賴梭梅,丁一夫,李勁松

[1.中國科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心(生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所),細(xì)胞生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海200031;2.中國科學(xué)院大學(xué),北京100039]

由于能夠掩蓋發(fā)生的隱性突變，提高環(huán)境適應(yīng)度，二倍體基因組是大多數(shù)動物的典型特征，但這恰好限制了基于突變研究的遺傳學(xué)的發(fā)展［1］。而單倍體基因組具有外顯優(yōu)勢，非常適合用于在體外分析各種突變對基因功能的影響。在自然狀態(tài)下，因酵母能夠以單倍體形式穩(wěn)定存活［2］，故圍繞功能基因篩選的研究常常在酵母上開展。同時，科研人員一直試圖構(gòu)建一種可用于體外篩選的單倍體細(xì)胞系，尤其是哺乳動物的單倍體細(xì)胞系。

自然狀態(tài)下哺乳動物體內(nèi)的單倍體細(xì)胞只有精子和卵細(xì)胞，但是目前的技術(shù)尚無法實(shí)現(xiàn)體外長期培養(yǎng)精子或卵細(xì)胞以用于研究［3-4］。科研人員在19世紀(jì)70年代就探索利用胚胎分割［5］、孤雌激活卵母細(xì)胞［6］、顯微去除原核［7］等方法構(gòu)建單倍體胚胎，并成功地獲得了小鼠的單倍體胚胎［8］。然而單倍體基因組在體外會自發(fā)地二倍體化，因此體外長期培養(yǎng)單倍體細(xì)胞成為了一個難以逾越的壁壘。直到2011年，科研人員才實(shí)現(xiàn)哺乳動物單倍體胚胎干細(xì)胞的體外培養(yǎng)［9］。

因?yàn)閱伪扼w細(xì)胞的突變都是顯性的，在類精子單倍體胚胎干細(xì)胞技術(shù)誕生之前，單倍體的應(yīng)用主要集中于功能基因篩選。2009年，Carette等［10］借助人慢性髓細(xì)胞性白血病細(xì)胞系KBM-7（該細(xì)胞系除了8號染色體外，其余染色體都是單倍體核型）進(jìn)行遺傳篩選。他們利用KBM-7單倍體細(xì)胞篩選細(xì)胞致死性膨脹毒素（cytolethal distendingtoxins，CDTs）所必需的宿主因子，并通過在單倍體上大規(guī)模敲除基因，使得篩選病原體致病所必需的宿主因子如毒素、病毒、受體的配體成為可能。最后研究者成功找到了鞘磷脂合成酶1和G蛋白偶聯(lián)受體TMEM181分別獨(dú)立地插入失活的抗CDTs的細(xì)胞系。2008年，Chong等［11］構(gòu)建了條件性Drosha敲除的小鼠。Drosha在細(xì)胞核中催化pri-miRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為premiRNA莖環(huán)前體［12］，這對于miRNA加工的起始非常重要。2011年之前尚無Drosha敲除細(xì)胞系的報告。直到2011年，Elling等［13］利用基因誘捕（gene trap）技術(shù)，在單倍體細(xì)胞上獲得了一株不表達(dá)Drosha的細(xì)胞系。

在過去的一個世紀(jì)里，基因篩選已經(jīng)幫助人們闡明了多種生物學(xué)過程［14］。但對于基因功能的研究，尤其是復(fù)雜的人類疾病，僅在細(xì)胞水平上進(jìn)行基因篩選是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，一些簡單的動物模型不足以闡明疾病發(fā)生的具體機(jī)制。因此，構(gòu)建更貼近人類發(fā)病模式的復(fù)雜疾病小鼠模型在疾病相關(guān)研究中顯得非常重要。

近幾十年來，基因編輯小鼠模型使得生物領(lǐng)域的基礎(chǔ)研究有了飛躍式進(jìn)展，尤其是與人類有關(guān)的研究如衰老［15］、腫瘤［16］、自閉癥［17］、抑郁癥［18］、肥胖［19］，以及各種器官損傷、再生、修復(fù)等基礎(chǔ)研究。但科研工作者仍然渴求在短時間內(nèi)以較低成本獲得特定的基因型小鼠，這需要實(shí)現(xiàn)基因組的編輯，并將這種編輯傳遞到生殖系中。人們最開始是通過同源重組實(shí)現(xiàn)基因組的編輯，然后是病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因、重組鋅指核酸酶（zinc-finger nucleases，ZFN）和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)蛋白核酸酶（transcription activator-like effector nucleases，TALEN）技術(shù)，尤其是2020年諾貝爾化學(xué)獎得主Charpentier和Doudna等開發(fā)的成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）/CRISPR相關(guān)蛋白核酸酶9（CRISPR-associated nuclease 9，Cas9）技術(shù)。這些技術(shù)的出現(xiàn)使得基因組編輯越來越便捷、精準(zhǔn)。例如，應(yīng)用原核注射或卵胞質(zhì)內(nèi)注射，或者通過囊胚注射，可以將基因編輯上升到小鼠個體水平。

遺憾的是，采用常規(guī)的動物模型建立技術(shù)產(chǎn)生的模型小鼠存在或多或少的嵌合，嵌合體需要通過交配獲得無嵌合的小鼠。而如果是多基因同時編輯的模型動物，在交配時由于存在基因分離現(xiàn)象，會極大地增加飼養(yǎng)與鑒定的成本。2012年類精子單倍體胚胎干細(xì)胞的誕生［20］以及后續(xù)的優(yōu)化工作［21］，證明了利用類精子單倍體胚胎干細(xì)胞可以高效地獲得多基因雜合編輯的半克隆小鼠，可直接將細(xì)胞水平的編輯傳遞到小鼠個體水平，為人類復(fù)雜疾病的動物模型研究帶來了新的工具。

