張娜娜

乳腺癌發(fā)病率逐年升高，以成為我國女性最好發(fā)的腫瘤。其并發(fā)癥多、危險性大，預(yù)后差，早期臨床癥狀并不明顯，大多數(shù)病人出現(xiàn)乳房皮膚改變、引流區(qū)淋巴結(jié)腫大時已是疾病晚期[1-3]。近年來，一些與細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)的基因和/或蛋白質(zhì)產(chǎn)物，如CAS(細(xì)胞凋亡易感性CAS基因)、Bcl-2和caspase-3與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和治療反應(yīng)有關(guān)。然而，它們與乳腺癌的關(guān)系尚不明確，其是否具有臨床應(yīng)用價值仍有待確定。CAS基因(位于20q13染色體上)是人類必需的酵母染色體分離基因CSE1的同源基因。該蛋白是1種與細(xì)胞增殖和腫瘤壞死家族(TNF)介導(dǎo)的凋亡相關(guān)的核轉(zhuǎn)運因子。它作用于細(xì)胞周期的G1檢查點，確保染色體的精確分離。在正常細(xì)胞中，CAS可能起到“開關(guān)”的作用，決定1個細(xì)胞是增殖還是凋亡。過度表達(dá)(由于基因擴增)和/或缺失是CAS誘導(dǎo)或促進(jìn)腫瘤形成的機制。Bcl-2基因(18q21)是1種編碼25kd蛋白的細(xì)胞原癌基因[4]。在生理條件下，它控制線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的通透性，并通過阻斷細(xì)胞色素c的釋放來抑制細(xì)胞凋亡。它在多種正常組織的干細(xì)胞中表達(dá)，大多數(shù)情況下僅限于未分化的增殖細(xì)胞。在子宮內(nèi)膜，它表現(xiàn)出周期性變化，明顯與激素水平有關(guān)。在月經(jīng)周期后期缺乏Bcl-2蛋白，一旦滋養(yǎng)激素水平下降，乳腺細(xì)胞容易發(fā)生程序性細(xì)胞死亡。該基因的過度表達(dá)延長了細(xì)胞存活時間，并與腫瘤轉(zhuǎn)化相關(guān)。事實上，這種蛋白的異常表達(dá)出現(xiàn)在一些癌癥中，并且與治療反應(yīng)和結(jié)果相關(guān)[5]。關(guān)于Caspase-3，Bcl-2在腫瘤生物學(xué)中的作用及其預(yù)后價值仍有爭議[6]。因此本文選取我院2019年8月至2020年8月共收治的89例乳腺癌患者作為研究對象，探討Caspase-3和Bcl-2的表達(dá)與乳腺癌細(xì)胞凋亡及乳腺癌臨床病理特征的相關(guān)性，具體報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取我院2019年8月至2020年8月共收治的89例乳腺癌患者作為研究對象，分為乳腺癌組，另選取56例非腫瘤性鄰近乳腺的蛋白表達(dá)進(jìn)行對比分析，分為對照組。其中乳腺癌患者中，年齡45～68歲，平均年齡(54.32±8.92)歲；平均BMI為(23.45±3.46)kg/m2；病程(7.64±1.34)個月。對照組患者中，年齡43～70歲，平均年齡(54.78±7.32)歲；平均BMI為(23.12±3.48)kg/m2，兩組患者一般資料對比無顯著差異(P>0.05)，具有可比性。

1.2 入選標(biāo)準(zhǔn)與排除標(biāo)準(zhǔn)

入選標(biāo)準(zhǔn)：臨床資料與病理資料完整，患者治療依從性好；術(shù)后依照乳腺癌診療規(guī)范并依照病情進(jìn)行相應(yīng)的治療；溝通手術(shù)后的病理診斷確診為乳腺癌患者；在術(shù)前未經(jīng)免疫治療、化療以及放療等；無手術(shù)禁忌癥，具備手術(shù)指征；所有患者對本研究知情并簽署知情同意書。

排除標(biāo)準(zhǔn)：臨床資料不全；嚴(yán)重器官功能不全；不愿意接受病理檢查的患者；孕婦或者哺乳期婦女；合并其他惡性腫瘤患者；合并精神類疾病或認(rèn)知障礙患者。

