賈艷紅 劉智慧 魏新朋

食管癌是我國(guó)常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，全世界每年近一半的新發(fā)病例與死亡病例發(fā)生在我國(guó)[1]。食管癌起病較為隱匿，且早期診斷率低，導(dǎo)致患者就診時(shí)常為晚期[2]，患者常因吞咽困難導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)不良或腫瘤進(jìn)展伴發(fā)血栓形成導(dǎo)致預(yù)后不良的發(fā)生[3]?；熓轻槍?duì)晚期食管癌的有效方法[4]，但缺少化療效果的評(píng)價(jià)指標(biāo)，尋故找與食管癌預(yù)后及化療效果的相關(guān)指標(biāo)具有重要的臨床意義。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6，TRAF6)在多種惡性腫瘤中呈高表達(dá)，調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移等生命活動(dòng)[5]，其高表達(dá)常預(yù)示患者預(yù)后不良的發(fā)生[6]。而連接蛋白4(Nectin-4)屬于免疫球蛋白黏附分子家族中的一員[7]，在腫瘤細(xì)胞侵襲過(guò)程中發(fā)揮重要作用。TRAF6、Nectin-4促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，但在食管癌中的作用尚不明確。本研究采用免疫組織化學(xué)法及RT-PCR檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)TRAF6、Nectin-4在食管癌組織中的表達(dá)水平，旨在為食管癌的化療效果及預(yù)后評(píng)估提供相關(guān)依據(jù)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

收集2014年6月至2017年6月本院腫瘤科收治的91例食管癌患者，食管癌診斷、分型依據(jù)食管癌診療規(guī)范(2018版)[8]，患者均經(jīng)胃鏡及影像學(xué)檢查確診為食管癌，并依據(jù)國(guó)際抗癌聯(lián)合會(huì)(UICC)第八版肺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)[9]將腫瘤分為Ⅰ～Ⅳ期。所有入組患者均為初診，就診前未經(jīng)放、化療，靶向治療及生物免疫治療；患者身體狀況良好，無(wú)化療禁忌癥，未合并重要臟器功能損傷；患者臨床資料完整。91例患者中男性67例、女性24例，年齡48～78(65±8.24)歲?；颊呓M織標(biāo)本為食管癌根治術(shù)中剪取腫瘤中部組織和癌旁正常組織，標(biāo)本均保存于-80 ℃中。所有研究對(duì)象及家屬均簽署知情同意書(shū)，本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)審核通過(guò)。

1.2 化療方案與療效評(píng)估

食管癌患者均采用一線化療方案紫杉醇聯(lián)合鉑類(lèi)進(jìn)行化療，注射用紫杉醇(國(guó)藥準(zhǔn)字H20183044，石藥集團(tuán)歐意藥業(yè)有限公司)用量為：50 mg/m2，于化療周期第一天靜脈滴注；卡鉑注射液(波貝，國(guó)藥準(zhǔn)字H20020180，齊魯制藥有限公司)用量為：AUC=2，于化療周期第一天靜脈滴注。7 d為一個(gè)治療周期，共化療5～6個(gè)周期?；熃Y(jié)束后依據(jù)《實(shí)體腫瘤治療反應(yīng)評(píng)價(jià)指南》[10]評(píng)估化療效果，分為完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、疾病穩(wěn)定(SD)和疾病進(jìn)展(PD)。采用門(mén)診、電話、微信等方式對(duì)患者進(jìn)行隨訪，隨訪間隔3個(gè)月，患者出現(xiàn)死亡或截止2020年6月終止隨訪。

1.3 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)TRAF6、Nectin-4的表達(dá)

標(biāo)本采用SP免疫組織化學(xué)法試劑盒檢測(cè)TRAF6、Nectin-4的表達(dá)情況。DBA顯色后加入蘇木精復(fù)染，梯度酒精脫水、透明，中性樹(shù)膠封片，鏡下觀察。按染色強(qiáng)度記分：無(wú)染色0分、淺黃色1分、棕黃色2分、深棕色3分。再按陽(yáng)性細(xì)胞密度打分：高表達(dá)細(xì)胞<25% 1分，26%～50% 2分，51%～75% 3分，>75% 4分。參照文獻(xiàn)[11-12]以?xún)身?xiàng)評(píng)分相乘獲得結(jié)果，結(jié)果≤6分為低表達(dá)，>6分為高表達(dá)。TRAF6、Nectin-4一抗均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗、免疫組化試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物公司。

1.4 RT-PCR技術(shù)檢測(cè)TRAF6、Nectin-4 mRNA水平

采用Trizol法提取腫瘤組織及癌旁組織中總RNA，NanoDrop 2000檢測(cè)樣品合格。采用逆轉(zhuǎn)錄PCR一步法試劑盒(美國(guó)Thermo Fisher公司)，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)所述進(jìn)行操作。以GAPDH為內(nèi)參，檢測(cè)TRAF6、Nectin-4 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。引物均委托上海生工生物公司設(shè)計(jì)合成，序列為T(mén)RAF6 mRNA：F：5’-TCCACACAATGCAAGGAGAA-3’，R：5’-GGGCTTCCAGATGCATAAAA-3’；Nectin-4 mRNA：F：5’-CAAAATCTGTGGCACATT-GG-3’，R：5’-GCTGACATGGCAGACGTAGA-3’。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 腫瘤及癌旁組織中TRAF6、Nectin-4表達(dá)情況

免疫組化結(jié)果顯示：TRAF6、Nectin-4在腫瘤組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織(P<0.001)，RT-PCR結(jié)果顯示：腫瘤組織中TRAF6、Nectin-4 mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯高于癌旁組織(P<0.001)，見(jiàn)表1～2。