1 類精子單倍體胚胎干細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展歷程

核移植技術(shù)和單倍體胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的優(yōu)化，使得從單倍體胚胎中獲取可體外穩(wěn)定培養(yǎng)的單倍體胚胎干細(xì)胞成為可能［22］。1970年，F(xiàn)reed等［23］在美洲豹蛙的孤雄胚胎中建立了兩株單倍體細(xì)胞系，其中一株可以傳代200次以上。1975年，Philippe等［24］成功在體外培養(yǎng)了蟑螂孤雌胚胎來源的單倍體細(xì)胞。1978年，Debec［25］建立并培養(yǎng)了黑腹果蠅的單倍體細(xì)胞。1999年，Kotecki等［26］從慢粒細(xì)胞白血病患者的骨髓中通過連續(xù)亞克隆的方式分離出了“近單倍體”的細(xì)胞系KBM-7，該細(xì)胞系中除了8號染色體是2條，其余皆為1條。2009年，Yi等［27］構(gòu)建了青鳉魚孤雌單倍體多能干細(xì)胞，再次將單倍體細(xì)胞的研究推向高潮。然而在哺乳動物胚胎中，單倍性維持和發(fā)育并不兼容，盡管在卵圓筒期（egg cylinder stage）的孤雌胚胎中觀察到了單倍體細(xì)胞的存在，但是存活的胚胎中細(xì)胞多為二倍體［9］。直到2011年，Leeb等［9］引入了2i培養(yǎng)系統(tǒng)（含有兩個小分子抑制劑PD184352、CHIR99021）后，才成功獲得了小鼠孤雌單倍體胚胎干細(xì)胞，并通過流式分選富集單倍體，可在體外維持該細(xì)胞系的單倍性35代左右。PD184352和CHIR99021通過抑制糖原合成酶激酶3和絲裂原活化的細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶信號通路，促進(jìn)胚胎干細(xì)胞的自我更新［28-29］，白血病抑制因子可抑制胚胎干細(xì)胞的分化［29］。同年Elling等［13］也建立了小鼠孤雌單倍體胚胎干細(xì)胞系。但是Leeb和Elling等只是通過多能性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了他們獲得的孤雌單倍體胚胎干細(xì)胞具有體內(nèi)外的分化能力，研究并未證明其獲得的小鼠孤雌單倍體胚胎干細(xì)胞能否發(fā)生生殖系嵌合，是否保留母源基因組的表觀遺傳特性，以及是否能代替卵子基因組獲得半克隆小鼠。

單倍體胚胎干細(xì)胞研究的一個重大突破是2012年Li帶領(lǐng)的團(tuán)隊(duì)首次建立了小鼠孤雄胚胎來源的單倍體胚胎干細(xì)胞，這些孤雄單倍體胚胎干細(xì)胞保持了大部分的父源印記，表達(dá)典型的多能性基因，并在注射到二倍體囊胚時，可嵌合發(fā)育成生殖系在內(nèi)的各種組織；最重要的是孤雄單倍體胚胎干細(xì)胞在注入卵母細(xì)胞后可以產(chǎn)生可育的小鼠［20］。同年Zhou帶領(lǐng)的團(tuán)隊(duì)也獨(dú)立建立了小鼠孤雄單倍體胚胎干細(xì)胞，并證明了這類細(xì)胞替代精子內(nèi)遺傳物質(zhì)的可能性［30］。

此外，孤雄單倍體胚胎干細(xì)胞的出現(xiàn)使得復(fù)雜基因編輯小鼠的獲取變得更加容易。但是通過注射孤雄單倍體胚胎干細(xì)胞獲得小鼠的效率很低，不到移植胚胎的2%，并且還有大約50%的半克隆小鼠呈現(xiàn)出生長遲緩的表型，在出生后不久就死亡。低出生效率、生長遲緩的現(xiàn)象直接阻礙著利用孤雄單倍體胚胎干細(xì)胞構(gòu)建基因修飾小鼠。直到2015年，Zhong等［31］利用CRISPR/Cas9技術(shù)在孤雄單倍體胚胎干細(xì)胞中將H19、IG差異性甲基化區(qū)域（differentially methylated region，DMR）敲除，這種敲除后的孤雄單倍體胚胎干細(xì)胞的基因組更接近精子中的狀態(tài)；進(jìn)一步將雙敲除的孤雄單倍體干細(xì)胞注射到卵母細(xì)胞后，產(chǎn)生健康半克隆小鼠的效率高達(dá)22.3%，這比2012年Yang等［20］的研究結(jié)果提高了10倍，真正意義上將孤雄單倍體胚胎干細(xì)胞由概念上的創(chuàng)新轉(zhuǎn)變?yōu)轭惥訂伪扼w胚胎干細(xì)胞這一強(qiáng)有力的構(gòu)建小鼠模型的工具。次年，Yang等［32］通過孤雌激活的方法，成功獲得了兩株食蟹猴孤雌單倍體胚胎干細(xì)胞MPH1和MPH2。食蟹猴孤雌單倍體胚胎干細(xì)胞具有胚胎干細(xì)胞的典型特征；最重要的是，食蟹猴孤雌單倍體胚胎干細(xì)胞支持體外遺傳操作，能夠用于大規(guī)模的遺傳篩選研究。

2016年Li等［33］將小鼠的孤雌單倍體胚胎干細(xì)胞和大鼠的孤雄單倍體胚胎干細(xì)胞融合在一起，形成的異源二倍體不僅含有穩(wěn)定的基因組，而且具有分化成三胚層和早期生殖細(xì)胞的多能性；同時，小鼠和大鼠單倍體胚胎干細(xì)胞的等位基因?qū)Ξ愒炊扼w中的基因表達(dá)貢獻(xiàn)類似。同年Sagi等［34］和Zhong等［35］分別采用孤雌激活和去除受精卵雄原核的方式，從單倍體孤雌囊胚中獲得了人單倍體胚胎干細(xì)胞系。隨后，Zhong等［35］和Li等［36］證明將敲除了2個印記基因DMR（H19、IG）的孤雌單倍體胚胎干細(xì)胞注射到卵母細(xì)胞中，可以產(chǎn)生存活的孤雌來源小鼠。2年后，Li等［37］研究發(fā)現(xiàn)，敲除了7個母源性高甲基化印記基因（Nespas、Grb10、lgf2r、Snrpn、Kcnq1、Peg3和Gnas）的孤雄單倍體胚胎干細(xì)胞和精子共注射后，采用四倍體補(bǔ)償技術(shù)，可以產(chǎn)生存活的孤雄小鼠，但是這些孤雄小鼠出生后不久便相繼死亡，提示目前仍有很多的印記相關(guān)問題有待研究。