1.3 方法

根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)標(biāo)準(zhǔn)對鄰近子宮內(nèi)膜和腫瘤進(jìn)行組織學(xué)分類。乳腺組織分為三類：萎縮性，單純增生，無異型性，復(fù)雜增生，有無異型性。乳腺癌有10%的另一種細(xì)胞類型被歸類為混合型。

免疫組織化學(xué)法：在每一個病例中，回顧所有的患者腫瘤組織切片，并選擇1到2個有代表性的腫瘤組織塊進(jìn)行免疫組化分析。用標(biāo)記的抗生物素-生物素復(fù)合物(ABC)過氧化物酶AEC(3氨基-9乙基咔唑)系統(tǒng)在2～4 μm切片(福爾馬林液固定石蠟包埋組織)中對CAS、Bcl-2和caspase-3進(jìn)行免疫過氧化物酶染色，并將其安裝在聚賴氨酸涂層載玻片上，脫去石蠟，然后通過分級酒精再水化為水。

免疫組化結(jié)果判定：對于研究中使用的所有抗體，只對細(xì)胞質(zhì)中的免疫反應(yīng)性(均勻和偶爾有點狀)進(jìn)行評分。根據(jù)陽性腫瘤細(xì)胞的數(shù)量，半定量評分如下：0%(0分)，<10%(1分)，10%～50%(2分)，51%～80%(3分)，>80%(4分)。染色強度也被評估為弱(1+)、中等(2+)和強(3+)。對于每一個病例，兩個參數(shù)(陽性細(xì)胞百分比和優(yōu)勢強度)的值是多重的，得到0到12的分?jǐn)?shù)(Remmele評分)。作為外部對照，采用乳腺組織切片。組織切片中含有不同比例的免疫染色非腫瘤細(xì)胞，作為內(nèi)部陽性對照。腫瘤細(xì)胞和正常對照細(xì)胞完全陰性的標(biāo)本被排除在分析之外。最后，對于所有病例被分為三個不同的組：陰性病例(<10%陽性細(xì)胞或RS=0～1)、低表達(dá)病例(10%～50%陽性細(xì)胞或RS=2～6)和高表達(dá)病例(>50%陽性細(xì)胞或RS=8～12)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌胞質(zhì)中CAS、Bcl-2、Bax和caspase-3的免疫組化分析結(jié)果

乳腺癌腫瘤中CAS 、aspase-3、Bcl-2蛋白表達(dá)與非腫瘤蛋白表達(dá)差異顯著(P<0.05)。且在乳腺腫瘤萎縮(n=24)、單純增生(n=10)和復(fù)雜增生(n=22)的病例中，caspase-3(P=0.003)和Bax(P=0.04)的表達(dá)水平低于癌細(xì)胞，而Bcl-2的表達(dá)水平無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.32)。

2.2 乳腺癌胞質(zhì)中CAS、Bcl-2、Bax和caspase-3與其臨床病理特征的關(guān)系

89例乳腺癌患者中，胞質(zhì)中CAS、Bcl-2、Bax和caspase-3在不同年齡患者中無顯著差異(P>0.05)，在不同分化程度和臨床分期中對比差異顯著(P<0.05)，CAS和Bcl-2低分化患者顯著高于高、中分化，Ⅲ～Ⅳ期患者顯著高于Ⅰ～Ⅱ期患者(P<0.05)，caspase-3低分化患者顯著低于高、中分化，Ⅲ～Ⅳ期患者顯著低于Ⅰ～Ⅱ期患者(P<0.05)。如表1所示。

表1 乳腺癌胞質(zhì)中CAS、Bcl-2、Bax和caspase-3表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2.3 CAS、Bcl-2、Bax和caspases-3在不同類型標(biāo)本中<10%細(xì)胞中的表達(dá)分布

