李昌安 汪明強(qiáng) 馬志勇 李雪平

胃癌(gastric carcinoma，GC)是最常見的惡性胃腸道癌，也是全球第二大癌癥相關(guān)死亡原因，盡管治療手段不斷改進(jìn)，但是GC的預(yù)后仍然很差[1-2]。跨膜4超家族成員1(Transmembrane-4-L-six-family-1，TM4SF1)，也稱為腫瘤相關(guān)抗原L6，是一種22 kda的四跨膜結(jié)構(gòu)域蛋白[3]。TM4SF1在各種人類上皮惡性腫瘤(包括肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、卵巢癌、腎癌和前列腺癌)的質(zhì)膜和細(xì)胞內(nèi)小泡中異常表達(dá)，在正常血管內(nèi)皮細(xì)胞中則高表達(dá)[4]。免疫熒光顯微鏡也顯示TM4SF1沉積在細(xì)胞質(zhì)中，并初步存在于培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞核中。TM4SF1已被證明與腫瘤細(xì)胞的生長、運(yùn)動、侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)。然而，TM4SF1在包括人類胃癌在內(nèi)的癌癥中的確切作用仍不清楚。因此本文選取68例胃癌患者的臨床資料進(jìn)行回顧性分析，探討TM4SF1水平與胃癌病理特征的相關(guān)性，具體報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取我院2017年5月至2020年4月共收治的68例胃癌患者作為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)胃鏡檢查及組織病理學(xué)確診為胃癌；接受紫杉醇、氟尿嘧啶等常規(guī)化療藥物治療；身體狀況及血液檢查均能耐受化療；研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者簽字同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：胃癌遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移且不能進(jìn)行根治性手術(shù)；合并其他嚴(yán)重惡性腫瘤；合并心、肝、腎等器官疾?。缓喜⒏腥拘曰虼x性疾??；有慢性營養(yǎng)不良史。68例患者中男性39例，女性29例；年齡為42～68歲，平均年齡(54.32±8.92)歲；病程3個月～1年，平均(0.64±0.34)年。

1.2 方法

所有患者均采用胃癌根治術(shù)切除病灶組織并作為研究樣本，去除結(jié)締組織及壞死組織；并于病灶四周5 cm以外取胃黏膜組織作為癌旁組織樣本。TM4SF1染色的免疫組化及定量分析：石蠟包埋切片(4 μm厚)去石蠟切片，再水化，在10 mmol/L檸檬酸鈉(pH 6.0)中加熱10 min，以回收抗原。內(nèi)源性過氧化物酶用3%H2O2猝滅。在4 °C下與一級抗體(抗TM4SF1，1∶200，Abcam)孵育后，用辣根過氧化物酶標(biāo)記的聚合物與二級抗體(Max Vision)于室溫下共同孵育15 min后，在二氨基聯(lián)苯胺中顯影并用蘇木精輕微復(fù)染。陰性對照組除不加原發(fā)性抗體外，其余程序均相同。免疫組化結(jié)果由兩名對臨床資料不了解的病理學(xué)家獨(dú)立評估。在×200的條件下，對每個截面進(jìn)行了5個隨機(jī)視野檢查。腫瘤組織中TM4SF1的表達(dá)程度采用分級系統(tǒng)：0分為陰性染色；1分為淺黃色染色；2分為淺棕色染色；3分為深褐色染色。得分0定義為TM4SF1陰性，分?jǐn)?shù)1～3為TM4SF1陽性。

免疫分析法：將均質(zhì)化的根治性手術(shù)前胃癌組織和根治性手術(shù)后胃黏膜組織織標(biāo)本置于RIPA裂解緩沖液中進(jìn)行裂解。在4 ℃下將裂解物(13 800 g)離心30 min。上清液用于Western blotting分析。用十二烷基硫酸鈉(SDS)負(fù)載緩沖液變性，在10%SDS聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離，然后轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上。用5%脫脂牛奶封閉1 h后，用兔抗TM4SF1單克隆抗體(1∶1000稀釋度，Abcam)或小鼠抗人GAPDH單克隆抗體(1∶2000稀釋度，Sigma-Aldrich)在4 ℃下孵育過夜。在用Tris-緩沖鹽水和吐溫-20(TBST)洗滌3次，每次10 min后，在室溫下用辣根周氧化酶(HRP)結(jié)合的小鼠抗兔IgG抗體(1∶2000稀釋，Sigma Chemical Co.，St Louis，MO)探測1 h。用TBST洗滌后，使用化學(xué)發(fā)光光電表面辣根過氧化物酶試劑盒進(jìn)行顯色并觀察，具體顯色過程根據(jù)試劑盒制造商的相關(guān)說明。采用Quantity One軟件(Bio-Rad，Hercules，CA)用密度計測量譜帶強(qiáng)度。TM4SF1蛋白水平標(biāo)準(zhǔn)化為GAPDH。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 腫瘤組織與癌旁組織TM4SF1表達(dá)水平對比

