薛小芳 岳會珠 何涯麗

宮頸癌是當(dāng)前婦科中最常見的1種惡性腫瘤，發(fā)病率為世界的第二位。30～35歲發(fā)病率最高，而50～55歲浸潤性癌的發(fā)病率最高[1]。早期宮頸癌患者治療效果比較好，而且5年生存率比較高，但是對于晚期宮頸癌患者來說，由于化療敏感性差，所以降低了患者的生存率。因此，需要更多分子生物學(xué)指標(biāo)來判斷宮頸癌患者對不同治療的反應(yīng)及惡性程度。自噬是一種細胞內(nèi)的大量降解系統(tǒng)，起著各種生理作用，如發(fā)育、分化和維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)。自噬功能障礙與嚴重疾病有關(guān)，包括肌病、神經(jīng)退行性疾病和癌癥。這個多步驟的過程是由一組進化上保守的稱為自噬相關(guān)蛋白(Atg)的蛋白質(zhì)來完成的[2]。Beclin-1是酵母Atg6的哺乳動物同源體，是自噬的關(guān)鍵介質(zhì)。它與調(diào)節(jié)自噬的多種共因子相互作用，其功能障礙與許多疾病有關(guān)，包括許多類型的人類癌癥。自噬的誘導(dǎo)是由稱為自噬體的雙膜結(jié)構(gòu)的形成開始的。自噬體包裹著細胞器和微生物等物質(zhì)，并與降解這些物質(zhì)的溶酶體融合。形成自噬體包括一個泛素樣的共軛系統(tǒng)，其中Atg5與Atg12共價結(jié)合。Atg5是共價修飾系統(tǒng)所必需的，對自噬的發(fā)生至關(guān)重要。最近的證據(jù)表明，自噬可能在宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用[3-4]。因此本文選取我院2017年6月至2020年6月共收治的60例宮頸癌患者作為研究對象，探討自噬相關(guān)基因5(Atg5)及Beclin-1兩種蛋白在宮頸癌組織中的表達及與臨床病理的相關(guān)性，具體報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取我院2017年6月至2020年6月共收治的60例宮頸癌患者作為研究對象，將其分為惡性組。入選標(biāo)準(zhǔn)：所有患者經(jīng)過病理學(xué)檢查確診為宮頸癌；在術(shù)前未經(jīng)免疫治療、化療以及放療等；無手術(shù)禁忌癥，具備手術(shù)指征；所有患者對本研究知情并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：存在嚴重臟器功能障礙的患者；不能配合隨訪的患者；合并其他惡性腫瘤的患者。其中惡性組患者年齡41～68歲，平均年齡(56.22±3.51)歲；平均病程(12.22±1.24)個月。取同期60例良性子宮肌瘤或子宮腺肌瘤行全子宮切除手術(shù)的患者作為良性組，另取同期60例健康者的子宮頸組織標(biāo)本進行分析，將其分為對照組。其中良性組患者中年齡45～69歲，平均年齡(55.34±4.55)歲；平均病程(12.44±1.35)個月。對照組患者年齡42～70歲，平均年齡(54.45±3.61)三組患者一般資料對比無顯著差異(P>0.05)。

1.2 方法

免疫組織化學(xué)法：將收集的標(biāo)本在冰上進行石蠟包埋，注意盡量將所有組織覆蓋，然后放入-20 ℃冰箱20～30 min，設(shè)置切片機3 μm，連續(xù)切片，認真選取形態(tài)較好、組織完整的切片放到35 ℃溫水中，等到切片完全展平后收于防脫載玻片上，晾干后置于玻片架上，放入烤箱，調(diào)節(jié)烤箱溫度為65 ℃，烘烤2 h。

總RNA提?。簭牧阆?0 ℃的冰箱中取出不同類型的宮頸癌組織，將100 mg組織放入研缽之中加入氮液研磨，最后磨成粉末，加入BufferRLT1 ml進行反復(fù)的吹打，讓樣品能夠充分的裂解，并在室溫5 min等待核酸蛋白復(fù)合物分離，之后按照說明嚴格步驟提取RNA，并進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

