劉利艷 施 旻 陳 力 張 潔 李 斌 溫世偉 徐 彭

癌癥的發(fā)病率和死亡率已經(jīng)成為第二大威脅人類健康的疾病[1-5]。中醫(yī)認(rèn)為“正虛邪實(shí)”，“正氣虧虛、毒瘀互結(jié)” 于脈絡(luò)是癌癥發(fā)病的重要因素[6-7]，熱毒內(nèi)蘊(yùn)可形成腫瘤，即熱灼血凝，凝結(jié)成塊，熱灼津液，久積成塊等。腫瘤 (癌癥)本質(zhì)是陽(yáng)化氣不足、陰成形積聚[8-10]，癌癥自身也可生熱成毒[10]，歷代醫(yī)家多以清熱解毒、以毒攻毒、化痰散結(jié)為主要治法，體現(xiàn)了清熱解毒法在癌癥治療中有重要的作用[11]。

石見(jiàn)穿，別名紫參，唇形科植物紫參的全草(Salviae Chinensis Herba)，全草性平、味苦、辛,具有清熱利濕、活血調(diào)經(jīng)、解毒消腫之功效，《本草綱目》記載其功效為：主骨痛，大風(fēng)，癰腫[12-13]。現(xiàn)有文獻(xiàn)顯示石見(jiàn)穿具有增強(qiáng)免疫力，對(duì)胃癌、腸癌、肝癌等多種腫瘤細(xì)胞具有良好的抑制作用[13-17]，常與其他中藥配伍一起用于癌癥的治療，亦可配合放、化療，減輕放、化療患者的不適癥狀[18-19]。目前對(duì)石見(jiàn)穿治療癌癥的作用機(jī)制尚不明確。筆者亦未見(jiàn)有關(guān)運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理方法對(duì)石見(jiàn)穿抗癌作用機(jī)制文獻(xiàn)報(bào)道?；诖?，為了進(jìn)一步研究石見(jiàn)穿的抗腫瘤作用機(jī)制，以石見(jiàn)穿為研究對(duì)象，采用生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)以人類蛋白靶標(biāo)為研究對(duì)象進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究，以探究石見(jiàn)穿在治療癌癥的作用靶標(biāo)及其作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫(kù)及軟件

本研究所涉及的數(shù)據(jù)庫(kù)有:中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)TCMSP(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)、化合物查詢數(shù)據(jù)庫(kù)PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)、靶點(diǎn)預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)swisstargetprediction(http://www.swisstargetprediction.ch/index.php)、疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)DisGeNET(http://disgenet.org)和Genecards(https://www.genecards.org)、數(shù)據(jù)交集數(shù)據(jù)庫(kù)Draw Venn Diagram(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)、String蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)(https://string-db.org/cgi/input.pl)。通路查詢數(shù)據(jù)庫(kù)KEGG(https://www.genome.jp/kegg/pathway.html)、蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)PDB(http://www.rcsb.org)、swissmodel(https://swissmodel.expasy.org)；圖形可視化數(shù)據(jù)庫(kù)有：RAWGraphs(https://app.rawgraphs.io)；所涉及的軟件有：網(wǎng)絡(luò)可視化Cytoscape3.7.1，R語(yǔ)言，通路富集與生物學(xué)分析ClueGo2.5.4和CluePedia、分子對(duì)接軟件DISCOVERY STUDIO軟件等。

1.2 石見(jiàn)穿活性成分及靶點(diǎn)篩選

在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中搜集石見(jiàn)穿所有的活性成分；若根據(jù)化合物的類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18 和口服生物利用度(Oral Bioavailability，OB)≥30%為篩選條件，則符合條件的只有2個(gè)化合物，故本研究對(duì)活性成分的選擇不設(shè)篩選條件，將所有活性成分全部納入研究[20-24]。將納入活性成分分別在PubChem、swisstargetprediction數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索，篩選物種為“homo sapiens”的靶點(diǎn)，并對(duì)各活性成分作用靶點(diǎn)進(jìn)行篩選(篩選條件為Probability≥0.05)，即為石見(jiàn)穿的預(yù)測(cè)作用靶點(diǎn)。