2 類精子單倍體胚胎干細(xì)胞的特性

為了獲得類精子單倍體胚胎干細(xì)胞，首先需要將受精卵中的雌原核去除以獲得孤雄單倍體胚胎，進(jìn)一步將體外培養(yǎng)至囊胚時期的孤雄單倍體胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分離進(jìn)行培養(yǎng)，就可以獲得類精子單倍體胚胎干細(xì)胞。類精子單倍體胚胎干細(xì)胞兼具二倍體干細(xì)胞和單倍體精子的諸多特性，其本質(zhì)仍是胚胎干細(xì)胞，因此在形態(tài)、分化、增殖、基因表達(dá)圖譜等方面都十分類似于二倍體胚胎干細(xì)胞。

類精子單倍體胚胎干細(xì)胞在體外可形成擬胚體，并進(jìn)一步分化為各類型的細(xì)胞。向嚴(yán)重免疫缺陷小鼠皮下注射類精子單倍體胚胎干細(xì)胞后，可產(chǎn)生包含所有胚層的畸胎瘤。把類精子單倍體胚胎干細(xì)胞注射到二倍體囊胚中后，可以在12.5 d的胚胎中體細(xì)胞和生殖系中檢測到類精子單倍體胚胎干細(xì)胞的痕跡［30］。Yang等［20］通過免疫印跡發(fā)現(xiàn)，類精子單倍體胚胎干細(xì)胞表達(dá)胚胎干細(xì)胞的標(biāo)志基因如Nanog、Oct4、Sox2和SSEA1，微陣列表達(dá)圖譜表明其基因表達(dá)模式與小鼠的二倍體胚胎干細(xì)胞接近。類精子單倍體胚胎干細(xì)胞只有一套父源的遺傳物質(zhì)，它的性染色體是X染色體，通過卵胞質(zhì)內(nèi)單細(xì)胞注射技術(shù)，將類精子單倍體胚胎干細(xì)胞注射進(jìn)卵母細(xì)胞，可以使之受精并發(fā)育，產(chǎn)生后代全為雌性的半克隆小鼠。類精子單倍體胚胎干細(xì)胞和孤雌單倍體細(xì)胞相近，通過定期的流式細(xì)胞分選富集單倍體［13，20，30］，可以在體外長期傳代培養(yǎng)并保持單倍體性。上述這些特性使得類精子單倍體胚胎干細(xì)胞支持多輪的基因編輯，進(jìn)而獲得攜帶多基因編輯的小鼠（圖1）。

圖1類精子單倍體胚胎干細(xì)胞上的遺傳修飾可以一步傳遞至子代小鼠中Figure 1 Genetic modification of sperm-like haploid embryonic stem cells can be transmitted to offspring mice in one step

3 基因修飾小鼠模型的發(fā)展歷史

基因修飾小鼠模型一直是科學(xué)界廣泛使用的動物模型之一。1974年Jaenisch等［38］將猴空泡病毒40（SV40）DNA注射到小鼠囊胚腔內(nèi)，這些囊胚大約有40%可以正常發(fā)育且在1歲時也未檢測到腫瘤；用從這些動物的不同器官中提取的DNA進(jìn)行SV40特異性DNA序列檢測，結(jié)果顯示大約40%的成年小鼠的器官中檢測到了SV40表達(dá)。1976年Jaenisch［39］又用小鼠白血病病毒（M-MuLV）感染剛出生的小鼠和植入前的小鼠胚胎（4～8細(xì)胞時期），兩種小鼠均出現(xiàn)病毒誘導(dǎo)的白血病。與新生小鼠感染不同，著床前胚胎的感染可導(dǎo)致病毒整合到生殖系中并傳遞給下一代。1980年Gordon等［40］報告，將基因序列注射到小鼠胚胎的原核中，當(dāng)胚胎被移植到代孕母鼠體內(nèi)并發(fā)育到期時，可以成功地將目的基因序列保留在小鼠基因組中。1981年Evans等［41］成功地建立了小鼠胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cells）的體外培養(yǎng)技術(shù)。1985年，Smithies等［42］在哺乳動物細(xì)胞中通過同源重組完成對特定人類基因的修飾，而又不影響基因組的其他部分。

胚胎干細(xì)胞的體外培養(yǎng)和同源重組技術(shù)的出現(xiàn)是偉大的突破，由于可以精確地操縱小鼠基因組，進(jìn)而可以創(chuàng)建人類疾病的動物模型，因此在過去的50年里推動生物學(xué)研究取得了長足的進(jìn)步［43］。1987年Thomas等［44］首次報告，通過體外同源重組成功突變了小鼠胚胎干細(xì)胞的內(nèi)源性次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（hypoxanthine phosphoribosyl transferase，HPRT）基因。1993年Gu等［45］首次應(yīng)用Cre/LoxP系統(tǒng)，獲得了一個刪除IgH位點(diǎn)的JH-Eμ片段小鼠品系JHT。2009年Geurts等［46］將編碼ZFNs的DNA或mRNA單次注射到單細(xì)胞大鼠胚胎中，導(dǎo)致靶基因位點(diǎn)發(fā)生25%～100%的破壞，并且這些突變可以有效地傳遞給后代。2010年Meyer等［47］通過ZFN介導(dǎo)小鼠受精卵的同源重組。2012年Doudna團(tuán)隊(duì)與Charpentier團(tuán)隊(duì)合作，創(chuàng)造性地將CRISPR/Cas9系統(tǒng)用于基因組的定向編輯［48］。2013年Zhang帶領(lǐng)的團(tuán)隊(duì)首次利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在人和小鼠細(xì)胞的內(nèi)源性基因組位點(diǎn)上實(shí)現(xiàn)了精確編輯［49］。2015年Zhong等［31］將CRISPR/Cas9技術(shù)與類精子單倍體胚胎干細(xì)胞相結(jié)合，通過簡單的步驟可以穩(wěn)定高效地批量獲得基因修飾的半克隆小鼠，實(shí)現(xiàn)了個體水平的基因篩選。

4 構(gòu)建基因修飾小鼠的胚胎操作技術(shù)

