關(guān)瑋豪 魏璐璐 許 歡

聲門(mén)型喉癌原發(fā)于聲帶以上部位，如會(huì)厭、室?guī)А㈣紩?huì)厭襞等，分化較差，發(fā)展較快[1]。本研究將通過(guò)研究聲門(mén)型喉癌患者組織中Survivin蛋白、八聚體結(jié)合蛋白表達(dá)與分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系，從分子角度觀察并確定患者喉癌的發(fā)展情況，早日為患者提供更精確的檢查結(jié)果，并及時(shí)進(jìn)行治療。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2018年1月至2020年5月在我院收治的118例聲門(mén)型喉癌患者作為實(shí)驗(yàn)組，另選取同一時(shí)期于我院進(jìn)行治療的50例聲帶息肉患者作為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《喉癌外科手術(shù)及綜合治療專家共識(shí)》中對(duì)聲門(mén)型喉癌及聲帶息肉的相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]；②所選患者均知情并簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①哺乳期或妊娠期女性；②依從性差，無(wú)法配合完成本研究；③病歷資料不詳細(xì)；④合并惡性腫瘤、精神系統(tǒng)疾病、心腦血管疾病病史者。實(shí)驗(yàn)組患者118例，男性95例，女性23例；年齡40～75歲，平均年齡(56.56±3.12)歲；其中低分化患者61例，中分化患者32例，低分化患者25例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者52例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者66例。對(duì)照組患者50例，男性38例，女性12例；年齡36～70歲，平均年齡(51.43±3.07)歲。2組一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 研究方法

采用免疫組織化學(xué)染色法測(cè)定Survivin蛋白表達(dá)水平：將118例聲門(mén)型喉癌患者及50例聲帶息肉患者組織標(biāo)本采用石蠟常規(guī)切片，切成4～5 cm切片標(biāo)本后，置于涂好多聚賴氨酸的玻片上[3]。于68 ℃烤片機(jī)進(jìn)行烘烤，持續(xù)4 min。于二甲苯及酒精中進(jìn)行組織脫蠟，隨后用蒸餾水連續(xù)沖洗3次，每次持續(xù)3 min左右，于PH值為7.4酸堿度下進(jìn)行PBS沖洗3次，每次持續(xù)5 min[4]。在所選切片上需滴加3%H2O2溶液1滴進(jìn)行孵育，持續(xù)15 min左右，結(jié)束后重復(fù)進(jìn)行上述沖洗步驟。沖洗后于切片滴加Survivin第二抗體(雅吉生物，貨號(hào)：IH-0615R)1滴，繼續(xù)孵育30 min，PBS沖洗10 min左右[5]。所選切片于室溫下逐個(gè)滴加DAB顯色液，用實(shí)驗(yàn)室顯微鏡查看顯色結(jié)果后進(jìn)行自來(lái)水沖洗。所選切片逐個(gè)滴加蘇木精進(jìn)行復(fù)染1 min左右，自來(lái)水沖洗后返藍(lán)10 min左右[6]。最后逐步進(jìn)行梯度酒精脫水及二甲苯透明操作，采用中性樹(shù)膠封片，于顯微鏡下觀察染色結(jié)果。八聚體結(jié)合蛋白表達(dá)水平測(cè)定：同上述操作步驟，將上述操作步驟中Survivin第二抗體更換為鼠抗人Oct4 單克隆抗體(武漢純度生物，貨號(hào)：CDLG-4839)。

