董 貴，孟凡艷，魯壯壯，賀建忠，陶大勇，陳 偉,，羅萬和* (1.塔里木大學 動物科學學院/新疆生產(chǎn)建設兵團 塔里木動物疫病診斷與防控工程實驗室，新疆 阿拉爾 8400；2.新疆生產(chǎn)建設兵團 塔里木畜牧科技重點實驗室，新疆 阿拉爾 8400；.新疆生產(chǎn)建設兵團 塔里木盆地生物資源保護利用重點實驗室，新疆 阿拉爾 8400)

由金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，S.aureus)引起的奶牛乳腺炎對奶牛生產(chǎn)的危害性很大[1-4]。更重要的是，S.aureus可逃避機體免疫系統(tǒng)和抗菌藥物的清除作用，以小菌落變異株(Staphylococcusaureussmall colony variants，SASCVs)的方式在宿主細胞內(nèi)持續(xù)存在，引起奶牛持續(xù)性和反復性感染奶牛乳腺炎[5]。硫酸頭孢喹肟因?qū).aureus具有較強的抗菌活性，且經(jīng)乳房灌注后可迅速分布整個乳房并維持較高的藥物濃度，故常用于治療由S.aureus引起的奶牛乳腺炎。其中魏占勇等[6]用硫酸硫酸頭孢喹肟乳房注入劑治療干乳期奶牛乳房炎，其治愈率為66.7%。但獸醫(yī)臨床上不合理使用硫酸頭孢喹肟治療奶牛乳腺炎，導致硫酸頭孢喹肟難以清除SASCVs菌株，特別是胞內(nèi)SASCVs菌株，已引起細菌耐藥性等問題[7]。

在離子交聯(lián)劑作用下，通過凝膠材料之間靜電作用自組裝所形成的納米凝膠藥物遞送系統(tǒng)可用于包裹各種藥物分子[8]。納米凝膠具有優(yōu)良的載藥能力、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和生物相容性等特點，可增強抗菌藥物對細菌的抗菌活性，并提高藥物的生物利用度[9]。為提高硫酸頭孢喹肟對由SASCVs菌株引起的奶牛乳腺炎的治愈率，本研究以SASCVs菌株為研究對象，以納米凝膠為藥物遞送系統(tǒng)，在離子交聯(lián)劑作用下，通過凝膠材料之間靜電作用自組裝形成硫酸頭孢喹肟納米凝膠，以外觀性狀、微觀形態(tài)、沉降體積比、再分散性、包封率(EE)、載藥量(LC)、粒徑和Zeta電位為指標，篩選最優(yōu)配方；通過臨床癥狀和PCR確定是否成功構(gòu)建SASCVs菌株感染小鼠模型；通過對比最優(yōu)硫酸頭孢喹肟納米凝膠和其商品化注射劑治療小鼠感染模型的結(jié)果，評價硫酸頭孢喹肟納米凝膠的優(yōu)勢。本研究旨在為治療由SASCVs菌株引起的奶牛乳腺炎提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑硫酸頭孢喹肟注射液(四川正牧生物藥業(yè)有限公司，批號：221362299，含量：2.5 g/L)；三聚磷酸鈉(TPP，國藥集團化學試劑有限公司，批號：20131105，含量：98%)；海藻酸鈉(SA，化學純，國藥集團化學試劑有限公司)；硫酸頭孢喹肟標準品(上海源葉生物科技有限公司，批號：B34157，純度≥98%)；硫酸頭孢喹肟原料藥(國藥集團化學試劑有限公司，批號 20110601，純度99%)；明膠(國藥集團化學試劑有限公司，批號：20231010)；引物、dNTP、Easy Taq酶和Easy Taq buffer(生工生物工程(上海)股份有限公司)；細菌基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技北京有限公司)。

1.2 主要儀器激光納米粒度儀ZS3600(丹東百特儀器有限公司)；集熱式恒溫磁力攪拌器DF-101S(上海力辰邦西儀器科技有限公司)；加熱磁力攪拌器IT-07A3型(上海滬西股份有限公司)；PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)、電泳儀(Bio-Rad公司)。