1.3 疾病靶點(diǎn)篩選

在DisGeNET和Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)，以關(guān)鍵詞“Cancer”進(jìn)行檢索，篩選條件分別為:Score_gda≥0.05(DisGeNET)，Relevance score≥10(Genecards)，并將石見(jiàn)穿活性成分預(yù)測(cè)靶點(diǎn)與癌癥疾病靶點(diǎn)進(jìn)行交集，得到共同的靶基因，繪制韋恩圖。

1.4 藥物-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將藥物與活性成分-靶點(diǎn)(共同靶基因)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape中，繪制藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 PPI網(wǎng)絡(luò)的建立

將交集后的靶基因上傳到String數(shù)據(jù)庫(kù)，將研究物種為選擇為人類(Homo sapiens) ，獲取蛋白相互作用數(shù)據(jù)，結(jié)果以TSV格式導(dǎo)出，然后導(dǎo)至Cytoscape軟件優(yōu)化構(gòu)建和分析蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)(PPI)，節(jié)點(diǎn)大小和顏色均按“degree”排列，edge粗細(xì)和顏色均按“combined_score”排列。

1.6 癌癥靶點(diǎn)生物學(xué)功能分析和通路分析

將共同靶基因經(jīng)R語(yǔ)言包進(jìn)行GO、KEGG分析，對(duì)石見(jiàn)穿治療癌癥作用的潛在靶點(diǎn)進(jìn)行生物學(xué)功能和通路分析。將Cutoff值設(shè)為“p value<0.05”，“q value<0.01”，得到生物功能富集氣泡圖和barplot圖。將得到的與癌癥相關(guān)通路和靶基因上傳至RAW數(shù)據(jù)庫(kù)中，構(gòu)建石見(jiàn)穿-活性成分-靶基因-信號(hào)通路的網(wǎng)絡(luò)圖。

1.7 活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)的分子對(duì)接驗(yàn)證

選擇靶點(diǎn)數(shù)目最多的活性成分作為配體，PPI 網(wǎng)絡(luò)中“degree”最大的靶點(diǎn)作為受體，進(jìn)行分子對(duì)接。在PDB、swissmodel數(shù)據(jù)庫(kù)下載所需蛋白結(jié)構(gòu)，與pubchem下載的三維結(jié)構(gòu)配體一一對(duì)接，LibDock對(duì)接模式，選擇評(píng)分分值最高的分子-蛋白對(duì)接圖(LibDockScore>100，則構(gòu)象予以保留)。

2 結(jié)果

2.1 石見(jiàn)穿活性成分以及靶點(diǎn)篩選

經(jīng)TCMSP檢索，共檢索出16個(gè)活性成分。將所有的活性成分在swisstarget prediction中檢索預(yù)測(cè)靶點(diǎn)，得到254個(gè)預(yù)測(cè)靶點(diǎn)。

2.2 疾病靶點(diǎn)篩選

分別從DisGeNET和Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取癌癥相關(guān)的疾病靶點(diǎn)4511個(gè)和1521個(gè)，與245個(gè)預(yù)測(cè)靶基因一起輸入Draw Venn Diagram進(jìn)行交集后，得到共同靶基因84個(gè)，即為石見(jiàn)穿的潛在作用靶點(diǎn)。見(jiàn)圖1。

圖1 預(yù)測(cè)靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)交集韋恩圖

2.3 藥物-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將藥物與活性成分靶點(diǎn)(共同靶基因)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape中，繪制中藥-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)可視圖(圖2)，圈中心為石見(jiàn)穿，內(nèi)圈16個(gè)節(jié)點(diǎn)代表石見(jiàn)穿的16個(gè)活性成分，中圈和外圈均為活性成分的作用靶點(diǎn)。體現(xiàn)了石見(jiàn)穿治療癌癥多成分、多靶點(diǎn)協(xié)同作用的特點(diǎn)。連接度為前3的潛在活性成分分別為MOL002049(Ferulaldehyde，degree：39)、MOL000263(oleanolic acid，degree：26)和MOL000511(ursolic acid，degree：26)。

