丁明明 李蕓蕊 鄭芝欣 袁小筍

乳腺癌是女性常見惡性腫瘤，其發(fā)病率據(jù)女性惡性腫瘤首位，近年來我國發(fā)病率逐漸上升，且呈年輕化，嚴重威脅女性健康[1]。化療仍是目前治療乳腺癌的重要方法，仍以蒽環(huán)類及紫杉類為基礎化療為主，但是常因其不良反應限制應用[2]。替吉奧是新一代氟尿嘧啶衍生物口服抗癌劑，含有替加氟(FT)和兩種生化修飾劑——吉美嘧啶(CDHP)及奧替拉西(OXO)，國外研究表明替吉奧對于乳腺癌具有療效高，不良反應小的特點[3]。然而不同患者的療效仍存在明顯差別，說明患者在藥物敏感性上存在個體差別，有研究表明亞甲基四氫葉酸還原酶(methylenetetrahydrofolatereductase，MTHFR)與乳腺癌的化療敏感性有關(guān)[4]。MTHFR是一種黃素蛋白，基因定位于1p36.3，參與葉酸代謝，在DNA甲基化中起著重要作用[5]。MTHFR基因是多態(tài)的，最常見的是C677T和A1298C，這兩個位點的突變都會影響該酶活性，進而影響基因組DNA的甲基化[6]。因此本文對在我院進行替吉奧治療的乳腺癌患者進行MTHFR基因分析，探究MTHFR基因多態(tài)性與臨床療效的關(guān)系，以期為臨床提高敏感性尋找預測指標，從而指導臨床用藥，報告如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選擇2016年3月至2018年3月來我院就診的乳腺癌女性患者138例，年齡為29～76歲，平均年齡(61.31±5.84)歲，其中僅有乳腺原發(fā)灶患者84例，同時有原發(fā)灶和腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者54例，無遠處轉(zhuǎn)移患者。納入標準：①經(jīng)病理證實為乳腺癌；②經(jīng)影像學證實具有可測量腫瘤病灶；③預計生存期>3個月，KPS>60分，且肝、腎、心功能及血常規(guī)基本正常；④1個月內(nèi)未用其他化療藥物者。排除標準：①伴有其他惡性腫瘤患者；②合并其他嚴重疾病；③妊娠期或哺乳期患者；④出現(xiàn)感染患者。本研究經(jīng)醫(yī)學倫理委員會同意。

1.2 基因型分析

1.2.1 標本采集 所有患者化療前抽靜脈血2 ml，置乙二胺四乙酸鈉抗凝管，分離白細胞層。用QIAampDNA提取試劑盒提取白細胞DNA，DNA置-30 ℃低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設計 針對兩種不同位點進行引物設計，引物序列見表1，引物由上海杰李生物技術(shù)有限公司合成。

表1 RT-PCR引物序列

1.2.3 基因分型分型 應用PCR-RFLP技術(shù)檢測兩種基因型，PCR反應體系總體積為25 μl，含10×Buffer 2.5 μl，PCR引物各1.0 μl、dNTP mixture 2.5 μl、Taq聚合酶1IU、基因DNA 0.5 μl。反應條件：94 ℃預變性2 min，變性94 ℃ 30 s、退火30 s(MTHFR C677T為62 ℃，MTHFR A1298C為58 ℃)，72 ℃ 30 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。采用Sequenom公司的時間飛行質(zhì)譜生物芯片系統(tǒng)(Mass Array系統(tǒng))檢測基因分型。MTHFR C677T基因型分為純合子C/C(198bp)、純合子T/T(175bp)、雜合子C/T(198bp/175bp)，MTHFR A1298C基因型分為純合子AA(56bp)、純合子CC(84bp)和雜合子AC(56bp/84bp)。

1.3 治療方法

患者均采用吉他西濱(連云港杰瑞藥業(yè)有限公司，國藥準字 H20123362)及替吉奧(山東新時代藥業(yè)有限公司，國藥準字H20080803)治療，吉他西濱1000 mg/m2，加入0.9%氯化鈉注射液100 ml，靜脈注射30 min，第1、8天。替吉奧劑量：<1.25 m2服用40 mg，1.25～1.5 m2服用50 mg，>1.5 m2服用60 mg，每日2次，于早晚進行服藥，連續(xù)給藥28 d，休息14 d，為一個治療周期，患者均治療3個周期。

