金 鳳，李茜如，鞏志國，顧柏臣，趙佳敏，曹金山，劉 博 (內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018)

前列腺素(PGs)的形成過程為花生四烯酸(AA)在環(huán)氧合酶(COXs)，包括COX-1和COX-2的作用下轉(zhuǎn)化為前列腺素H2(PGH2)，隨后在前列腺素合成酶(prostaglandin synthetase)的作用下轉(zhuǎn)化為PGs[1]。與炎癥反應(yīng)調(diào)控過程關(guān)聯(lián)最緊密的PGs包括前列腺素E2(PGE2)和前列腺素D2(PGD2)[2]。在炎癥反應(yīng)中，PGE2可視為一種典型的炎癥介質(zhì)[3-6]。在此過程中，PGD2的分泌水平同樣出現(xiàn)顯著上升[7]。在小鼠巨噬細(xì)胞中，PGD2的合成分泌與其合成酶的表達(dá)呈正相關(guān)，主要通過造血型前列腺素D2合成酶(H-PGDS)依賴性途徑產(chǎn)生[2,7-8]。PGD2是否能夠調(diào)控病原菌感染后免疫細(xì)胞細(xì)胞因子的分泌，尚需進(jìn)一步的探討。

巨噬細(xì)胞可通過分泌細(xì)胞因子對(duì)病原微生物及其病原相關(guān)分子模式(PAMPs)所激活的天然免疫應(yīng)答起到關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用[9]。在小鼠巨噬細(xì)胞被金黃色葡萄球菌感染后，其PGE2的合成分泌依賴于細(xì)胞中TLR2(TLR2)、TLR4(TLR4)和NLRP3(NLRP3)等模式識(shí)別受體(PRRs)的存在[10]。此外，大腸桿菌感染可誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞中PGs的合成分泌[11]。因此，在巨噬細(xì)胞中，PGs的合成分泌與細(xì)菌感染之間具有緊密的關(guān)聯(lián)，但大腸桿菌感染巨噬細(xì)胞后通過何種模式識(shí)別受體誘導(dǎo)PGD2的合成分泌，目前尚不清楚。

本研究探討了模式識(shí)別受體TLR2、TLR4和NLRP3在大腸桿菌誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞PGD2合成分泌中的作用。此外，分析了內(nèi)源性和外源性PGD2對(duì)大腸桿菌誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子分泌影響。為闡明PGD2在宿主炎癥反應(yīng)中的調(diào)控作用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑PGD2、PGD2ELISA試劑盒、兩種前列腺品素D合成酶抑制劑HQL-79和H-PGDS抑制劑Ⅰ(H-PGDS Inhibitor Ⅰ)均購自Cayman chenical公司；總RNA提取試劑盒購自Axygen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Thermo Scientific公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒(FastStart Universal SYBR Green Master)購自Roche Applied Science公司；小鼠TNF-α、IL-1β ELISA試劑盒購自Biolegend公司；小鼠IL-10 ELISA試劑盒購自eBioscience公司；小鼠RANTES ELISA試劑盒購自PeproTech公司。兔抗COX-2抗體購自Cell Signaling Technology公司；兔抗H-PGDS抗體購自Abcam公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗購自Cell Signaling Technology公司。

1.2 細(xì)菌野生型致病性大腸桿菌(WTE.coli，鑒定證書號(hào)：SYS110017)由本課題組分離鑒定保存[12]。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物C57BL/6J野生型小鼠購自內(nèi)蒙古大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，TLR2(TLR2-/-)和TLR4(TLR4-/-)基因敲除小鼠購自南京大學(xué)模型動(dòng)物研究所，NLRP3基因敲除小鼠購自美國杰克遜實(shí)驗(yàn)室。本試驗(yàn)使用8～10周齡、體質(zhì)量20 g左右的健康成年小鼠。