免疫組化分析顯示，在GC組織中TM4SF1的陽性表達(dá)率為(16.6±3.9)%，顯著低于癌旁組織的陽性表達(dá)率(57.4±11.0)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=8.563，P<0.001)。

2.2 TM4SF1表達(dá)與胃癌患者臨床病理特征的相關(guān)性

TM4SF1陰性患者與TM4SF1陽性患者的性別、年齡、腫瘤大小和侵入深度對比無明顯差異(P>0.05)，TM4SF1陰性患者與TM4SF1陽性患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、腫瘤TNM分期情況對比差異顯著(P<0.05)，如表1所示。

表1 TM4SF1表達(dá)與胃癌患者的臨床病理特征的相關(guān)性

2.3 TM4SF1水平與胃癌病理特征相關(guān)性分析

Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示：TM4SF1水平與胃癌患者的性別、年齡、腫瘤大小和侵入程度無明顯相關(guān)性(P>0.05)，TM4SF1水平與胃癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和腫瘤TNM分期呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，如表2所示。

表2 TM4SF1水平與胃癌病理特征相關(guān)性分析

3 討論

跨膜4超家族成員1(TM4SF1)在多種上皮來源的腫瘤中出現(xiàn)異常表達(dá)，如胰腺癌、肝癌、結(jié)直腸癌等。TM4SF1參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的生長、增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等過程，有望成為腫瘤早期診斷、病情預(yù)測及預(yù)后的指標(biāo)，因其在惡性腫瘤細(xì)胞中選擇性表達(dá)，也可成為腫瘤靶向治療的靶點(diǎn)。相關(guān)研究顯示[5]，USP10、S100A12、p53和Ki67是癌癥侵襲和轉(zhuǎn)移的腫瘤分子標(biāo)志物。還有研究顯示[6]，S100A12的表達(dá)與侵襲深度有關(guān)，并被評估為GC整體生存率差的獨(dú)立危險因素，p53和Ki67是癌癥進(jìn)展的既定標(biāo)志物。在目前的研究中[7]，我們發(fā)現(xiàn)TM4SF1的表達(dá)與胃癌中USP10、S100A12、p53或Ki67的表達(dá)沒有相關(guān)性，這表明TM4SF1在胃癌侵襲轉(zhuǎn)移中起著不同于USP10、S100A12、p53或Ki67的作用。TM4SF1在胃癌侵襲轉(zhuǎn)移中的確切作用值得進(jìn)一步研究。

相關(guān)研究顯示[8]，TM4SF1低表達(dá)與胃癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。還有研究顯示[9]，胃癌與肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、卵巢癌、腎癌和前列腺癌等不同，胃癌患者的TM4SF1 mRNA和蛋白水平比較低，與本研究相符；TM4SF1在GC組織中呈陰性表達(dá)，在相鄰非癌組織中呈陽性表達(dá)。在我們的患者隊列中，免疫組化分析顯示，在GC組織中TM4SF1的表達(dá)率，顯著低于非癌性胃黏膜組織表達(dá)率(P<0.05)。相關(guān)研究表明[10]，TM4SF1在多種類型的上皮來源惡性腫瘤與供應(yīng)腫瘤血管內(nèi)皮呈現(xiàn)低表達(dá)狀態(tài)。還有研究表明[11]，TM4SF1的過表達(dá)會促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞中MAD-MB-231轉(zhuǎn)移，并且抑制其凋亡情況。Tu，S等研究發(fā)現(xiàn)[12]，TM4SF1在侵襲性膀胱癌組織之中表達(dá)高于癌旁組織。本研究發(fā)現(xiàn)TM4SF1陰性患者與TM4SF1陽性患者的性別、年齡、腫瘤大小和侵入深度對比無明顯差異(P>0.05)，TM4SF1陰性患者與TM4SF1陽性患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、腫瘤TNM分期情況對比差異顯著(P<0.05)，由此證明，TM4SF1的丟失對胃癌細(xì)胞的侵襲和遷移有促進(jìn)作用。然而，其他研究表明[13]，TM4SF1的高表達(dá)與MIBC(肌肉浸潤性膀胱癌)患者的T分期、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況有關(guān)。TM4SF1在腫瘤進(jìn)展和侵襲中的作用似乎也是組織特異性的。Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示：TM4SF1水平與胃癌患者的性別、年齡、腫瘤大小和侵入程度無明顯相關(guān)性(P>0.05)，TM4SF1水平與胃癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和腫瘤TNM分期呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，由此證明，TM4SF1可能參與了胃癌的發(fā)生發(fā)展過程，可以作為胃癌患者治療和預(yù)后情況判斷的重要指標(biāo)。

綜上所述，胃癌組織中TM4SF1蛋白水平低于癌旁組織，是GC的抑癌劑，也是胃癌患者的一種新的預(yù)測標(biāo)志物，但其確切作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。