構(gòu)建小鼠疾病模型主要包含兩部分：基因組的編輯和胚胎的操作、培養(yǎng)?；蚪M編輯的方法主要有同源重組、病毒、轉(zhuǎn)座子、ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9等。在體外培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞中，外源DNA片段和染色體基因之間如果序列存在相似性，便會發(fā)生同源重組，只是這種重組的頻率非常低［42］。病毒介導(dǎo)的基因組修飾是隨機(jī)的，常用的可整合到基因組上的病毒有慢病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒等。隨機(jī)插入存在破壞正常基因功能的可能，需要在鑒定時加以注意。PiggyBac轉(zhuǎn)座酶通過剪切/粘貼機(jī)制介導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)移［50］。轉(zhuǎn)座過程不依賴DNA復(fù)制，具有較高的插入效率。PiggyBac轉(zhuǎn)座插入的位點(diǎn)同樣不是固定的，存在破壞正?；蚬δ艿目赡埽柙阼b定時加以注意。

ZFN與TALEN都是一類人工合成的限制性內(nèi)切酶，由DNA結(jié)合域與限制性內(nèi)切酶的DNA切割域融合而成，ZFN與TALEN發(fā)生的基因編輯一般是位點(diǎn)特異的。Cas9是一種由向?qū)NA（guide RNA，gRNA）引導(dǎo)，能夠使DNA發(fā)生雙鏈斷裂的核酸內(nèi)切酶。Cas9對基因組的切割依賴于與目的序列配對的gRNA序列以及序列附近的PAM（NGG）位點(diǎn)。CRISPR/Cas特異性編輯所依賴的gRNA的設(shè)計和合成難度也遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于TALEN和ZFN技術(shù)的DNA識別模塊的構(gòu)建過程。所以，CRISPR/Cas技術(shù)是目前實(shí)現(xiàn)基因組精確編輯的最常用手段［48］。

除了上述能對基因組進(jìn)行修飾的分子生物學(xué)技術(shù)外，仍然需要借助胚胎操作技術(shù)將遺傳修飾體現(xiàn)在個體水平上，才能在真正意義上建立可用于研究的基因修飾小鼠模型。目前，廣泛利用原核注射、卵胞質(zhì)內(nèi)注射、基于胚胎干細(xì)胞的囊胚注射、四倍體補(bǔ)償這4種方法來構(gòu)建小鼠模型。

原核注射是第一個被證明可有效產(chǎn)生基因整合小鼠的技術(shù)［40］。它將外源DNA通過顯微注射的方法注射到受精卵的原核內(nèi)，注射的DNA可以整合到小鼠受精卵的基因組中，并穩(wěn)定遺傳給后代。由于DNA都是隨機(jī)整合到基因組上，無法預(yù)測整合的轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)，這就導(dǎo)致每一只原代小鼠有自身獨(dú)特的整合位點(diǎn)、整合方式、拷貝數(shù)，需一一進(jìn)行分析。原核注射也可以結(jié)合PiggyBac系統(tǒng)，從而限定插入局限在基因組的TTAA位點(diǎn)。如果一個原代小鼠的多條染色體發(fā)生轉(zhuǎn)基因的整合，其后代小鼠也可能會產(chǎn)生不同的品系。通常情況下，整合發(fā)生在二細(xì)胞時期之前，但是仍有20%～30%的原代小鼠出現(xiàn)基因整合延遲，發(fā)生在二細(xì)胞之后，就產(chǎn)生了嵌合體［51］。而且多數(shù)原代小鼠傳遞的轉(zhuǎn)基因頻率較低，僅為5%～10%［51］。如果想實(shí)現(xiàn)一只小鼠上有多種基因的轉(zhuǎn)基因整合，就需要將不同的轉(zhuǎn)基因小鼠相互交配。

隨著CRISPR/Cas9技術(shù)的成熟，直接在卵胞質(zhì)內(nèi)注射體外轉(zhuǎn)錄的Cas9 mRNA和gRNA，或是體外組裝好的Cas9蛋白與gRNA復(fù)合物也可以簡單地實(shí)現(xiàn)基因編輯［52］，并且卵胞質(zhì)內(nèi)注射會比原核注射的效率更高［53］。Cas9及gRNA進(jìn)入受精卵后，在特異性的位點(diǎn)產(chǎn)生DNA的雙鏈斷裂，隨后會發(fā)生非同源末端連接修復(fù)或同源重組修復(fù)，前者會產(chǎn)生隨機(jī)的堿基插入或缺失，后者會依照同源的模板將雙鏈斷裂修復(fù)。如果在卵胞質(zhì)內(nèi)注射的同時給予帶有同源臂的模板DNA（Donor），細(xì)胞就可以利用該模板進(jìn)行修復(fù)，從而實(shí)現(xiàn)人為改變指定區(qū)域基因序列的效果。卵胞質(zhì)內(nèi)注射同樣存在一定的延遲，子代小鼠大多存在一定程度的嵌合，將目的基因位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)了特定編輯的原代小鼠與野生型小鼠交配，可以獲得穩(wěn)定的基因編輯小鼠。由于CRISPR/Cas系統(tǒng)的效率取決于gRNA，因此差異較大，但總體而言仍遠(yuǎn)高于原核注射。卵胞質(zhì)內(nèi)注射對RNA純度和濃度的要求較高，否則非常影響胚胎的發(fā)育效率以及基因編輯效率（圖2）。