1.4 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞培養(yǎng)和試驗(yàn)處理參照文獻(xiàn)[10]方法進(jìn)行小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的提取，通過細(xì)胞計(jì)數(shù)將細(xì)胞密度調(diào)整至5×106個(gè)/孔，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞完全貼壁后用于后續(xù)試驗(yàn)。本研究大腸桿菌對(duì)巨噬細(xì)胞的感染量為1×106CFU/孔。在使用大腸桿菌感染野生型、TLR2-/-、TLR4-/-和NLRP3-/-小鼠腹腔巨噬細(xì)胞后，分別通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR(2，4，6 h)、Western blot(0，6，12 h)和ELISA(6 h)方法分析巨噬細(xì)胞中COX-2和H-PGDS的表達(dá)水平，以及PGD2的分泌情況。在使用H-PGDS抑制劑(以抑制內(nèi)源性PGD2的合成分泌)和外源性PGD2預(yù)處理巨噬細(xì)胞的試驗(yàn)中，細(xì)胞培養(yǎng)液中HQL-79、H-PGDS抑制劑和PGD2的終濃度均為1×10-6mol/L。在預(yù)處理24 h后，使用大腸桿菌感染野生型小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，6 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，并通過ELISA方法檢測分析巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子分泌情況。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)總mRNA的提取、反轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)定量RT-PCR反應(yīng)按照說明書進(jìn)行操作。從小鼠巨噬細(xì)胞提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA并進(jìn)行擴(kuò)增，步驟如下：使用ABI ViiA 7實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems)，50℃ 2 min，1個(gè)循環(huán)；95℃ 10 min，1個(gè)循環(huán)；95℃ 15 s，60℃ 60 s，共40個(gè)循環(huán)。引物見表1。參照文獻(xiàn)[13]的方法，以持家基因GAPDH作為內(nèi)參照，使用2-ΔCt(ΔCt=Ct目的基因-CtGAPDH)的計(jì)算方法進(jìn)行目的基因表達(dá)的統(tǒng)計(jì)與分析。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

1.6 Western blot檢測使用Western blot方法對(duì)樣本中蛋白表達(dá)的水平進(jìn)行分析[10]。其中，COX-2一抗稀釋比例為1∶1 000；H-PGDS一抗稀釋比例為1∶500；GAPDH一抗稀釋比例為1∶10 000；二抗稀釋比例為1∶8 000。

1.7 ELISA檢測經(jīng)H-PGDS抑制劑和PGD2預(yù)處理或未經(jīng)預(yù)處理的小鼠巨噬細(xì)胞在大腸桿菌感染6 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清。按照ELISA試劑盒說明書檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中PGD2、TNF-α、IL-1β、RANTES和IL-10的水平。

2 結(jié)果

2.1 TLR2、TLR4和NLRP3在大腸桿菌感染誘導(dǎo)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞COX-2和H-PGDS表達(dá)中的作用由圖1可見，在大腸桿菌感染后，相比于野生型小鼠來源的巨噬細(xì)胞，TLR2-/-、TLR4-/-和NLRP3-/-巨噬細(xì)胞中COX-2 mRNA(感染4，6 h后)和蛋白的表達(dá)(感染12 h后)處于較低水平(P<0.05)。此外，在未感染狀態(tài)下，TLR2-/-、TLR4-/-和NLRP3-/-巨噬細(xì)胞H-PGDS蛋白表達(dá)水平低于野生型巨噬細(xì)胞(P<0.001)。在大腸桿菌感染2 h后，TLR2-/-、TLR4-/-和NLRP3-/-巨噬細(xì)胞H-PGDS mRNA表達(dá)水平與野生型巨噬細(xì)胞相比處于較低水平(P<0.001)；感染4 h后NLRP3-/-巨噬細(xì)胞H-PGDS mRNA表達(dá)水平與野生型巨噬細(xì)胞相比處于較低水平(P<0.001)；感染4，6 h后，TLR4-/-巨噬細(xì)胞H-PGDS mRNA表達(dá)水平與野生型巨噬細(xì)胞相比處于較低水平(P<0.001)，該結(jié)果與感染12 h后H-PGDS蛋白表達(dá)的結(jié)果是一致的。因此，上述結(jié)果表明TLR2、TLR4和NLRP3參與了大腸桿菌誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞COX-2和H-PGDS表達(dá)。

A.COX-2 mRNA表達(dá)水平；B.COX-2蛋白表達(dá)水平；C.H-PGDS mRNA 表達(dá)水平；D.H-PGDS 蛋白表達(dá)水平圖1 大腸桿菌感染C57BL/6J野生型、TLR2-/-、TLR4-/-和NLRP3-/-巨噬細(xì)胞后COX-2和H-PGDS mRNA和蛋白的表達(dá)情況

2.2 TLR2、TLR4和NLRP3在大腸桿菌感染誘導(dǎo)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞PGD2分泌中的作用結(jié)果顯示，與野生型巨噬細(xì)胞相比，大腸桿菌誘導(dǎo)的TLR2-/-、TLR4-/-和NLRP3-/-小鼠腹腔巨噬細(xì)胞PGD2分泌顯著處于較低水平(P<0.001)，表明TLR2、TLR4和NLRP3參與了大腸桿菌誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞PGD2分泌(圖2)。

圖2 大腸桿菌感染C57BL/6J野生型、TLR2-/-、TLR4-/-和NLRP3-/-巨噬細(xì)胞后PGD2的分泌情況

2.3 內(nèi)源性PGD2對(duì)大腸桿菌誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子分泌的影響結(jié)果顯示，與未使用前列腺素D合成酶抑制劑處理感染試驗(yàn)組相比，內(nèi)源性PGD2合成分泌被抑制后，大腸桿菌誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞促炎性細(xì)胞因子(TNF-α和IL-1β)、抗炎因子(IL-10)和趨化因子(RANTES)分泌出現(xiàn)顯著性下調(diào)(P<0.05)。上述結(jié)果表明大腸桿菌誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子分泌在一定程度上依賴于內(nèi)源性PGD2的合成分泌(圖3)。