表1 腫瘤及癌旁組織中TRAF6、Nectin-4表達(dá)情況/例

表2 檢測(cè)腫瘤及癌旁組織中TRAF6、Nectin-4 mRNA相對(duì)表達(dá)量

2.2 TRAF6、Nectin-4水平與食管癌臨床病理特征的關(guān)系

結(jié)果表明：腫瘤組織中TRAF6、Nectin-4高表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤類(lèi)型及發(fā)生部位無(wú)關(guān)(P>0.05)，但與有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤分期相關(guān)(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 TRAF6、Nectin-4水平與食管癌臨床病理特征的關(guān)系/例

2.3 TRAF6、Nectin-4水平與化療效果的關(guān)系

患者經(jīng)化療后分為CR組14例、PR組31例、SD組27例、PD組19例。各效果組組織中TRAF6、Nectin-4 mRNA水平具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001)，CR組、PR組患者組織中TRAF6、Nectin-4 mRNA水平明顯低于PD組患者(P<0.05)，見(jiàn)表4。

表4 TRAF6、Nectin-4表達(dá)水平與化療效果的關(guān)系

2.4 TRAF6、Nectin-4水平與患者預(yù)后的關(guān)系

截止到2020年6月，91患者中存活47例，死亡41例，失訪3例，存活率為51.65%。所有死亡患者均死于腫瘤進(jìn)展、復(fù)發(fā)及相關(guān)并發(fā)癥。Kaplan-Meier生存曲線分析顯示：組織中TRAF6、Nectin-4高表達(dá)患者36個(gè)月生存率明顯低于低表達(dá)患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

圖1 組織中TRAF6、Nectin-4水平與患者生存率的關(guān)系

3 討論

本研究通過(guò)免疫組化及RT-PCR技術(shù)檢測(cè)TRAF6、Nectin-4在食管癌患者組織中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)食管癌組織中TRAF6、Nectin-4蛋白及mRNA表達(dá)水平明顯高于癌旁組織。研究表明TRAF6蛋白是腫瘤壞死因子超家族和Toll樣受體超家族的重要銜接分子[13]，其活化后可同時(shí)激活NF-kB和MAPK通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲，并抑制腫瘤細(xì)胞凋亡[14]。

TRAF6還可通過(guò)Beclin-1及p62基因參與對(duì)腫瘤細(xì)胞自噬的調(diào)控，在腫瘤耐藥中發(fā)揮關(guān)鍵作用[15]。另一方面TRAF6蛋白還可作為1種E3泛素連接酶催化形成賴(lài)氨酸-63-多聚泛素鏈，活化UPP途徑介導(dǎo)肌蛋白分解引起肌肉萎縮，增加蛋白質(zhì)的消耗，常導(dǎo)致患者惡病質(zhì)的發(fā)生[16]。研究發(fā)現(xiàn)胃癌患者組織中TRAF6高表達(dá)與患者腫瘤分期、浸潤(rùn)深度相關(guān)，常預(yù)示患者預(yù)后不良的發(fā)生[17]；miR-146a-5p可通過(guò)靶向調(diào)控TRAF6抑制非小細(xì)胞肺癌化療耐藥的發(fā)生[18]；而下調(diào)卵巢癌細(xì)胞中TRAF6的表達(dá)能夠延緩腫瘤生長(zhǎng)速度、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，并有效提高對(duì)化療藥物的敏感性[19]。本研究還結(jié)果顯示TRAF6在Ⅲ、Ⅳ期食管癌及伴隨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者組織中呈高表達(dá)，提示TRAF6促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的發(fā)增殖轉(zhuǎn)移，且其高表達(dá)與患者化療效果不佳相關(guān)，提示TRAF6參與介導(dǎo)腫瘤耐藥的發(fā)生，該結(jié)果與之前的研究具有一致性，但機(jī)制尚不完全明確。

Nectin-4是細(xì)胞間粘附系統(tǒng)的重要組成成員，通過(guò)形成同順勢(shì)二聚體以非Ca2+依賴(lài)的形式與E-鈣黏素共同維持細(xì)胞間粘附的動(dòng)態(tài)平衡[20]。細(xì)胞間粘附喪失是腫瘤開(kāi)始侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵一步，Nectin-4通過(guò)活化Rac和Cdc42引起細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白改變，形成板狀偽足和絲狀偽足，啟動(dòng)腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移[21]。研究表明Nectin-4與乳腺癌轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，浸潤(rùn)性乳腺癌和腫瘤轉(zhuǎn)移患者組織中Nectin-4呈高表達(dá)[22]，在卵巢癌及肺癌組織中也檢測(cè)出Nectin-4的高表達(dá)；國(guó)內(nèi)學(xué)者陳君等[23]的研究發(fā)現(xiàn)姜黃素能夠通過(guò)下調(diào)Nectin-4的表達(dá)抑制了肺癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的能力。本研究發(fā)現(xiàn)Nectin-4在食管癌組織中高表達(dá)與腫瘤分期及轉(zhuǎn)移相關(guān)，且其高表達(dá)患者死亡率較高，提示Nectin-4促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移，與先前的研究結(jié)果一致。綜上所述TRAF6、Nectin-4在食管癌組織中呈高表達(dá)，且與患者腫瘤分期及有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，而TRAF6、Nectin-4高表達(dá)患者化療效果通常較差，且死亡率也高于低表達(dá)患者。

組織中TRAF6、Nectin-4水平可能作為食管癌患者化療效果及預(yù)后的預(yù)測(cè)指標(biāo)發(fā)揮臨床作用，針對(duì)其相關(guān)研究將為食管癌的診斷及治療提供依據(jù)，但TRAF6、Nectin-4是否為食管癌轉(zhuǎn)移的必要因素及其促進(jìn)食管癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制仍需進(jìn)一步探索。