嵌合體通常指個體的細(xì)胞基因組存在不同的現(xiàn)象。1961年，Tarkowski［54］將遺傳上不同的八細(xì)胞時期的胚胎的透明帶移去，體外培養(yǎng)時讓它們彼此接觸，再將聚集的胚胎移植到代孕母鼠后，產(chǎn)生了存活的嵌合體后代。1968年，Gardner［55］將胚胎干細(xì)胞注射到囊胚腔中也獲得了小鼠嵌合體。嵌合同樣有一定概率發(fā)生在生殖系中，將這種嵌合體小鼠與野生型小鼠交配，可獲得不同基因型的小鼠。這種囊胚注射發(fā)生生殖系傳遞的效率是不穩(wěn)定的，而一種改進(jìn)的被稱為四倍體補(bǔ)償?shù)募夹g(shù)的出現(xiàn)彌補(bǔ)了這一缺陷。四倍體補(bǔ)償將二細(xì)胞時期的胚胎通過電或病毒方式融合，產(chǎn)生四倍體的胚胎，這些四倍體的細(xì)胞后續(xù)只能發(fā)育為胚外組織，而無法發(fā)育產(chǎn)生健康胚胎，但如果此時向四倍體囊胚中注射二倍體的胚胎干細(xì)胞，會產(chǎn)生完全來源于注射的供體干細(xì)胞的健康胚胎。胚胎干細(xì)胞有著成熟的培養(yǎng)、編輯系統(tǒng)，注射經(jīng)過基因編輯的胚胎干細(xì)胞到四倍體囊胚中，就可以獲得基因組完全來自于注射細(xì)胞的小鼠（圖2）。

圖2構(gòu)建基因修飾小鼠模型的胚胎操作方法Figure2 Experimental methodsfor constructing mousemodels

利用類精子單倍體胚胎干細(xì)胞構(gòu)建小鼠模型，完全排除了上述方式產(chǎn)生的原代小鼠基因型不確定、存在嵌合、需要回交、多次鑒定等問題。類精子單倍體胚胎干細(xì)胞可以使卵母細(xì)胞受精形成胚胎，同時可在體外進(jìn)行培養(yǎng)，也可結(jié)合CRISPR/Cas9系統(tǒng)對類精子單倍體胚胎干細(xì)胞進(jìn)行基因的編輯，這個過程同對二倍體胚胎干細(xì)胞進(jìn)行基因編輯一樣。類精子單倍體胚胎干細(xì)胞具有單倍體的特性，每一次的編輯只會產(chǎn)生“是”或“否”的結(jié)果，對編輯后的細(xì)胞進(jìn)行單克隆建系，通過測序就可以判斷基因編輯是否如預(yù)期發(fā)生。如果需要獲得多基因同時編輯的細(xì)胞，只需要在前一輪得到的細(xì)胞系的基礎(chǔ)上再進(jìn)行一輪編輯即可。由于所有的鑒定都是在細(xì)胞層面上完成，鑒定的時間成本較低，建成攜帶指定基因型的類精子單倍體胚胎干細(xì)胞系，注射后產(chǎn)生的原代小鼠的基因型均為編輯且雜合的，不存在嵌合情況，可以直接在原代小鼠中開展研究，并能夠穩(wěn)定地傳遞給下一代（圖2）。

基于類精子單倍體胚胎干細(xì)胞的半克隆技術(shù)相比于原核或卵胞質(zhì)內(nèi)注射、四倍體補(bǔ)償技術(shù)來構(gòu)建復(fù)雜的小鼠模型更具優(yōu)勢（表1）。但是由于只攜帶Y染色體的孤雄胚胎無法發(fā)育至囊胚，所以全部的類精子單倍體胚胎干細(xì)胞的性染色體都是X染色體，注射到卵母細(xì)胞后產(chǎn)生的后代全部是雌性。同時如果編輯的基因本身會影響干細(xì)胞的生存、自我更新過程，細(xì)胞系就難以建立，也無法得到后代小鼠（表1）。

表1常用于構(gòu)建基因修飾小鼠模型的動物實(shí)驗(yàn)手段優(yōu)劣勢比較Table1 Comparison of advantagesand disadvantagesof different animal experiments for constructing mousemodels

5 類精子單倍體胚胎干細(xì)胞構(gòu)建小鼠模型的應(yīng)用

類精子單倍體胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)的半克隆技術(shù)中半克隆是指將類精子單倍體胚胎干細(xì)胞注射至卵母細(xì)胞產(chǎn)生的后代有別于克隆產(chǎn)生的后代，只有一半的遺傳物質(zhì)來源于體外培養(yǎng)的細(xì)胞。基于該技術(shù)，科研人員已經(jīng)在多種復(fù)雜疾病小鼠模型的構(gòu)建方面取得了突破性進(jìn)展（圖3）。

人強(qiáng)直性肌營養(yǎng)不良1型（myotonic dystrophy type 1，DM1）是一種復(fù)雜的遺傳性疾病，主要由強(qiáng)直性肌營養(yǎng)不良蛋白激酶（dystrophia myotonica protein kinase，DMPK）基因3′非編碼區(qū)的CTG重復(fù)擴(kuò)增引起［56-57］；通常隨著重復(fù)數(shù)量的增加而加重表型，最嚴(yán)重時可以發(fā)展為呼吸衰竭和智力遲鈍（如先天性DM1，即CDM）［58］。許多研究都表明，CTG的重復(fù)擴(kuò)增不僅影響DMPK本身的表達(dá)水平，也會影響DMPK鄰近區(qū)域的染色體結(jié)構(gòu)，從而降低鄰近基因的表達(dá)水平［59-60］。攜帶DM1相關(guān)基因Dmpk、Six5和Mbnl1的其中任何一個基因雜合突變的小鼠只能部分重現(xiàn)DM1患者的癥狀［61-63］，而任何一個純合突變的小鼠病情會加重。但在DM1患者中，幾乎不存在Dmpk、Six5和Mbnl1這幾個相關(guān)基因的純合突變。

另外一種DM1的小鼠模型構(gòu)建策略是側(cè)重于重現(xiàn)CTG的重復(fù)。如攜帶人骨架肌動蛋白基因HAS的轉(zhuǎn)基因小鼠，其肌肉HAS非編碼區(qū)插入了大約250個CUG重復(fù)擴(kuò)增［64］。這種轉(zhuǎn)基因小鼠在肌肉多個方面出現(xiàn)了和DM1患者一樣的表型，但并沒有出現(xiàn)DM1患者常見的其他癥狀，如肌肉萎縮和白內(nèi)障［64］。DM1患者出現(xiàn)肌肉萎縮、白內(nèi)障、胰島素抵抗、心臟傳導(dǎo)缺陷等多方面的癥狀，很可能是上述多個基因的表達(dá)不足導(dǎo)致［65-66］。但限于傳統(tǒng)方法的局限性，難以獲得如此多基因同時敲除的小鼠，多基因表達(dá)不足的猜想一直未得到實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。2019年，Yin等［58］通過將Dmpk、Six5和Mbnl1這3個基因敲除的類精子單倍體胚胎干細(xì)胞注射到卵母細(xì)胞后，產(chǎn)生的雜合小鼠出現(xiàn)了DM1的部分表型；進(jìn)一步將Dmpk、Six5、Mbnl1和Dmwd共4個基因敲除的類精子單倍體胚胎干細(xì)胞注射到卵母細(xì)胞后，產(chǎn)生的雜合小鼠重現(xiàn)了DM1患者的絕大多數(shù)病理狀態(tài)。四基因敲除的雜合小鼠模型直接證明了多基因劑量不足效應(yīng)確實(shí)能夠?qū)е翫M1。