A.TNF-α；B.IL-1β；C.IL-10；D.RANTES圖3 內(nèi)源性PGD2對(duì)大腸桿菌感染誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子分泌的影響

2.4 外源性PGD2對(duì)大腸桿菌誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子分泌的影響結(jié)果顯示，外源性PGD2對(duì)大腸桿菌誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞促炎性細(xì)胞因子(TNF-α和IL-1β)具有上調(diào)作用(P<0.01)，同時(shí)對(duì)抗炎因子(IL-10)和趨化因子(RANTES)的分泌具有抑制作用(P<0.001)。上述結(jié)果表明外源性PGD2對(duì)大腸桿菌誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子分泌具有調(diào)控作用(圖4)。

A.TNF-α；B.IL-1β；C.IL-10；D.RANTES圖4 外源性PGD2對(duì)大腸桿菌感染誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子分泌的影響

3 討論

宿主天然免疫系統(tǒng)中模式識(shí)別受體的激活在細(xì)胞因子的分泌過程中發(fā)揮了關(guān)鍵性的作用[14]。此外，PGs的合成分泌與模式識(shí)別受體介導(dǎo)的天然免疫應(yīng)答間具有緊密的聯(lián)系[10,15-17]。本研究結(jié)果表明，TLR2、TLR4和NLRP3參與了大腸桿菌誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞PGD2合成分泌過程，并且內(nèi)外源性PGD2均對(duì)大腸桿菌感染巨噬細(xì)胞后細(xì)胞因子的分泌產(chǎn)生影響。

WU等[10]在前期研究中發(fā)現(xiàn)，模式識(shí)別受體TLR2、TLR4和NLRP3的激活均參與金黃色葡萄球菌感染巨噬細(xì)胞后COX-2的表達(dá)過程，進(jìn)而對(duì)PGE2的合成分泌產(chǎn)生影響。由于PGE2和PGD2在炎癥反應(yīng)發(fā)生后的合成過程中，均需COX-2的參與，因此，猜測TLR2、TLR4和NLRP3亦可能對(duì)PGD2的合成過程產(chǎn)生影響。本研究結(jié)果顯示，大腸桿菌感染巨噬細(xì)胞后COX-2的正常表達(dá)依賴于上述模式識(shí)別受體的存在，而H-PGDS的表達(dá)在巨噬細(xì)胞TLR2、TLR4和NLRP3缺失后，并未出現(xiàn)一致性的變化規(guī)律。與COX-2表達(dá)趨勢相一致的是，大腸桿菌誘導(dǎo)的TLR2-/-、TLR4-/-和NLRP3-/-小鼠腹腔巨噬細(xì)胞PGD2分泌水平顯著低于野生型巨噬細(xì)胞。上述結(jié)果表明，雖然H-PGDS的表達(dá)可能是決定PGD2是否能夠正常分泌的重要因素，但TLR2、TLR4和NLRP3的激活更可能直接通過對(duì)COX-2表達(dá)的調(diào)控，進(jìn)而影響下游PGD2的合成分泌過程。

一般認(rèn)為PGD2對(duì)炎癥反應(yīng)具有調(diào)控能力，但其具體作用目前尚不清楚[18]。本研究結(jié)果顯示，在大腸桿菌感染過程中，巨噬細(xì)胞促炎性細(xì)胞因子、抗炎因子和趨化因子的表達(dá)分泌一定程度上依賴于內(nèi)源性PGD2的合成分泌；外源性PGD2對(duì)大腸桿菌感染巨噬細(xì)胞后促炎性細(xì)胞因子的釋放具有上調(diào)作用，對(duì)抗炎因子和趨化因子的表達(dá)具有抑制作用。上述結(jié)果表明，雖然PGD2對(duì)大腸桿菌誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子分泌具有影響，但內(nèi)源性和外源性PGD2對(duì)此過程的調(diào)控作用有所區(qū)別。

綜上所述，本研究探討了模式識(shí)別受體TLR2、TLR4和NLRP3在大腸桿菌感染巨噬細(xì)胞后PGD2合成分泌中的作用；此外，分析了內(nèi)源性和外源性PGD2在此過程中對(duì)細(xì)胞因子分泌的影響。然而，PGD2通過何種途徑對(duì)細(xì)胞因子的分泌產(chǎn)生調(diào)控作用尚未明確，尚待進(jìn)一步研究。