吳樹軍 蘇文濤 劉建軍 張軍民

前列腺癌(prostate cancer，PCa)是我國男性常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，近年來我國PCa發(fā)病率呈快速上升趨勢，由于PCa導(dǎo)致的死亡患者逐年增多[1]。膠原三股螺旋重疊蛋白1(collagen triple helix repeat containing 1，CTHRC1)是1種外分泌糖蛋白[2]，在多種實體腫瘤中高表達，CTHRC1基因通過調(diào)控MMP-7/MMP-9通路促進腫瘤細胞浸潤和擴散[3]。而程序性死亡受體-配體(programmed cell death ligand 1，PD-L1)是重要的免疫檢查點蛋白，通過與PD-1結(jié)合抑制T細胞功能促進腫瘤免疫逃逸的發(fā)生[4]，PD-L1已被證實在多種腫瘤中表達增高，且常與患者預(yù)后不良相關(guān)[5]。CTHRC1、PD-L1均與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，但在PCa中作用尚不明確。本研究采用免疫組織化學(xué)法檢測PCa患者組織中CTHRC1、PD-L1的表達情況，旨在為PCa的預(yù)后的評估提供參考價值。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選取2013年1月至2017年1月于本院泌尿外科行根治性前列腺切除術(shù)的86例患者，患者年齡49～81歲，平均年齡(67±9.14)歲。所有患者病理學(xué)檢查均確診為前列腺癌，TNM分期組遵循美國癌癥聯(lián)合會(AJCC)分類；所有患者入組前均未行放、化療，靶向藥物治療及生物免疫治療；患者身體狀況良好，無手術(shù)禁忌癥。術(shù)中采集患者腫瘤組織及癌旁正常組織保存于-80 ℃?zhèn)溆?，所有患者均簽署研究的知情同意書，本研究?jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核通過。

1.2 免疫組織化學(xué)法檢測CTHRC1、PD-L1蛋白表達

將玻片脫蠟水化，使用磷酸緩沖液(PBS)沖洗后滴加3%H2O2孵育10 min，使用EDTA(pH8.0)和檸檬酸鈉溶液對抗原進行高壓熱修復(fù)，PBS沖洗后滴加山羊血清室溫下封閉30 min，滴加50 μl一抗置于濕盒內(nèi)4 ℃孵育過夜。次日在室溫復(fù)溫1 h，PBS沖洗3次后滴加50 μl二抗，室溫靜置1 h。PBS洗滌后滴加DBA顯色，與顯微鏡下觀察染色程度。PBS沖洗后蘇木精復(fù)染2 min，再沖洗后梯度酒精脫水、透明、中性樹膠封片后于顯微鏡下觀察。CTHRC1、PD-L1一抗均購自美國Abcam公司，HRP標記山羊抗兔二抗購買自美國SBI公司，DBA顯色液及其他實際均購買自北京中杉金橋公司。CTHRC1、PD-L1染色部位均為細胞質(zhì)。染色后細胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒為蛋白表達陽性，按照蛋白染色強度打分：無染色記0分、淺黃色記1分、棕黃色記2分、深棕色記3分。再按照染色高表達細胞密度進行打分：高表達細胞<25%記1分，26%～50%記2分，51%～75%記3分，>75%記4分。參照文獻報道[6-7]最終結(jié)果以上述兩項評分相乘獲得，以≤6分記為低表達，>6分為高表達。

1.3 治療及隨訪

患者行根治性前列腺切除術(shù)后采用多西他賽聯(lián)合潑尼松龍方案進行化療，化療期間患者每3個月復(fù)查血清PSA水平、CT、MRI及骨掃描，以出現(xiàn)腫瘤進一步生長、骨轉(zhuǎn)移、患者臨床癥狀進一步加重、患者死亡判定為化療無效，無上述指征者判定為化療有效。采用電話、微信、郵箱等方式對患者進行隨訪，隨訪間隔為3個月，隨訪時間3年，末次隨訪時間為2020年1月。

1.4 統(tǒng)計分析

收集的實驗數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 21.0進行分析，計數(shù)資料以例數(shù)或率表示，兩組比較采用χ2檢驗，相關(guān)性分析采用Spearman分析，采用Kaplan-Meier生存曲線觀察兩組患者生存情況進行比較，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CTHRC1、PD-L1在腫瘤及癌旁組織中表達情況

免疫組化染色結(jié)果顯示：86例PCa組織中65例患者CTHRC1呈高表達，高表達率為75.58%；69例患者PD-L1呈高表達，高表達率為80.23%。腫瘤組織中CTHRC1、PD-L1表達水平明顯高于癌旁組織，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，見表1。

表1 免疫組化法檢測CTHRC1、PD-L1表達情況/例

2.2 CTHRC1、PD-L1表達水平與患者臨床資料的關(guān)系

研究表明：PCa患者組織中CTHRC1、PD-L1表達水平與患者年齡及術(shù)前前列腺特異性抗原(Prostate specific antigen，PSA)水平無關(guān)(P>0.05)，而與患者TNM分期、是否伴隨骨轉(zhuǎn)移及Gleason評分相關(guān)(P<0.05)，見表2。

表2 CTHRC1、PD-L1表達水平與患者臨床資料的關(guān)系/例

2.3 CTHRC1、PD-L1表達水平的相關(guān)性研究

86例PSa患者腫瘤組織中CTHRC1高表達65例，而PD-L1高表達69例，Spearman相關(guān)性分析顯示：PD-L1表達與CTHRC1表達呈正相關(guān)(γ=0.377，P<0.01)。