圖2 石見(jiàn)穿-活性成分-預(yù)測(cè)靶點(diǎn)相互作用

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)的建立

將石見(jiàn)穿-癌癥84個(gè)潛在的靶基因上傳至String數(shù)據(jù)庫(kù)平臺(tái)獲取的蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系數(shù)據(jù)導(dǎo)至Cytoscape軟件優(yōu)化構(gòu)建和分析蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)(PPI)；PPI網(wǎng)絡(luò)共有84個(gè)節(jié)點(diǎn)(共同靶基因)通過(guò)877條邊發(fā)生作用，平均節(jié)點(diǎn)degree為20.9，可視圖中節(jié)點(diǎn)越大(半徑)則說(shuō)明其degree越大，edge邊越粗，則說(shuō)明其combined_score 值越大，關(guān)聯(lián)性越好(圖3)。經(jīng)Cytoscape Network分析后得到各靶點(diǎn)的degree值，按照degree從大到小排序，排名前三分別為IL6(57)、MAPK3(56)、EGFR(56)。

圖3 石見(jiàn)穿治療癌癥潛在作用靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

2.5 GO功能分析

經(jīng)R語(yǔ)言包運(yùn)行后，得到GO富集結(jié)果顯示：與核受體活性相關(guān)的基因有11個(gè)、轉(zhuǎn)錄因子活性相關(guān)的基因有11個(gè)、與輔因子結(jié)合相關(guān)的基因有15個(gè)、RNA聚合酶II近端啟動(dòng)子序列特異性DNA結(jié)合相關(guān)的基因有14個(gè)、近端啟動(dòng)子序列特異性DNA結(jié)合相關(guān)的基因有14蛋白質(zhì)異二聚活性相關(guān)的基因有11個(gè)等，靶基因參與這些生物學(xué)功能的過(guò)程，說(shuō)明其在生物學(xué)行為上占據(jù)重要的地位。

2.6 KEGG通路分析

經(jīng)R語(yǔ)言包運(yùn)行KEGG后，共得到137條信號(hào)通路，其中涉及癌癥的通路有24條，感染類的通路有27條，炎癥通路的有5條，免疫方面的通路有7條，激素相關(guān)通路7條等。IL-6、MAPK3、STAT3、MMP3、GSK3B、PTPRC等基因作為cross-talk 基因參與到 2 條及以上通路中，這些通路和基因涉及癌癥發(fā)生發(fā)展如細(xì)胞的增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移、血管新生等重要的生物過(guò)程。

2.7 活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)的分子對(duì)接驗(yàn)證

選取連接靶點(diǎn)最多的活性成分(前三)，分別為阿魏醛(MOL002049，F(xiàn)erulaldehyde)、齊墩果酸(MOL000263，oleanolic acid)、熊果酸(MOL000511，ursolic acid)為配體，作用最緊密的蛋白分別為IL6、MAPK3、EGFR三個(gè)蛋白為受體。分子對(duì)接結(jié)果顯示(如表1)，IL-6能與石見(jiàn)穿中活性成分阿魏醛穩(wěn)定結(jié)合，通過(guò)與氨基酸殘端主要與SER L52、ARG H99、ARG H33 氫鍵連接，ALA H100 烷基連接，GLY L36 Pi-碳?xì)滏I，ASP L93、ASP H106 Pi-陰離子方式連接。齊墩果酸能與MAPK3、EGFR穩(wěn)定結(jié)合，分別通過(guò)LEU B124 、MET B125、LEU B173、ILF B48、VAL B56、TYR B53 PI烷基或烷基、GLU B50 氫鍵、GLY B49碳?xì)滏I；ALA A289、SERA291、THR A339碳?xì)滏I、GLY A288范德華力、VAL A312、CYS A309、CYS A305、ARG A310、TYR A292 PI-烷基連接。熊果酸與MAPK3、EGFR亦能穩(wěn)定結(jié)合，分別通過(guò)GLY B49碳?xì)滏I、VALB56、TYRB53、LEUB124、ILEB48、CYSB183、METB125、LEUB173PI烷基或烷基連接；LYSA375 烷基、ARGA310碳?xì)滏I連接。從對(duì)接構(gòu)象上看，齊墩果酸和熊果酸與MAPK3、EGFR連接構(gòu)象相似，但其與氨基酸殘基連接方式不同。

