意味著動(dòng)物體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)可能受到破壞，動(dòng)物機(jī)體膜結(jié)構(gòu)已經(jīng)發(fā)生損傷，提示親代大鼠長(zhǎng)期銅暴露后，銅可通過(guò)胎盤(pán)屏障和血睪屏障進(jìn)入子代大鼠血清和睪丸內(nèi)，引起催化類(lèi)Fenton反應(yīng)，導(dǎo)致氧化損傷。

睪丸是雄性動(dòng)物最為重要的生殖器官，主要由曲細(xì)精管和間質(zhì)構(gòu)成。曲細(xì)精管由支持細(xì)胞和各級(jí)生精細(xì)胞組成，前者對(duì)生殖細(xì)胞具有支持、保護(hù)和營(yíng)養(yǎng)作用。有研究發(fā)現(xiàn)，慢性銅暴露的小鼠睪丸組織出現(xiàn)嚴(yán)重的空泡化，曲細(xì)精管出現(xiàn)較大的不規(guī)則空隙，精原細(xì)胞和精母細(xì)胞數(shù)量減少，而睪丸系數(shù)無(wú)顯著性差異；此外，在高銅暴露的小鼠中發(fā)現(xiàn)，精子的活力及運(yùn)動(dòng)能力下降，畸形率升高[15-16]。生精小管的萎縮和塌陷、生殖細(xì)胞數(shù)量的減少和上皮細(xì)胞高度的降低是銅暴露小鼠睪丸中典型的組織病理學(xué)損傷[17]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，親代銅暴露下，子代大鼠睪丸的生精小管中生精細(xì)胞疏散，各級(jí)精原細(xì)胞排列紊亂且形態(tài)異常;精子數(shù)量減少，活力下降，畸形率上升，而且銅處理劑量越大，超過(guò)機(jī)體自身耐受劑量，損傷和病理改變程度就越明顯，睪丸中銅沉積也越多。研究結(jié)果說(shuō)明了高濃度銅引起的睪丸損傷、精子數(shù)量及活力降低，其機(jī)制可能是高銅激活了線粒體凋亡的信號(hào)通路，降低精原細(xì)胞和精母細(xì)胞的數(shù)量并影響精子發(fā)育，引起睪丸發(fā)生表觀遺傳修飾，最終損傷雄性生殖[18]。綜上所述，親代飼喂高銅日糧，會(huì)引起子代大鼠發(fā)生氧化應(yīng)激，影響精子生成及睪丸功能。