1.4 觀察指標

(1)患者治療效果：按照實體瘤療效評價標準(RECIST)[7]判定療效：完全緩解(complete response，CR)：病灶完全消失，短軸值<10 mm；部分緩解(partial remission，PR)：未達到CR，腫瘤病灶半徑之和縮小30%以上；穩(wěn)定(stable disease，SD)：腫瘤病灶半徑之和即達不到PR也達不到PD；進展(progressive disease，PD)：腫瘤病灶半徑之和增加20%以上，半徑總和增加絕對值大于5 mm，或出現(xiàn)新病灶；總有效率(overall response rate，ORR)=(CR例數(shù)+PR例數(shù))/總例數(shù)×100%。(2)患者化療不良反應率：依據(jù)WHO抗癌藥物急性與亞急性毒性反應分級標準將化療不良反應分為0～Ⅳ度[8]，記錄兩組患者不良反應發(fā)生情況。(3)隨訪：以電話及門診形式對所有患者進行隨訪，隨訪內(nèi)容包括：患者病情進展、影像學檢查，記錄患者生存情況，在第1年每3個月隨訪1次，第2～3年，每6個月隨訪1次，隨訪截止時間。

1.5 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 MTHFR基因型與乳腺癌替吉奧治療療效關(guān)系

138例患者的總有效率為71.01%，攜帶MTHFR C677T基因型患者中T/T基因型40例，化療有效率87.50%，C/T基因型65例，化療有效率73.85%，C/C基因型33例，化療有效率45.45%。T/T基因型患者的臨床有效率高于C/C基因型(P<0.05)，與C/T基因型比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。攜帶MTHFR A1298C基因型患者中A/A基因型99例，化療有效率為74.75%，A/C基因型39例，化療有效率61.54%，C/C基因型0例。A/A基因型患者的臨床有效率與A/C及C/C患者比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，結(jié)果見表2。

表2 MTHFR基因型與乳腺癌替吉奧治療療效關(guān)系(例，%)

2.2 MTHFR基因型與乳腺癌替吉奧化療不良反應發(fā)生率的關(guān)系

138例患者中出現(xiàn)Ⅰ～Ⅲ級化療不良反應發(fā)生率為63.77%，其中攜帶MTHFR C677T T/T基因型患者的化療不良反應發(fā)生率為82.50%，C/T基因型為66.15%，C/C基因型為36.36%；T/T基因型化療不良反應發(fā)生率高于C/C基因型(P<0.05)，與C/T基因型無明顯差異(P>0.05)。攜帶MTHFR A1298C A/A基因型患者的化療不良反應發(fā)生率68.69%，A/C基因型為51.28%，A/A基因型化療不良反應發(fā)生率與A/C及C/C患者比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，結(jié)果見表3。

表3 MTHFR基因型與乳腺癌替吉奧化療不良反應發(fā)生率的關(guān)系(例，%)

2.3 不同基因型患者替吉奧治療后生存率分析

138例患者的3年無進展生存率為63.04%，其中攜帶MTHFR C677T T/T、C/T、C/C基因型患者的3年無進展生存率分別為80.00%、69.23%、30.30%，T/T基因型的3年無進展生存率高于C/C基因型(P<0.05)，與C/T基因型比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；攜帶MTHFR A1298C A/A、A/C、C/C基因型3年無進展生存率分別為66.67%、53.85%、0，A/A基因型3年無進展生存率與A/C、C/C基因型比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。138例患者的3年總生存率為81.88%，其中攜帶MTHFR C677T T/T、C/T、C/C基因型患者的3年總生存率分別90.00%、87.69%、60.61%，T/T基因型的3年總生存率高于C/C基因型(P<0.05)，與C/T基因型比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；攜帶MTHFR A1298C A/A、A/C、C/C基因型3年總生存率分別為84.85%、74.36%、0，A/A基因型3年總生存率與A/C、C/C基因型比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，結(jié)果見表4、圖1、圖2。

表4 不同基因型患者替吉奧治療后生存率分析(例，%)