1.3 結(jié)果判定

先于低倍鏡下觀察切片，選取染色較均勻區(qū)域，再于高倍鏡下選取5個(gè)不重疊視野范圍，對(duì)每個(gè)視野范圍進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，規(guī)定每個(gè)范圍內(nèi)有100個(gè)腫瘤細(xì)胞方便后續(xù)統(tǒng)計(jì)及比較。根據(jù)每個(gè)區(qū)域內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞率及著色強(qiáng)度對(duì)5個(gè)區(qū)域進(jìn)行評(píng)分[7]。陰性：僅細(xì)胞核核膜上著色為藍(lán)色；陽(yáng)性：細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核核膜上呈現(xiàn)明顯淺棕色、棕黃色或深棕色。著色強(qiáng)度：著色結(jié)果為陰性、淺棕色、棕黃色或深棕色分別計(jì)分0、1、2、3分。陽(yáng)性細(xì)胞率：每個(gè)視野范圍內(nèi)結(jié)果為陽(yáng)性細(xì)胞總數(shù)占100個(gè)細(xì)胞數(shù)百分比，≤10%計(jì)0分，>10%～25%計(jì)1分，>25%～50%計(jì)2分，>50%計(jì)3分。每個(gè)區(qū)域內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞率及著色強(qiáng)度相加之和為蛋白表達(dá)水平：0分為不表達(dá)、1～2分為低表達(dá)、3～4分為中表達(dá)、5～6分為高表達(dá)，1～6分為陽(yáng)性表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本研究數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析在spss22.0軟件上進(jìn)行，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)(n)及百分率(%)表示，用χ2檢驗(yàn)，采用spearman相關(guān)性分析2組患者組織Survivin蛋白、八聚體結(jié)合蛋白表達(dá)與分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)α=0.05，當(dāng)P<0.05時(shí)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 比較2組患者Survivin蛋白、八聚體結(jié)合蛋白陽(yáng)性表達(dá)率

實(shí)驗(yàn)組Survivin、八聚體結(jié)合蛋白表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 比較2組組織中Survivin蛋白、八聚體結(jié)合蛋白陽(yáng)性表達(dá)率(例，%)

2.2 實(shí)驗(yàn)組患者組織中Survivin蛋白陽(yáng)性表達(dá)與病理特征的關(guān)系

實(shí)驗(yàn)組從高分化患者到中分化及低分化患者組織中Survivin、八聚體結(jié)合蛋白表達(dá)水平逐漸升高(P<0.05)；實(shí)驗(yàn)組有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者組織Survivin、八聚體結(jié)合蛋白表達(dá)水平較無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 比較實(shí)驗(yàn)組各類別患者Survivin蛋白、八聚體結(jié)合蛋白陽(yáng)性表達(dá)率(例，%)

2.3 實(shí)驗(yàn)組組織Survivin、八聚體結(jié)合蛋白表達(dá)水平與分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況相關(guān)性

實(shí)驗(yàn)組組織Survivin、八聚體結(jié)合蛋白表達(dá)水平與分化程度呈負(fù)相關(guān)(γ=-0.306、γ=-0.325，P均<0.05)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況呈正相關(guān)(γ=0.400、γ=0.309，P均<0.05)。

3 討論

我國(guó)喉癌發(fā)病率為1.8～2.0/10萬(wàn)，占全身腫瘤1～2%，占頭頸腫瘤3～8%(居第2位)。口腔進(jìn)食或者空氣進(jìn)去以后，通過(guò)舌頭、舌根到達(dá)會(huì)厭，會(huì)厭水平分成兩條道，后面通過(guò)下咽、食道到達(dá)胃。會(huì)厭往前面走到聲門(mén)，也就是發(fā)聲的地方叫聲帶，再往下是氣管、肺，這是一條呼吸通道[8]。聲門(mén)型喉癌，就是發(fā)生在雙側(cè)聲帶上的癌。腫瘤轉(zhuǎn)移主要包括原發(fā)癌細(xì)胞生長(zhǎng)、新腫瘤血管生成、脫落并浸入細(xì)胞基質(zhì)、形成癌栓、定位于人體各器官或組織進(jìn)行生長(zhǎng)至繼續(xù)轉(zhuǎn)移擴(kuò)散[9]。