表1 藥物活性成分與蛋白對(duì)接情況表

3 討論

本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)的方法對(duì)石見(jiàn)穿的治療癌癥作用機(jī)制進(jìn)行研究，從TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取了石見(jiàn)穿16個(gè)活性成分，通過(guò)對(duì)化合物靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)分析和分子對(duì)接等可發(fā)現(xiàn)阿魏醛(Ferulaldehyde)、齊墩果酸(oleanolic acid)和熊果酸(ursolic acid)可能是石見(jiàn)穿發(fā)揮作用的重要活性成分。通過(guò)String數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)IL6、MAPK3、EGFR、MAPK1、CASP3、TNF、 PTGS2、ESR1、MAPK8、STAT3等基因?yàn)楹诵陌悬c(diǎn)。MAPK是信號(hào)從細(xì)胞表面?zhèn)鲗?dǎo)到細(xì)胞核內(nèi)部的重要傳遞者，能被不同的細(xì)胞外刺激，如細(xì)胞因子、神經(jīng)遞質(zhì)、激素、細(xì)胞應(yīng)激及細(xì)胞黏附等激活的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶。調(diào)節(jié)著細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、對(duì)環(huán)境的應(yīng)激適應(yīng)、炎癥反應(yīng)等多種重要的細(xì)胞生理/病理過(guò)程。IL-6為由基質(zhì)細(xì)胞、上皮細(xì)胞等多種細(xì)胞產(chǎn)生的1種多功能的細(xì)胞因子、在腫瘤、炎癥和免疫性疾病中發(fā)揮重要作用[25-26]，EGFR是1種受體型酪氨酸激酶。是成紅細(xì)胞增多癥癌基因B(ErbB)家族的主要成員，在許多組織中表達(dá)，并參與多種細(xì)胞過(guò)程，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育至關(guān)重要[27]。研究顯示熊果酸能通過(guò)抑制(MAPK)/ERK信號(hào)通路，來(lái)抑制轉(zhuǎn)移性惡性黑色素瘤細(xì)胞的增殖，另有報(bào)道顯示熊果酸能夠通過(guò)抑制MAPK、EGFR磷酸化，從而抑制EGF刺激結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29的增殖。其能抑制VEGF，參與血管新生。從而抑制腫瘤血管生成[28-30]。經(jīng)齊墩果酸藥物處理后，神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的MAPK/ERK途徑被大大抑制。重組慢病毒載體Lv-MEK誘導(dǎo)的MAPK/ERK激活能夠挽救齊墩果酸對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲的抑制作用，這說(shuō)明齊墩果酸是通過(guò)抑制MAPK/ERK途徑來(lái)抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲[31]。另有研究顯示齊墩果酸可有效抑制HU-VEC中VEGF誘導(dǎo)的VEGFR-2活化和血管生成，從而產(chǎn)生抗血管生成作用[32]。上述文獻(xiàn)報(bào)道與我們的研究結(jié)果基本一致。然目前尚未查到有關(guān)阿魏醛在腫瘤中、以及通過(guò)與IL-6之間相互作用的報(bào)道，通過(guò)我們本次研究或許能為我們之后探討阿魏醛在腫瘤中的作用的研究方向提供思路。

綜上所述，運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)來(lái)探討石見(jiàn)穿的治療癌癥潛在作用靶點(diǎn)，通過(guò)分子對(duì)接技術(shù)初步驗(yàn)證了石見(jiàn)穿主要活性成分與潛在的作用靶點(diǎn)發(fā)生的相互作用，進(jìn)一步確定了石見(jiàn)穿治療癌癥是“多成分-多靶點(diǎn)-多通路”的共同作用，為后續(xù)深入研究石見(jiàn)穿治療癌癥的分子機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。