圖3類精子單倍體胚胎干細(xì)胞在構(gòu)建疾病模型上的應(yīng)用Figure 3 Application of sperm-like haploid embryonic stem cells in the construction of disease model

苗勒管異常（Müllerian anomalies，MA）包括子宮、宮頸、輸卵管或陰道的各種解剖學(xué)畸形［67-69］。MA女性的生殖能力低下，同時要承受巨大的心理痛苦［70］。關(guān)于MA的病因，遺傳危險因素通常被認(rèn)為具有很強(qiáng)的影響力。但是由于MA患者個體之間存在廣泛的基因異質(zhì)性，很難確定潛在的致病基因［70］。先前的一些研究提示，基因組拷貝數(shù)變異（copy number variations，CNV）參與了MA致?。?0］。2019年，Wang等［70］分析了25例MA患者的全基因組雜交芯片數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)其中有3例患者和苗勒管發(fā)育有關(guān)的基因Gen1（1/25）、Tbx6（1/25）和Lhx1（1/25）存在基因拷貝數(shù)差異。為了進(jìn)一步了解這些基因的拷貝數(shù)差異是否會造成苗勒管發(fā)育異常，研究人員對新的100例MA患者的qPCR數(shù)據(jù)檢驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)，其中有6例患者的Tbx6（4/100）和Lhx1（2/100）存在基因拷貝數(shù)差異。但是Gen1基因雜合敲除小鼠并沒有展現(xiàn)出任何苗勒管畸形表型，提示單基因缺陷并不足以導(dǎo)致苗勒管畸形，而很可能是多基因缺陷造成的。研究人員后續(xù)對這9例MA患者進(jìn)行全基因組測序分析，將目光鎖定到了Gen1/Wnt9b以及Tbx6/Gata3這兩種基因組合。通過分析由類精子單倍體胚胎干細(xì)胞一步獲得的Gen1/Wnt9b雙雜合敲除小鼠的子宮發(fā)現(xiàn)，其確實(shí)比Gen1或Wnt9b單雜敲除小鼠的子宮發(fā)育畸形程度更嚴(yán)重，從而證明Gen1和Wnt9b雙基因缺陷導(dǎo)致了苗勒管畸形的產(chǎn)生［70］。有趣的是，研究人員還確定了4例攜帶Gen1有害突變，但沒有Wnt9b有害突變的個體，這支持Gen1突變對MA致病的遺傳貢獻(xiàn)。由于Gen1中的單個突變不足以引起人或小鼠的MA，其他基因的有害突變可能與Gen1突變協(xié)同作用而引起MA，與MA的高度遺傳異質(zhì)性相符?？傊@些結(jié)果均表明Gen1/Wnt9b是MA致病基因中一個重要的組合，并提示Gen1是MA的主要致病因素［70］。

穩(wěn)定表達(dá)Cas9的類精子單倍體胚胎干細(xì)胞和gRNA文庫結(jié)合會產(chǎn)生一種非常高效便捷的小規(guī)?；蚝Y選系統(tǒng)。每個類精子單倍體胚胎干細(xì)胞中轉(zhuǎn)染一種gRNA后，其基因組被穩(wěn)定表達(dá)的Cas9切割，實(shí)現(xiàn)對應(yīng)的一個基因的編輯，注射到卵母細(xì)胞后又會進(jìn)一步切割母源基因組，產(chǎn)生純合敲除的小鼠。2019年Bai等［71］通過向卵母細(xì)胞注射穩(wěn)定表達(dá)Cas9和以72個預(yù)選基因?yàn)榘袠?biāo)的gRNA文庫的類精子單倍體胚胎干細(xì)胞系，建立了一個文庫基因突變的半克隆小鼠庫，并通過對出生小鼠的骨骼分析篩選出了4個與骨骼發(fā)育相關(guān)的基因，其中Zic1和Clec11a已被報告是骨骼發(fā)育所必需的基因，而Rln1和Irx5基因從未有研究表明對骨骼有影響。Rln1純合敲除小鼠僅在出生時骨骼較小，而Irx5純合敲除小鼠由于骨量減少和骨髓脂肪生成增加，在出生后和成年階段均顯示骨骼異常［4，71］。利用類似的策略，2018年Li等［72］結(jié)合CRISPR/Cas9介導(dǎo)的單堿基編輯器發(fā)現(xiàn)了小鼠原始生殖細(xì)胞（primordial germ cells，PGC）發(fā)育的重要基因Dnd1上有4個與PGC發(fā)育相關(guān)的氨基酸。這種對蛋白質(zhì)關(guān)鍵氨基酸進(jìn)行體內(nèi)遺傳篩選的系統(tǒng)，為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的研究開辟了一個新的體系［4］。該體系的一個潛在應(yīng)用是在小鼠中篩選與疾病發(fā)展相關(guān)基因的功能位點(diǎn)，并與已有的SNVs數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，以預(yù)測疾病相關(guān)基因的致病位點(diǎn)［73］。

上述研究為人和小鼠中多基因致病理論提供了實(shí)驗(yàn)證據(jù)，證明利用類精子單倍體胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)的半克隆技術(shù)作為一種快速有效的實(shí)驗(yàn)檢測手段，可用于鑒定復(fù)雜疾病的小鼠模型中遺傳變異的致病性組合。