2.4 CTHRC1、PD-L1表達與患者化療效果的關(guān)系

86例PCa患者中化療有效71例，無效15例?；熡行Щ颊吣[瘤組織中CTHRC1、PD-L1表達明顯低于無效患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，見表3。

表3 CTHRC1、PD-L1表達與患者化療效果的關(guān)系/例

2.5 CTHRC1、PD-L1表達水平對患者預(yù)后的影響

以隨訪患者死亡或到截止時間為標準停止隨訪，86例PCa患者腫瘤組織中CTHRC1高表達患者65例，死亡24例，存活38例，失訪3例；CTHRC1低表達患者21例，死亡3例，存活18例，無失訪。86例PCa患者腫瘤組織中PD-L1高表達患者69例，死亡26例，存活41例，失訪2例；PD-L1低表達患者17例，死亡2例，存活14例，失訪1例，所有死亡患者死因均為前列腺癌進展或并發(fā)癥。采用Kaplan-Meier生存曲線比較患者生存情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中CTHRC1、PD-L1呈低表達的患者36個月的生存率高于高表達患者，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

圖1 CTHRC1、PD-L1表達水平與患者生存率的關(guān)系

3 討論

研究表明CTHRC1是1種遷移蛋白，其表達與血管重構(gòu)、組織纖維化的形成、骨骼形成和腫瘤形成等多種生命活動相關(guān)[8]，而CTHRC1在腫瘤中常出現(xiàn)表達水平升高。大量文獻報道其與多種腫瘤的生長侵襲相關(guān)，如良性黑色素瘤細胞不表達CTHRC1，但在具有高度侵襲和轉(zhuǎn)移能力的惡性黑色素瘤細胞中CTHRC1表達水平明顯升高[9]；在非小細胞肺癌中CTHRC1表達水平可作為評估患者預(yù)后的相關(guān)指標，高表達患者常伴隨預(yù)后不良的發(fā)生[10]；此外還有研究表明CTHRC1表達水平與腫瘤耐藥的發(fā)生密切相關(guān)[11]，其可能作為相應(yīng)的分子靶點在腫瘤的靶向治療中發(fā)揮作用。但目前CTHRC1與PCa的相關(guān)研究少有報道，本研究結(jié)果表明其在PCa組織中呈高表達，且化療有效的患者組織中CTHRC1表達水平較低，高表達CTHRC1的患者生存率低于低表達患者。國內(nèi)郭碧瑩等[12]的研究發(fā)現(xiàn)，體外過表達CTHRC1顯著增強卵巢癌細胞增殖和遷移的能力，而下調(diào)CTHRC1的表達后卵巢癌細胞浸潤能力大大降低，研究證實CTHRC1在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮促腫瘤作用。郭碧瑩等[13]的研究還發(fā)現(xiàn)高表達CTHRC1的卵巢癌細胞對化療藥物的敏感性較低，而沉默CTHRC1后發(fā)現(xiàn)抑制細胞中Akt、STAT3磷酸化，使Bcl-2表達降低，提升化療效果。結(jié)合本研究結(jié)果，提示CTHRC1可能參與了PCa的發(fā)生發(fā)展及化療耐藥的發(fā)生。

PD-L1是免疫反應(yīng)中重要的負性調(diào)控分子，與PD-1結(jié)合后募集蛋白酪氨酸磷酸酶(SHP)下調(diào)PI3K/Akt通路磷酸化水平，使CD4+T淋巴細胞向Treg分化[14]，抑制免疫反應(yīng)的發(fā)生。PD-1/PD-L1還可通過耗竭CD8+T細胞的方式抑制抗腫瘤免疫反應(yīng)，促進腫瘤的免疫逃逸[15]。研究表明PD-L1在多種腫瘤中的表達水平明顯升高，而其表達水平可作為患者預(yù)后的相關(guān)指標，胃癌組織中PD-L1高表達常與患者預(yù)后不良相關(guān)[16]；PD-L1還能通過促進肝癌微血管生成促進腫瘤的生長轉(zhuǎn)移[17]。本研究發(fā)現(xiàn)PD-L1在PCa組織中表達水平明顯上升，且與患者化療效果和生存率相關(guān)，與低表達者相比PD-L1高表達的PCa患者多數(shù)化療無效，且生存率明顯降低，結(jié)果與先前的研究一致。本研究還發(fā)現(xiàn)PD-L1的表達與CTHRC1表達相關(guān)。相關(guān)研究報道CTHRC1與金屬基質(zhì)蛋白酶-9、粘蛋白-1等分子表達水平相關(guān)，可能參與了腫瘤微環(huán)境的調(diào)控導(dǎo)致PD-L1表達水平增高從而進一步促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展[18]，但對此機制的研究尚不完全明確。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示PCa患者腫瘤組織中PD-L1、CTHRC1表達水平明顯升高，且與患者TNM分期、有無骨轉(zhuǎn)移、Gleason評分、化療效果及預(yù)后相關(guān)，提示PD-L1、CTHRC1參與了PCa的發(fā)生發(fā)展，可能作為PCa患者化療效果及預(yù)后的評價指標發(fā)揮作用。但本研究樣本量較小，結(jié)果可能存在偏倚，需在后續(xù)研究中心加以改進，且PD-L1、CTHRC1在PCa中發(fā)揮的作用及機制仍需進一步研究。