1.3 試驗菌株金黃色葡萄球菌ATCC 29213、SASCVs菌株由本實驗室保存。

1.4 實驗動物120只清潔級昆明小鼠(18～22 g)由塔里木大學動物實驗站提供。

1.5 硫酸頭孢喹肟納米凝膠的制備分別以不同質(zhì)量濃度(0.20，0.25，0.30 g/L)的TPP、明膠(10，15，20，25 g/L)和SA(10，15，20，25 g/L)為離子交聯(lián)劑、陽離子藥物載體和陰離子藥物載體，通過靜電作用自組裝形成硫酸頭孢喹肟納米凝膠。具體制備方法為：稱取一定量的TPP、明膠和SA分別溶于一定體積的蒸餾水中，同時稱取一定量硫酸頭孢喹肟溶于一定體積的無水乙醇中，渦旋使其完全溶解。先后分別將硫酸頭孢喹肟溶液和TPP溶液在1 500 r/min 轉(zhuǎn)速下，緩慢滴加至明膠溶液中。再將明膠混合溶液在1 500 r/min轉(zhuǎn)速下，緩慢滴加至SA溶液中，通過靜電作用自組裝形成硫酸頭孢喹肟納米凝膠。

1.6 配方篩選以制備納米凝膠的外觀性狀、微觀形態(tài)、沉降體積比、再分散性、EE、LC、粒徑和Zeta電位為指標，篩選硫酸頭孢喹肟納米凝膠最優(yōu)配方。

1.6.1外觀性狀 根據(jù)中國獸藥典中對于液體制劑的要求，觀察硫酸頭孢喹肟納米凝膠系統(tǒng)的外觀性狀，包括氣味、顏色、狀態(tài)等，判斷有無變色、發(fā)霉、產(chǎn)生氣體、異物或其他變質(zhì)現(xiàn)象。

1.6.2微觀形態(tài) 精密量取制得的硫酸頭孢喹肟納米凝膠1 mL，用蒸餾水稀釋100倍搖勻，經(jīng)過負染后吸取2 μL樣品滴在帶有薄膜的銅網(wǎng)上，待干燥后通過掃描電鏡觀察其微觀形態(tài)。

1.6.3沉降體積比 準確量取30 mL納米凝膠置于量筒中并搖勻，靜置3 h，將沉降前懸浮物液面初始高度記錄為H0，靜置3 h后觀察沉降物部分高度不再改變時為H，則沉降體積比為H/H0。

1.6.4再分散性 準確量取30 mL納米凝膠放于量筒中，以60 r/min旋轉(zhuǎn)3 min，根據(jù)是否重新均勻分散評價納米凝膠的再分散性。

1.6.5含量測定 通過紫外分光光度計繪制硫酸頭孢喹肟的標準曲線。精確吸取制備的硫酸頭孢喹肟納米凝膠1 mL，經(jīng)離心后，吸取上清液，并過濾。通過細胞超聲破碎儀使凝膠體系破壞后，用紫外分光光度計測定其中硫酸頭孢喹肟的含量，即未被包封的硫酸頭孢喹肟的含量。根據(jù)下式計算出EE和LC。

EE=(納米凝膠中替米考星含量/替米考星總量)×100%；

LC=(納米凝膠中替米考星含量/納米凝膠總量)×100%。

1.6.6Zeta電位和粒徑 從硫酸頭孢喹肟納米凝膠中量取200 μL樣品，用蒸餾水稀釋 10倍，保存于5 mL 離心管中備用，使用馬爾文納米激光粒度儀測定Zeta電位和粒徑，每次試驗重復測定3次，取平均值。

1.7 PCR檢測方法采用50 μL PCR擴增體系：ddH2O 40.7 μL，Easy Taq酶0.3 μL，Easy Taq buffer 5 μL，dNTP 1 μL，上、下游引物各1 μL，模板DNA 1 μL。nuc基因擴增程序：94℃ 5 min；94℃ 1 min，55℃ 30 s，72℃延伸1.5 min，34個循環(huán)，72℃總延伸3.5 min。以金黃色葡萄球菌ATCC 29213為陽性對照，以滅菌去離子水為陰性對照。