6 類精子單倍體胚胎干細(xì)胞技術(shù)構(gòu)建小鼠模型的展望

人類遺傳學(xué)在研究方法和概念上的進(jìn)步加快了對人類致病基因的鑒定過程。當(dāng)某種疾病涉及一個以上基因時，準(zhǔn)確判斷各致病基因突變的貢獻(xiàn)率及其組合形式至關(guān)重要。越來越多疾病的遺傳和突變數(shù)據(jù)也逐漸闡明了多個基因（包括等位基因）聯(lián)合作用如何產(chǎn)生表型效應(yīng)［74］。生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、進(jìn)化學(xué)對于疾病的定義各不相同，但是毋庸置疑的是，環(huán)境、文化、人口等外在因素和遺傳內(nèi)在因素交錯在一起導(dǎo)致了疾病的復(fù)雜性以及人類群體在各種簡單或者復(fù)雜疾病發(fā)生率上的差異。復(fù)雜性狀疾?。╟omplex disease）的發(fā)病由多個基因位點(diǎn)共同參與，且與環(huán)境因素相互作用決定疾病表型，往往是遺傳疾病，如心血管疾病、腫瘤性疾病、自身免疫病等［75］。而且在遺傳疾病中，如果涉及染色體結(jié)構(gòu)或數(shù)量異常，也會增加該遺傳疾病的復(fù)雜性?；陬惥訂伪扼w胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)的半克隆技術(shù)可以獲得多基因突變的小鼠，可以較優(yōu)地模擬涉及多基因、染色體異常（非整倍體）這類復(fù)雜的疾病，從而發(fā)揮其對高風(fēng)險人群的預(yù)測、篩查及干預(yù)作用，為復(fù)雜性狀疾病提供更準(zhǔn)確的診斷、預(yù)后工具。

以神經(jīng)退行性疾病肌萎縮側(cè)索硬化征為例，肌萎縮側(cè)索硬化征（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）即Lou Gehrig′s disease病，是一種成人發(fā)病且致命的罕見神經(jīng)退行性疾?。?6］。ALS以進(jìn)行性肌肉無力、肌肉萎縮和最終癱瘓為特征，診斷后患者生存期從2年到5年不等，僅有10%的ALS患者可以存活10年以上［77］。ALS實(shí)際上和許多成人發(fā)病的神經(jīng)退行性疾病共享許多臨床和病理學(xué)特征，如額顳葉癡呆（frontotemporal dementia，F(xiàn)TD）。在許多患者中，也會觀察到ALS和FTD的共同存在；其中約15%的FTD患者會發(fā)展為ALS，5%～22%的ALS患者發(fā)展為FTD［78］。目前公認(rèn)的ALS發(fā)病機(jī)制主要有以下方面：RNA穩(wěn)定性改變、代謝失調(diào)、運(yùn)動神經(jīng)元細(xì)胞骨架破壞［79］、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力和蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)失調(diào)、線粒體結(jié)構(gòu)或功能受損、谷氨酸介導(dǎo)的興奮性毒性、膠質(zhì)細(xì)胞喪失功能、免疫功能失調(diào)及代謝障礙。自1993年報告第一個ALS相關(guān)基因SOD1后［80］，迄今為止已發(fā)現(xiàn)超過50個基因在其突變的情況下可能引起ALS［81］，只是這些基因?qū)LS的貢獻(xiàn)程度有大有小，而且這些基因存在相同或截然不同的功能，這給早期臨床診斷帶來了巨大的挑戰(zhàn)。

C9ORF72、SOD1、TDP-43、TBK1、OPTN等基因只能解釋不到50%的ALS/FTD患者發(fā)病原因［81］。而且很多時候某個基因的突變不會影響ALS/FTD進(jìn)展，或者即使影響ALS/FTD的發(fā)生，但不顯著改變生存時間；甚至某些基因突變反而可以減緩ALS的癥狀。Gerbino等［82］研究表明，小鼠表達(dá)人的喪失功能、無義突變的TBK1時，并不會出現(xiàn)和神經(jīng)退行有關(guān)的癥狀；但是如果在SOD1G93A這樣經(jīng)典的ALS小鼠中特異性敲除TBK1后，會削弱自噬，增加SOD1聚集，加速疾病進(jìn)展，但不改變生存時間。更令人困惑的是，TBK1上的點(diǎn)突變同樣可以加速疾病的發(fā)生，但可以延長生存時間。

遺傳異質(zhì)性、多基因共同效應(yīng)、每個基因存在不同的突變點(diǎn)、基因功能的交叉性、神經(jīng)元與周圍的膠質(zhì)細(xì)胞共同作用等多方面因素，使得ALS/FTD的深入研究及臨床診治進(jìn)展緩慢，既缺乏ALS發(fā)病早期確診的遺傳學(xué)證據(jù)，也缺乏有效的治療藥物。目前被FDA批準(zhǔn)上市的只有2種藥物（利魯唑和依達(dá)拉奉），既不能治愈ALS/FTD，也不適用于所有的ALS/FTD患者，且藥物對于中位生存時間的增加效果相當(dāng)有限，其中一個重大的障礙是缺乏研究ALS的小鼠模型。

1994年Gurney等［83］通過轉(zhuǎn)基因使得小鼠中高表達(dá)含有G93A點(diǎn)突變的人SOD1蛋白的突變體，這些小鼠脊髓中運(yùn)動神經(jīng)元喪失導(dǎo)致一條或多條肢體癱瘓，并在5～6個月齡時死亡。SOD1G93A小鼠模型確實(shí)重現(xiàn)了ALS的一些指征，如突變的SOD1蛋白異常聚集［84］，星形膠質(zhì)細(xì)胞中EAAT2谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的喪失導(dǎo)致運(yùn)動神經(jīng)元產(chǎn)生興奮性毒性死亡［85］。米諾環(huán)素（minocycline）、頭孢曲松（ceftriaxone）、塞來昔布（celecoxib）、來那度胺（lenalidomide）和其他抗炎藥物在SOD1G93A小鼠中被證明有療效，但在臨床試驗(yàn)中全部失?。?6］。其中一個關(guān)鍵點(diǎn)在于，ALS患者存在實(shí)質(zhì)性的皮質(zhì)運(yùn)動神經(jīng)元退行性變，但是在大多數(shù)SOD1G93A小鼠模型中并沒有明確地看到實(shí)質(zhì)性的皮質(zhì)運(yùn)動神經(jīng)元退行性變［87］。而且高達(dá)50%的ALS患者會共同發(fā)展為FTD，而在SOD1G93A小鼠模型中未發(fā)現(xiàn)［87］。