免疫組化結(jié)果判定：應(yīng)用半定量計分法，細胞核內(nèi)和細胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒，判定為陽性。并依照切片之中細胞染色強度與陽性細胞總數(shù)分析。其中陽性著色重度為3分，中度為2分，輕度為1分，背景清晰無色為0分。陽性細胞數(shù)量>75%為3分，25%～75%為2分，<25%為1分?？偡钟?～6分為陽性[5]。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 三組患者Atg5 mRNA及Beclin-1 mRNA的表達情況對比分析

三組患者Atg5 mRNA及Beclin-1 mRNA表達情況對比差異顯著，惡性組明顯低于良性組和對照組(P<0.05)，如表1所示。

表1 三組患者Atg5 mRNA及Beclin-1 mRNA的表達情況對比分析

2.2 三組患者Atg5和Beclin1蛋白表達陽性率對比分析

三組患者Atg5陽性與陰性患者例數(shù)對比差異顯著(P<0.05)，Beclin1陽性與陰性患者例數(shù)對比差異顯著(P<0.05)，如表2所示。

表2 三組患者Atg5和Beclin1蛋白表達陽性率對比分析(例，%)

2.3 60例宮頸癌患者Atg5和Beclin1陽性與陰性患者臨床病理特征對比分析

60例宮頸癌患者中，Atg5陽性與Atg5陰性患者月經(jīng)狀態(tài)、年齡、腫瘤大小對比無明顯差異(P>0.05)，兩組患者的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織分化程度對比差異顯著(P<0.05)，Beclin1陽性與Beclin1陰性患者月經(jīng)狀態(tài)、年齡、腫瘤大小對比無明顯差異(P>0.05)，兩組患者的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織分化程度對比差異顯著(P<0.05)，如表3所示。

表3 60例宮頸癌患者Atg5和Beclin1陽性與陰性患者臨床病理特征對比分析/例

2.4 自噬相關(guān)基因Atg5和Beclin1與宮頸癌病理相關(guān)性分析

Spearman相關(guān)分析顯示，月經(jīng)狀態(tài)、年齡、腫瘤大小與自噬相關(guān)基因Beclin1和Atg5不相關(guān)(P>0.05)，臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和組織分化程度與自噬相關(guān)基因Beclin1和Atg5呈負相關(guān)(P<0.05)，如表4所示。

表4 自噬相關(guān)基因Atg5和Beclin1與宮頸癌病理相關(guān)性分析

3 討論

自噬屬于1種細胞維持自身內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的手段，一旦人體內(nèi)自噬功能出現(xiàn)異常，可以導(dǎo)致細胞出現(xiàn)異常增生情況，嚴重者會出現(xiàn)癌變現(xiàn)象。因此深入了解細胞的自噬功能與腫瘤細胞的自噬功能，能夠判斷腫瘤患者的預(yù)后情況，并研究出針對于腫瘤治療的有效藥物[6]。Beclin1又稱BECN1基因，屬于自噬啟動的關(guān)鍵蛋白，其主要作用于細胞自噬成核時期。相關(guān)研究表明[7-8]，Beclin1表達在人類的卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌之中分別下降了75%、50%和40%。Atg5位于人體染色體q21，編碼276個氨基酸，在自噬相關(guān)基因Atg嚴格調(diào)控自噬的過程中起到關(guān)鍵作用，At95首先與At912結(jié)合，形成的At95．At912泛素樣連接系統(tǒng)連接到外膜，自噬體膜延伸，進而形成自噬體，在巨噬細胞中因缺少At95而導(dǎo)致吞噬體不能與溶酶體相互融合。相關(guān)研究表明[9]，Atg5與很多腫瘤的發(fā)展與發(fā)生存在關(guān)系，在卵巢癌、結(jié)腸癌和胃癌組織中Atg5基因的蛋白表達情況降低。