表1 引物信息

1.8 SASCVs菌株感染小鼠模型的建立將SASCVs菌株復蘇、傳代后，取100 μL處于對數(shù)生長期菌株接種于2 mL LB肉湯培養(yǎng)基中，37℃孵育24 h，即為試驗原液，并用生理鹽水稀釋至1×109CFU/mL，作為備用菌液。將120只18～22 g小鼠隨機分成4組(硫酸頭孢喹肟納米凝膠治療組、商品化硫酸頭孢喹肟注射劑治療組、陽性對照組、陰性對照組)，每組30只。其中硫酸頭孢喹肟納米凝膠和注射劑治療組、陽性對照組每只小鼠各接種0.4 mL備用菌液，連續(xù)感染3 d，構(gòu)建SASCVs菌株感染小鼠模型。第4組小鼠不進行感染(陰性對照組)。確認感染后，每3 h觀察1次，期間觀察被感染小鼠的精神狀態(tài)，并記錄小鼠的外觀變化、臨床癥狀和死亡情況，以臨床癥狀角度判定是否構(gòu)建SASCVs菌株感染小鼠模型。同時采集被感染小鼠的病變組織，經(jīng)細菌基因組DNA提取試劑盒提取其DNA后，進行PCR擴增，以分子生物學角度判定是否構(gòu)建SASCVs菌株感染小鼠模型。

1.9 治療試驗將硫酸頭孢喹肟納米凝膠(2.5 mg/kg)和商品化硫酸頭孢喹肟注射劑(2.5 mg/kg)通過肌肉注射治療感染小鼠模型。具體如下：硫酸頭孢喹肟納米凝膠治療組采用硫酸頭孢喹肟納米凝膠治療被感染小鼠；商品化硫酸頭孢喹肟注射劑治療組采用商品化硫酸頭孢喹肟注射劑治療被感染小鼠；陽性對照組將SASCVs菌株感染小鼠后，不做任何處理；陰性對照組的小鼠不感染SASCVs菌株。連續(xù)治療3 d，觀察并記錄5 d內(nèi)小鼠治療情況。

2 結(jié)果

2.1 硫酸頭孢喹肟納米凝膠配方的篩選

2.1.1外觀性狀 當TPP為 0.25 g/L、明膠為 25 g/L、SA為 15 g/L時，所制備的硫酸頭孢喹肟納米凝膠為最佳配比，無沉淀和絮狀物，顏色清亮、無異常氣味、無發(fā)霉、無變色、無沉淀等異物、不產(chǎn)生氣體及其他變質(zhì)現(xiàn)象(圖1)。

圖1 硫酸頭孢喹肟納米凝膠的外觀性狀

2.1.2微觀形態(tài) 掃描電鏡下頭孢喹肟納米凝膠的形態(tài)表征如圖2所示，頭孢喹肟呈不規(guī)則塊狀，體積較小，表面較為光滑平整，被明膠和海藻酸鈉所形成的網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)所包裹。

圖2 硫酸頭孢喹肟納米凝膠的微觀形態(tài)(× 10 000)

2.1.3沉降體積比和再分散性 根據(jù)藥典規(guī)定H/H0值不得低于0.9。H/H0值越大，即代表沉降物的高度與納米凝膠的原始高度越接近，相應的納米凝膠也就越穩(wěn)定。所制備的硫酸頭孢喹肟納米凝膠H/H0值為1，表明該納米凝膠制劑穩(wěn)定性高。量筒下部的沉降部分能很快的重新均勻分散，表明該納米凝膠不易凝集，再分散性良好。

2.1.4EE和LC 測定了在 291 nm 處硫酸頭孢喹肟濃度與D值的標準曲線，由圖3可見，在0.5～100 mg/L的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關系良好，標準曲線回歸方程為y=0.512 9x+0.148 6，相關系數(shù)r=0.999 4，線形關系良好。根據(jù)標準曲線回歸方程，計算出其EE和LC分別為(71.2%±1.32)%，(16.3±0.45)%。

圖3 硫酸頭孢喹肟的標準曲線

2.1.5Zeta電位和粒徑 最優(yōu)配方的硫酸頭孢喹肟納米凝膠的粒徑為(23.01±1.14) nm，Zeta電位為(-25.4±0.91) mA，如圖4，5所示。