圖1 Kalplan-Meier法分析MTHFR C677T基因型患者生存情況

圖2 Kalplan-Meier法分析A1298C基因型患者生存情況

3 討論

MTHFR是調(diào)節(jié)葉酸和蛋氨酸代謝的酶，能夠催化5,10-亞甲基四氫葉酸(5,10-MTHF)轉(zhuǎn)變?yōu)?-甲基四氫葉酸，5-甲基四氫葉酸是葉酸在血液及組織中存在的主要形式，能夠作為甲基供體經(jīng)蛋氨酸合成酶的催化,使同型半胱氨酸轉(zhuǎn)化為蛋氨酸，進而轉(zhuǎn)化為S-腺苷蛋氨酸，在DNA甲基化中起重要作用，從而影響DNA的合成及修復，并導致癌癥的發(fā)生[9]。若MTHFR酶活力降低，則會導致同型半胱氨酸水平的升高[10]。MTHFR基因位于1號染色體上，該基因是多態(tài)的，其中最常見的是677C→T和1298A→C多態(tài)，位于這2個位點的改變都將影響酶的活性[11]。近來已有研究表明，MTHFR基因多態(tài)性與腫瘤的易感性相關(guān)，程筱雯等[12]研究表明MTHFR C677T的多態(tài)性與消化系統(tǒng)惡性腫瘤發(fā)生頻率相關(guān)。而葉彥軍等[13]研究表明MTHFR基因多態(tài)性通過影響DNA合成及甲基化導致乳腺癌的發(fā)生，并與其發(fā)展及預后相關(guān)。

乳腺癌是常見女性惡性腫瘤，氟尿嘧啶已被證實可有效控制乳腺癌的病情進展，替吉奧是第三代氟尿嘧啶衍生物，其中的FT在線粒體內(nèi)生成5-Fu，CDHP可減輕藥物消化道反應，OXO為DPD酶抑制劑，可減少藥物的降解，其療效良好[14]。但不同個體對藥物的敏感性還是有很大差異，若個體的DNA修復能力較強，則藥物的療效較差。從基因組學研究藥物敏感性差異的原因，對于尋找可預測藥物敏感性的指標，及臨床指導用藥具有重大意義[15]。已有部分研究表明MTHFR基因多態(tài)性與胃腸癌等化療敏感性相關(guān)，如馬丙鈞等[16]納入11項研究表明MTHFR C677T基因多態(tài)性在等位基因模型、純合子模型、顯性模型及隱形模型中，均與5-Fu治療胃腸癌的敏感性增加有關(guān)。還有研究[17]表明MTHFR基因MTHFR C677T及A1298C的SNP對晚期結(jié)直腸癌一線化療藥物的療效具有預測效果。而關(guān)于MTHFR基因多態(tài)性與乳腺癌化療敏感性的研究較為少見，因此本文對MTHFR基因多態(tài)性與替吉奧治療乳腺癌的敏感性進行研究。

本研究中，經(jīng)化療后，攜帶MTHFR C677T T/T基因型患者的臨床有效率、化療不良反應發(fā)生率、3年無進展生存率及3年總生存率均高于C/C基因型，而與C/T型患者無明顯差異。說明MTHFR C677T的基因多態(tài)性與替吉奧治療乳腺癌的療效具有一定相關(guān)性，有可能成為預測其化療敏感性的重要指標。而攜帶MTHFRA1298C A/A基因型患者的臨床有效率、化療不良反應發(fā)生率、3年無進展生存率及3年總生存率與A/C及C/C患者無明顯差異，說明MTHFR A1298C基因多態(tài)性對替吉奧治療乳腺癌療效的敏感性不如MTHFR C677T。本文也存在一定不足，乳腺癌相關(guān)基因多態(tài)性很多，本文僅研究2個位點，未探究不同基因型組合之間的酶活性的差別，且本文中樣本量較少，并未考慮環(huán)境與基因的交互影響，同時研究時間不夠長，會對本文的研究結(jié)果的可靠性產(chǎn)生一定影響，因此后期將擴大樣本量，聯(lián)合多中心，延長時間研究。

綜上，MTHFR基因多態(tài)性與乳腺癌替吉奧治療臨床療效存在著相關(guān)性，對預測療效有一定前景。