除了SOD1G93A小鼠模型外，TDP-43小鼠模型也常被用來研究ALS。但無論是SOD1還是TDP-43，單一基因缺陷的小鼠模型都無法完全模擬ALS患者的典型病癥。如果采用類精子單倍體胚胎干細(xì)胞技術(shù)，先在細(xì)胞水平上獲得多個致病基因同時修飾的突變系，除了可以進(jìn)行神經(jīng)元的定向分化以檢測其對神經(jīng)元細(xì)胞功能的影響外，還可以通過半克隆技術(shù)注射后獲得雜合突變的小鼠，有望更好地在小鼠上模擬出ALS癥狀。

除了多基因有關(guān)的復(fù)雜疾病外，基于類精子單倍體胚胎干細(xì)胞獲得的半克隆小鼠也非常適合應(yīng)用于染色體數(shù)目變化相關(guān)疾病的研究。人類胚胎早期致死、流產(chǎn)或出生后發(fā)育缺陷的一個重要原因是染色體數(shù)目的異常，其中三體是染色體數(shù)目變異的一種最普遍的形式［88］。臨床上公認(rèn)的35%的自然流產(chǎn)和4%的死產(chǎn)是由于染色體三體或單體造成，約有0.3%的新生兒為非整倍染色體組［89］。

獲得非整倍性染色體組小鼠模型，研究其發(fā)育過程是相當(dāng)復(fù)雜的。1983年Gropp等［90］通過育種獲得了多種常染色體三體的小鼠胚胎，其中許多三體的胚胎都無法存活到器官發(fā)生階段；將存活時間較長、三體胚胎來源的造血干細(xì)胞移植到輻射損傷的小鼠體內(nèi)后發(fā)現(xiàn)，不同三體胚胎來源的造血干細(xì)胞對造血系統(tǒng)受損小鼠的生存支持能力差異巨大，其中19號染色體三體胚胎來源的造血干細(xì)胞對受損小鼠的支持最好，可以支撐小鼠存活12個月。2004年Baker等［91］發(fā)現(xiàn)紡錘體組裝檢查點(diǎn)蛋白BubR1水平較低的小鼠表現(xiàn)為漸進(jìn)性非整倍體化，并伴隨著壽命短、急腹癥、矮小、跛行、白內(nèi)障、皮下脂肪丟失和傷口愈合受損等多種特征。2008年Lavon等［92］從非整倍體胚胎中獲得整倍體人類胚胎干細(xì)胞，闡明了整倍體和非整倍體嵌合體胚胎發(fā)育過程中，由于整倍體具有競爭優(yōu)勢，因此隨著發(fā)育進(jìn)行，非整倍體細(xì)胞逐漸消失。2016年Bolton等［93］通過活胚胎成像和嵌合胚胎的單細(xì)胞追蹤技術(shù)，發(fā)現(xiàn)從囊胚開始，非整倍體細(xì)胞逐漸減少；而且通過非整倍體和整倍體嵌合實(shí)驗(yàn)證明，一定比例的整倍體細(xì)胞即可支持胚胎發(fā)育。染色體三體小鼠模型中，較常見的一種是Ts16小鼠。小鼠第16號染色體的遠(yuǎn)端部分和人類第21號染色體的長臂之間存在同源性，所以Ts16小鼠常被應(yīng)用于研究人類三體綜合征。Ts16小鼠胎兒具有許多相似的表型特征，包括心臟缺陷和鼻肉瘤，只是Ts16小鼠胎兒會在子宮內(nèi)死亡，使得Ts16小鼠的研究僅限于早期發(fā)育階段［94］。后續(xù)Davisson等［94］構(gòu)建了Ts65Dn小鼠模型，Ts65Dn小鼠能存活至36個月，與人類第21號染色體長臂具有廣泛的同源性。但Ts65Dn小鼠模型只包含了人類第21號染色體長臂的絕大部分，而長臂的少部分以及短臂都被排除在外。如果通過類精子單倍體胚胎干細(xì)胞技術(shù)，在細(xì)胞水平上先構(gòu)建染色體數(shù)目差異的細(xì)胞系，再將其注射進(jìn)卵母細(xì)胞中獲得胚胎，可排除常規(guī)技術(shù)嵌合率低的問題，能更方便地得到非正常倍性的小鼠模型資源，有助于闡明發(fā)生非整倍性現(xiàn)象背后的原因。

綜上，基因修飾小鼠模型的使用讓闡明疾病發(fā)生機(jī)制和進(jìn)行新藥臨床前試驗(yàn)更為直觀、簡便。目前使用傳統(tǒng)技術(shù)手段如原核注射、卵胞質(zhì)內(nèi)注射、基于胚胎干細(xì)胞的囊胚注射或四倍體補(bǔ)償獲得的小鼠模型只是部分模擬了人類疾病的一些基因突變，尚不能完全概括人類疾病的生理和病理機(jī)制。要想解決這些問題，需要建立一個可以最大程度上模擬患者復(fù)雜體系及相關(guān)復(fù)雜機(jī)制的人源化或類人化小鼠模型［95］，這需要科學(xué)界的共同合作。例如，可以結(jié)合臨床上患者的病理、家系、相關(guān)基因突變等信息，利用類精子單倍體胚胎干細(xì)胞獲得和患者攜帶基因突變一致或相關(guān)基因人源化的小鼠模型。這些小鼠的疾病癥狀和嚴(yán)重程度可以更好地反映某些基因?qū)膊〉呢暙I(xiàn)，以實(shí)現(xiàn)生物醫(yī)學(xué)研究的最終目標(biāo)：更深入地了解人類疾病的致病機(jī)制，進(jìn)而開發(fā)出新的診斷方法和改進(jìn)療法。類精子單倍體胚胎干細(xì)胞技術(shù)的出現(xiàn)為構(gòu)建精確可控、多基因、復(fù)雜編輯的小鼠模型提供了一種全新的有力工具。