圖4 硫酸頭孢喹肟納米凝膠的粒徑

圖5 硫酸頭孢喹肟納米凝膠的Zeta電位

2.2 感染小鼠模型的判定

2.2.1臨床癥狀 感染SASCVs菌株小鼠在1 d后出現(xiàn)精神狀態(tài)較差，活動、飲食、飲水較少，背毛聳立，肛門周圍的污穢物較多且黏性較大，眼為干酪樣物封閉。后期出現(xiàn)蜷縮和肛門周圍紅腫等現(xiàn)象，陰性對照組小鼠飲食和飲水均正常，未出現(xiàn)任何臨床發(fā)病癥狀。即從臨床癥狀角度判定已構(gòu)建SASCVs菌株感染小鼠模型。

2.2.2PCR檢測 將感染小鼠病變組織經(jīng)細菌基因組DNA提取試劑盒提取DNA后，進行PCR擴增。結(jié)果顯示，其DNA擴增產(chǎn)物大小為279 bp且為單一明亮的目的條帶，如圖6所示。即從分子生物學角度判定已成功構(gòu)建SASCVs菌株感染小鼠模型。

M.DL2000 DNA Marker；1.硫酸頭孢喹肟納米凝膠治療組小鼠DNA；2.商品化硫酸頭孢喹肟注射劑治療組小鼠DNA；3.陽性對照組小鼠DNA；4.陰性對照組小鼠DNA；5.陰性對照；6.陽性對照圖6 SASCVs菌株感染小鼠模型的PCR擴增結(jié)果

2.3 治療結(jié)果被感染小鼠經(jīng)硫酸頭孢喹肟納米凝膠及其商品化注射劑治療后，肛門周圍干凈，無污穢物，眼周干酪樣封閉癥狀消失，飲食飲水及精神狀態(tài)恢復正常。將治愈后小鼠組織經(jīng)細菌基因組DNA提取試劑盒提取DNA后，進行PCR擴增。擴增結(jié)果顯示，治療組未出現(xiàn)目的條帶，如圖7所示。即從分子生物學角度判定已成功治愈SASCVs菌株感染的小鼠。

M.DL2000 DNA Marker；1.硫酸頭孢喹肟納米凝膠治療組小鼠DNA；2.商品化硫酸頭孢喹肟注射劑治療組小鼠DNA；3.陽性對照組小鼠DNA；4.陰性對照組小鼠DNA；5.陰性對照；6.陽性對照圖7 治療SASCVs菌株感染小鼠模型的PCR擴增結(jié)果

3 討論

由S.aureus引起的奶牛乳腺炎給奶牛養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大損失，其SASCVs在宿主細胞內(nèi)持續(xù)存在，引起奶牛持續(xù)性和反復性感染奶牛乳腺炎。由于SASCVs菌株可寄生于細胞中，常規(guī)抗菌藥物劑型難以有效治療胞內(nèi)SASCVs菌株感染，會引起治療失敗和細菌耐藥性等問題[5]。納米凝膠可通過凝膠材料(如SA、殼聚糖、明膠、羧甲基殼聚糖等)長時間黏附于奶牛乳腺表面，并滲入乳腺上皮細胞內(nèi)，將包裹的抗菌藥物送達到感染部位，有助于靶向治療由SASCVs引起的奶牛乳腺炎[10-11]。而凝膠材料的選擇對于納米凝膠的制備至關重要。明膠具有優(yōu)異的陽離子藥物載體功能、一定的抗菌活性、抗炎和抗氧化作用，可提高動物機體免疫力，對于治療SASCVs感染具有重要意義[12]。SA的水溶液表現(xiàn)出聚陰離子行為，因其具有無毒性、pH值敏感性、生物黏附性和生物相容性，且所形成的凝膠反應條件溫和、可避免敏感性藥物、蛋白質(zhì)、細胞和酶等活性物質(zhì)的失活，常用于陰離子藥物載體[13]。ZHOU等[14]通過將固體脂質(zhì)納米技術(shù)與水凝膠技術(shù)相結(jié)合，以殼聚糖為陽離子藥物載體，以SA為陰離子藥物載體，通過靜電作用自組裝成替米考星復合納米凝膠，大大改善了替米考星對S.aureus感染的治療效果。MUKHOPADHYAY等[15]通過離子凝膠技術(shù)，以明膠為陽離子藥物載體，以羧甲基殼聚糖為陰離子藥物載體，制備了恩諾沙星納米凝膠，提高了恩諾沙星的生物效應。由此可見，以明膠、殼聚糖、羧甲基殼聚糖和SA等為凝膠材料所制備的納米凝膠可提高抗菌藥物對細菌的抗菌活性，改善其生物效應[16]。