本研究結(jié)果顯示，三組患者Atg5 mRNA及Beclin-1 mRNA表達情況對比差異顯著，惡性組明顯低于良性組和對照組(P<0.05)，由此可以發(fā)現(xiàn)宮頸癌患者的Atg5 mRNA及Beclin-1 mRNA表達情況降低，因此可以說明Atg5及Beclin-1 可能參與宮頸癌的發(fā)生與發(fā)展。相關(guān)研究表明[10]，Beclin1在膀胱癌組織之中的表達量明顯低于正常膀胱組織，而且在膀胱癌的發(fā)展與發(fā)生過程中具有重要作用。還有研究表明[11]，Atg5低表達患者3年生存率明顯更低，與本研究具有相關(guān)性；三組患者Atg5陽性與陰性患者人數(shù)對比差異顯著(P<0.05)，Beclin1陽性與陰性患者人數(shù)對比差異顯著(P<0.05)，由此證明，Atg5 和Beclin1在宮頸癌患者的陽性表達患者少于良性腫瘤組織和健康者，Atg5 和Beclin1的表達水平也就越低。由此可推測，Beclin1在宮頸上皮細胞發(fā)生病變開始，會出現(xiàn)功能缺陷，這可能是因為腫瘤細胞的其他抑癌基因出現(xiàn)相互作用，從而導(dǎo)致Beclin1表達出現(xiàn)異常，對細胞的自噬功能產(chǎn)生抑制作用，從而導(dǎo)致其細胞惡性開始增殖，具體生物學(xué)通路還需要更多的細胞學(xué)實驗和動物實驗進行驗證[12]；60例宮頸癌患者中，Atg5陽性與Atg5陰性患者月經(jīng)狀態(tài)、年齡、腫瘤大小對比無明顯差異(P>0.05)，兩組患者的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織分化程度對比差異顯著(P<0.05)，Beclin1陽性與Beclin1陰性患者月經(jīng)狀態(tài)、年齡、腫瘤大小對比無明顯差異(P>0.05)，兩組患者的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織分化程度對比差異顯著(P<0.05)；Spearman相關(guān)分析顯示，月經(jīng)狀態(tài)、年齡、腫瘤大小與自噬相關(guān)基因Beclin1和Atg5不相關(guān)(P>0.05)，臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和組織分化程度與自噬相關(guān)基因Beclin1和Atg5呈負相關(guān)(P<0.05)，臨床分期、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及腫瘤分化程度是體現(xiàn)腫瘤惡性程度的臨床病理指標(biāo)，對于宮頸癌患者具有重要的預(yù)測作用，因此本文以這三個指標(biāo)來分析Beclin1和Atg5與病理的相關(guān)性。相關(guān)研究者對上皮性卵巢癌組織中Beclin1表達及相關(guān)性研究發(fā)現(xiàn)，患者的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況與其明顯相關(guān)[13]。還有研究者發(fā)現(xiàn)[14-15]，Atg5在宮頸癌患者中呈現(xiàn)高表達，屬于宮頸癌的預(yù)后獨立因素，但是。一些自噬標(biāo)記物在人類癌中的表達改變已經(jīng)被報道，似乎表達減少和過度表達都可能發(fā)生。雖然，對單獨Beclin1和Atg5在癌癥中的表達研究比較多，但是對兩者一起的研究甚少，但是可能本研究中病例數(shù)過少，還存在一定局限性，所以還需后續(xù)更深入的研究。

綜上所述，自噬相關(guān)基因5(Atg5)及Beclin-1兩種蛋白在宮頸癌患者的癌組織中表達低于良性腫瘤患者和健康人士，隨著患者病情加重，自噬相關(guān)基因5(Atg5)及Beclin-1兩種蛋白表達明顯降低，自噬相關(guān)基因5(Atg5)及Beclin-1與宮頸癌患者的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和組織分化程度呈負相關(guān)，因此可以應(yīng)用自噬相關(guān)基因5(Atg5)及Beclin1來判斷宮頸癌患者病情的嚴重程度。