通過對比CAS、Bcl-2、Bax和caspases-3在不同類型標(biāo)本中<10%細(xì)胞中的表達(dá)分布發(fā)現(xiàn)，CAS標(biāo)本中<10%細(xì)胞陽性表達(dá)例數(shù)萎縮性組、單存增生組、復(fù)雜增生和乳腺癌組對比差異顯著(P<0.05)，具有統(tǒng)計學(xué)意義。Bcl-2標(biāo)本中<10%細(xì)胞陽性表達(dá)例數(shù)萎縮性組、單存增生組、復(fù)雜增生和乳腺癌組對比無顯著差異(P>0.05)，無統(tǒng)計學(xué)意義caspases-3標(biāo)本中<10%細(xì)胞陽性表達(dá)例數(shù)萎縮性組、單存增生組、復(fù)雜增生和乳腺癌組對比差異顯著(P<0.05)，具有統(tǒng)計學(xué)意義。如表2所示。

表2 CAS、Bcl-2、Bax和caspases-3在不同類型標(biāo)本中<10%細(xì)胞中的表達(dá)分布/%

2.4 乳腺癌患者的總生存率相關(guān)性分析

采用Cox比例風(fēng)險模型，F(xiàn)IGO分期(P<0.0001)、腫瘤分級(P=0.001)和組織學(xué)類型(P=0.001)是獨立的預(yù)后因素。Caspase-3水平接近顯著水平(P=0.07)。高CAS水平(>50%陽性細(xì)胞)也可縮短患者生存期。雖然在單變量分析中幾乎顯著(P=0.057)，但在多變量檢驗中顯示出獨立的預(yù)后價值(P=0.04)。如表3。

表3 乳腺癌患者總生存率的相關(guān)性單因素與多因素分析

3 討論

隨著近年來乳腺癌患病率逐年增加，現(xiàn)已成為我國女性最好發(fā)的腫瘤，占女性惡性腫瘤發(fā)病率的7%～10%[7-8]。40～60歲絕經(jīng)前后的婦女為乳腺癌高危人群，研究表明[9]，這可能與該階段女性激素水平失調(diào)，雌激素水平增高存在著一定的關(guān)系。因此，對于乳腺癌疾病來說，應(yīng)遵循早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療的基本原則，其在確保有效的提升患者生存率，改善預(yù)后方面起到了極為重要的作用。因此相關(guān)指標(biāo)研究成為了當(dāng)前乳腺癌確診與治療評價研究的重點內(nèi)容。CAS、Bcl-2和caspase-3在乳腺癌的增殖和凋亡調(diào)控中起著病理遺傳學(xué)的作用。我們觀察到增殖相關(guān)因子(CAS)和凋亡相關(guān)因子(CAS和caspase-3)的表達(dá)從萎縮到增生(簡單和復(fù)雜)逐漸增加到癌。我們關(guān)于CAS的數(shù)據(jù)也提供了這兩個過程之間的聯(lián)系并提示該蛋白在腔內(nèi)腫瘤形成中的關(guān)鍵作用。