組織Survivin蛋白是一種細(xì)胞凋亡抑制基因，是凋亡抑制蛋白家族的新成員，具有腫瘤特異性，只表達(dá)于腫瘤和胚胎組織，且與腫瘤細(xì)胞的分化增殖及浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Survivin 能夠通過(guò)P21間接抑制Caspase，與細(xì)胞周期調(diào)控因子CDK4結(jié)合，導(dǎo)致 CDK2/cyclin-E激活和核糖體磷酸化[10]。核糖體磷酸化后啟動(dòng)細(xì)胞進(jìn)入周期，加快G1/S期的轉(zhuǎn)換，使P21從Survivin-CDK4復(fù)合物中釋放出來(lái)[11]，與線粒體 pro-caspase-3結(jié)合，阻止線粒體釋放Cyt-c，直接抑制了終末效應(yīng)酶Caspase-3、Caspase-7，干預(yù)了Caspase-9的活性，抑制細(xì)胞凋亡[12]。同時(shí)survivin抵消了一大類凋亡刺激物的作用，包括IL-3、Fas、Bax、Caspase-3、Caspase -7、Caspase -8和TNF等[13]。人的Oct4基因位于6號(hào)染色體上(6p21.31)，長(zhǎng)度為16.40 kb，具有多個(gè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，轉(zhuǎn)錄不同的mRNA亞型，從而翻譯成多種蛋白質(zhì)[14]。Oct4對(duì)于人體維持干細(xì)胞正常功能及自我更新具有重要作用，有研究表明，腫瘤病變與腫瘤細(xì)胞分化程度及淋巴結(jié)細(xì)胞轉(zhuǎn)移有顯著關(guān)系[15]。本文采用免疫組織化學(xué)染色法，通過(guò)對(duì)比聲門(mén)型喉癌患者與聲帶息肉患者組織Survivin蛋白及八聚體結(jié)合蛋白陽(yáng)性率可知，組織Survivin蛋白及八聚體結(jié)合蛋白陽(yáng)性率分別為26%和18%。提示組織Survivin蛋白及八聚體結(jié)合蛋白表達(dá)水平與聲門(mén)型喉癌良惡性癌變的發(fā)生有關(guān)，可能參與了腫瘤細(xì)胞發(fā)展過(guò)程。本文結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組從高分化患者到中分化及低分化患者Survivin、八聚體結(jié)合蛋白表達(dá)水平逐漸升高；實(shí)驗(yàn)組有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者組織Survivin、八聚體結(jié)合蛋白表達(dá)水平較無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者顯著升高；組織Survivin、八聚體結(jié)合蛋白表達(dá)水平與分化程度呈負(fù)相關(guān)，與有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。進(jìn)一步證實(shí)，組織Survivin、八聚體結(jié)合蛋白表達(dá)水平不僅與聲門(mén)型喉癌癌變發(fā)生過(guò)程相關(guān)，更影響著腫瘤細(xì)胞的癌變過(guò)程。癌變?cè)絿?yán)重，組織Survivin、八聚體結(jié)合蛋白表達(dá)水平越高，提示組織Survivin及八聚體結(jié)合蛋白對(duì)聲門(mén)型喉癌患者癌變過(guò)程發(fā)生及發(fā)展的作用越強(qiáng)。Survivin及八聚體結(jié)合蛋白同樣也預(yù)示著淋巴結(jié)是否發(fā)生轉(zhuǎn)移，對(duì)癌細(xì)胞追蹤定位或治療后對(duì)患者后期療效評(píng)估及預(yù)后預(yù)測(cè)具有重要作用。

綜上所述，組織Survivin蛋白及八聚體結(jié)合蛋白表達(dá)水平與聲門(mén)型喉癌良惡性癌變的發(fā)生及其發(fā)展密切相關(guān)，兩者可鑒定患者聲門(mén)型喉癌病情嚴(yán)重程度，為患者早期診斷及治療提供微觀分子病理基礎(chǔ)。