本試驗以TPP為離子交聯(lián)劑，以明膠為陽離子藥物載體，以SA為陰離子藥物載體，通過陰陽離子之間的靜電作用自組裝形成硫酸頭孢喹肟納米凝膠。其制備工藝簡單，操作方便。經(jīng)過對TPP、明膠和SA配方比例篩選后，發(fā)現(xiàn)當TPP為 0.25 g/L、明膠為 25 g/L、SA為 15 g/L時，所制備的硫酸頭孢喹肟納米凝膠為最佳配比。最優(yōu)配方的硫酸頭孢喹肟納米凝膠外觀性狀顯示無沉淀和絮狀物，顏色清亮、無異常氣味、無發(fā)霉、無變色、不產(chǎn)生氣體及其他變質(zhì)現(xiàn)象，符合獸藥典中對于液體制劑的要求；通過掃描電鏡，頭孢喹肟納米凝膠的微觀形態(tài)顯示頭孢喹肟呈不規(guī)則塊狀，體積較小，表面較為光滑平整，并且被明膠和海藻酸鈉所形成的網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)所包裹，這與ZHOU等[14]所繪制的納米凝膠模式圖相符合；最優(yōu)配方的硫酸頭孢喹肟納米凝膠沉降體積比為1，表明該納米凝膠制劑穩(wěn)定性高；可快速重新均勻分散，表明該納米凝膠不易凝集，再分散性良好；EE和LC分別為(71.2±1.32)%，(16.3±0.45)%，與FENG等[17]所制備納米凝膠的EE和LC相接近，表明硫酸頭孢喹肟納米凝膠具有較優(yōu)的EE和LC；且最優(yōu)配方的硫酸頭孢喹肟納米凝膠的平均粒徑為(23.01±1.14) nm，具有較小的藥物尺寸，有助于該納米凝膠制劑進入宿主細胞內(nèi)，進而靶向治療胞內(nèi)SASCVs感染；Zeta電位為(-25.4±0.91) mV，有利于該納米凝膠制劑通過靜電作用與宿主細胞膜表面正電荷相作用，并吸附于細胞表面，從而更有利于該納米凝膠制劑進入宿主細胞內(nèi)。因此，通過表征該納米凝膠制劑的外觀性狀、微觀形態(tài)、沉降體積比、再分散性、EE、LC粒徑和Zeta電位等，本試驗所研制的硫酸頭孢喹肟納米凝膠符合納米凝膠的制備要求。

本試驗將SASCVs菌株感染小鼠后，出現(xiàn)一系列臨床發(fā)病現(xiàn)象，如活動、飲食、飲水較少，背毛聳立，肛門周圍的污穢物較多且黏性較大，眼為干酪樣物封閉，蜷縮和肛門周圍紅腫等現(xiàn)象；將感染小鼠病變組織經(jīng)細菌基因組DNA提取試劑盒提取DNA后，其DNA擴增產(chǎn)物大小在279 bp且為單一明亮的目的條帶。故通過臨床癥狀和PCR判斷已成功構(gòu)建SASCVs菌株感染小鼠模型。將硫酸頭孢喹肟納米凝膠和其商品化注射液對于SASCVs感染小鼠模型的治愈率分別為90.0%和86.7%，表明本試驗所研制的硫酸頭孢喹肟納米凝膠治療SASCVs感染小鼠的效果略優(yōu)于硫酸頭孢喹肟注射液。綜上所述，本研究已初步制備出硫酸頭孢喹肟納米凝膠，具有較好的療效，為治療由SASCVs菌株引起的奶牛乳腺炎提供了依據(jù)。