乳腺癌腫瘤中CAS、caspase-3、Bcl-2蛋白表達(dá)與非腫瘤蛋白表達(dá)差異顯著(P<0.05)。且在乳腺腫瘤萎縮(n=24)、單純增生(n=10)和復(fù)雜增生(n=22)的病例中，caspase-3(P=0.003)和Bax(P=0.04)的表達(dá)水平低于癌細(xì)胞，而Bcl-2的表達(dá)水平更高，盡管這種蛋白的結(jié)果沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.32)，腫瘤的凋亡和增殖活性通常隨組織學(xué)分級而增加，并與疾病進(jìn)展相關(guān)。與這些觀察結(jié)果一致的是，我們觀察到3級腫瘤中CAS蛋白水平較高。據(jù)報道[10]，CAS和Ki-67染色之間的關(guān)聯(lián)強烈支持前者在細(xì)胞增殖中的作用。在目前的系列研究中，沒有發(fā)現(xiàn)與組織學(xué)類型和腫瘤分期相關(guān)；例如，惡性黑色素瘤主要在晚期表現(xiàn)出CAS過度表達(dá)。除了常見的臨床病理因素，如組織學(xué)類型、分級和FIGO分期外，高水平的CAS與我們的患者較差的預(yù)后獨立相關(guān)。而且我們能夠確定一部分預(yù)后不良的老年患者。第二次腫瘤患者的所有原發(fā)性乳腺腫瘤均含有高水平的CAS，這一事實進(jìn)一步支持了這些發(fā)現(xiàn)，盡管由于該組患者人數(shù)較少，這些結(jié)果沒有達(dá)到統(tǒng)計學(xué)意義。我們和其他人的分子研究也支持CAS的預(yù)后相關(guān)性[11]；89例乳腺癌患者中，胞漿中CAS不同細(xì)胞比例中腫瘤等級、年齡對比差異顯著(P<0.05)，胞漿中Bcl-2不同細(xì)胞比例中年齡指標(biāo)對比差異顯著(P<0.05)，Bcl-2在乳腺細(xì)胞更新中的作用已經(jīng)得到了比較充分的證實。Bcl-2低表達(dá)或缺失與高凋亡率相關(guān),與先前的研究一致，我們觀察到Bcl-2在萎縮-增生-非典型增生乳腺癌序列中的下調(diào)，盡管結(jié)果沒有統(tǒng)計學(xué)意義。與組織學(xué)類型、分級和腫瘤分期無關(guān)，但在最近的一系列乳腺癌中，Bcl-2的表達(dá)與高分化病變、性激素受體免疫反應(yīng)性、早期和預(yù)后良好相關(guān)[12]。caspase-3的表達(dá)從萎縮、增生到癌的進(jìn)展性增加，提示子宮內(nèi)膜瘤樣病變的表達(dá)上調(diào)。其他腫瘤類型也有上調(diào)的報道。Caspase-3在乳腺癌樣本中的表達(dá)頻率高于非乳腺癌樣本。我們觀察到與蛋白質(zhì)水平、級別、階段或年齡無關(guān)。然而，神經(jīng)母細(xì)胞瘤(36例)與肺母細(xì)胞瘤呈顯著正相關(guān)。當(dāng)腫瘤中含有高比例的caspase-3陽性細(xì)胞時，患者的生存期較短，這在一些瘤乳腺癌中有報道[13]； CAS標(biāo)本中<10%細(xì)胞陽性表達(dá)例數(shù)萎縮性組、單存增生組、復(fù)雜增生和乳腺癌組對比差異顯著(P<0.05)。Bcl-2標(biāo)本中<10%細(xì)胞陽性表達(dá)例數(shù)萎縮性組、單存增生組、復(fù)雜增生和乳腺癌組對比無顯著差異(P>0.05)，caspases-3標(biāo)本中<10%細(xì)胞陽性表達(dá)例數(shù)萎縮性組、單存增生組、復(fù)雜增生和乳腺癌組對比差異顯著(P<0.05)；采用Cox比例風(fēng)險模型，F(xiàn)IGO分期(P<0.0001)、腫瘤分級(P=0.001)和組織學(xué)類型(P=0.001)是獨立的預(yù)后因素。Caspase-3水平接近顯著水平(P=0.07)。高CAS水平(>50%陽性細(xì)胞)也可縮短患者生存期。雖然在單變量分析中幾乎顯著(P=0.057)，但在多變量檢驗中，它顯示出獨立的預(yù)后價值(P=0.04)，對所研究蛋白質(zhì)的相關(guān)分析表明了幾個結(jié)論,CAS、和caspase-3之間的顯著關(guān)聯(lián)可能表明CAS參與了TNF-受體相關(guān)凋亡途徑的控制。caspase-3與Bcl-2呈負(fù)相關(guān)，與這些分子的促凋亡功能一致。與本文關(guān)于caspase-3雙重作用的數(shù)據(jù)一致，其他研究者發(fā)現(xiàn)上皮細(xì)胞上調(diào)，顯示出增殖和凋亡。此外，caspase-3和CAS水平之間的強相關(guān)性表明，在這些腫瘤中存在高細(xì)胞更新，這一發(fā)現(xiàn)可能是它們更具攻擊性的原因[14-15]。因此，正如其他作者所建議的，caspase-3蛋白的存在可能對有效的化療很重要。

綜上所述，CAS、Bcl-2和caspase-3在從單純增生到復(fù)雜增生到癌的增殖和凋亡的進(jìn)行性調(diào)控中起著重要作用。此外，CAS和caspase-3蛋白水平可能是預(yù)測乳腺癌患者預(yù)后的相關(guān)指標(biāo)。