楊建云，倪 俊，高玉婷，楊 旭2，，佘 容2，*，肖 文2，，4，5

(1.大理大學藥學院，云南 大理 671003；2.大理大學 天然抗氧化劑與抗氧化炎癥研究院，云南 大理 671003；3.大理大學 東喜瑪拉雅研究院，云南 大理 671003；4.中國三江并流區(qū)域生物多樣性協同創(chuàng)新中心，云南 大理 671003；5.大理大學 三江并流區(qū)域生物多樣性保護與利用云南省創(chuàng)新團隊，云南 大理 671003)

昆蟲種類繁多，數量龐大，昆蟲資源是目前地球上最大的尚未被充分利用的自然資源[1-2]。喙尾琵琶甲(BlapsrynchopeteraFairmaire)屬于鞘翅目(Coleoptera)、擬步甲科(Tenebrionidae)、琵琶甲屬(Blapsfabiricus)，在我國西南地區(qū)云南、四川、貴州和廣西等省均有分布，其中以云南省分布較為集中，又稱為“云南琵琶甲”，是云南彝族和白族民間廣泛使用的一種藥用昆蟲[3]。喙尾琵琶甲成蟲繁殖能力強，日均產卵量為5.3粒，壽命超過18個月，終生產卵量在600粒以上[3]。喙尾琵琶甲是一種重要的可再生資源，其藥用價值及營養(yǎng)價值都較高，含有16種游離氨基酸和16種蛋白氨基酸，其中8種是人體必需氨基酸[4-5]。喙尾琵琶甲成蟲提取物具有抑菌、抗腫瘤活性，喙尾琵琶甲幼蟲乙酸乙酯提取物對金黃色葡萄球菌和藤黃微球菌具有抑菌活性[6-9]。

生物機體在有氧代謝過程中，活性氧的產生和清除處于動態(tài)平衡狀態(tài)。若打破抗氧化防御機制間的平衡，就會產生氧化應激；過度的應激反應會引起機體應激損傷，導致相關疾病的發(fā)生[10-11]。昆蟲的生理結構特殊，氣管系統所輸送的氧經擴散作用直抵組織，從而增加正常情況下機體的氧化脅迫，昆蟲也由此發(fā)展了一套高效的抗氧化系統[12-13]。崔文博等[14]研究發(fā)現，喙尾琵琶甲成蟲的氯仿和乙酸乙酯提取物具有較高的抗氧化活性；何釗等[15]研究了5種昆蟲多糖的抗氧化活性，發(fā)現喙尾琵琶甲多糖對DPPH自由基的清除效果較明顯；馬嬌等[16]研究發(fā)現，7種云南可食用昆蟲的醇提物均對ABTS自由基具有不同程度的清除作用；另外，黃粉蟲黃酮提取物[17]、白蠟蟲多糖提取物[18]、黑水虻幼蟲蛋白質[19]、碧偉蜓稚蟲的胃蛋白酶解液[20]以及金銀花尺蠖蛹粗多糖[21]等都具有體外抗氧化活性。

喙尾琵琶甲的幼蟲和蛹可以增加喙尾琵琶甲的食用性。但由于喙尾琵琶甲幼蟲飼養(yǎng)難度大、發(fā)育歷期長，目前關于喙尾琵琶甲幼蟲及蛹的應用價值的研究報道較少，涉及抗氧化活性的報道更少。為此，作者以喙尾琵琶甲幼蟲為研究對象，通過DPPH法、ABTS法、FRAP法評價喙尾琵琶甲幼蟲提取物的體外抗氧化活性，為云南藥食兩用昆蟲資源的合理開發(fā)利用提供科學依據。

1 實驗

1.1 材料

于大理大學內野外環(huán)境中采集喙尾琵琶甲成蟲，室內交配產卵后，收集卵，孵化，在人工飼養(yǎng)室內飼養(yǎng)至高齡幼蟲，收集體長29.25～30.85 mm、頭寬2.81～3.08 mm的鮮活蟲體(圖1)，冷凍干燥，備用。

圖1 喙尾琵琶甲幼蟲

1.2 試劑與儀器

DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)，梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司；ABTS[2,2′-聯氮-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽]、2,4,6-三吡啶基三嗪(TPTZ)，上海麥克林生化科技有限公司；抗壞血酸(VC)，國藥集團化學試劑有限公司；正己烷、乙酸乙酯，天津風船化學試劑科技有限公司；甲醇，太倉滬試試劑有限公司；氯仿，利安隆博華醫(yī)藥化學有限公司。

SCIENTZ-10N型冷凍干燥機，寧波新芝生物科技股份有限公司；RE-2000A型旋轉蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；LG10-2.4A型高速離心機，北京醫(yī)用離心機廠；722N型可見分光光度計，上海菁華科技儀器有限公司；PX224ZH型電子天平，奧豪斯儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 抗氧化活性成分的提取

稱取鮮活喙尾琵琶甲幼蟲200 g，冷凍干燥得到干蟲體83 g，用研缽將蟲體研碎，放入250 mL錐形瓶中。首先用250 mL正己烷浸提2次，每次超聲5 min；再用250 mL乙酸乙酯浸提2次，將提取后蟲體殘渣中的溶劑揮發(fā)，干燥；最后用600 mL甲醇浸提3次，每次超聲10 min，浸泡30 min，合并甲醇提取液，旋轉蒸發(fā)，得到甲醇膏狀粗提物4.2 g。

1.3.2 抗氧化活性的測定

1.3.2.1 DPPH法

DPPH法是體外評價抗氧化劑抗氧化活性的一種快速、簡便、靈敏可行的方法。其原理為：DPPH自由基是一種穩(wěn)定的自由基，其醇溶液呈深紫色，能夠接受一個電子或是氧離子，在517 nm 處有吸收峰；而具有自由基清除能力的抗氧化劑可以和DPPH自由基的單電子配對，使得517 nm處的吸收峰強度減弱，據此可通過吸光度的變化來檢測DPPH自由基的清除情況。

DPPH自由基溶液的配制：稱取DPPH自由基粉末1 g，用無水乙醇溶解，轉入1 L棕色容量瓶中，用無水乙醇定容，搖勻，得1 000 mg·L-1的DPPH自由基儲備液，置于冰箱中冷藏，備用。

DPPH自由基標準曲線的繪制：吸取DPPH自由基儲備液1 mL，加入無水乙醇19 mL，配制50 mg·L-1的DPPH自由基工作液；用無水乙醇將工作液稀釋成梯度濃度40 mg·L-1、25 mg·L-1、12.5 mg·L-1、6.25 mg·L-1，測定各濃度溶液在517 nm處吸光度；以DPPH自由基濃度為橫坐標、517 nm處吸光度為縱坐標繪制標準曲線。

DPPH自由基清除率的測定：準確稱取喙尾琵琶甲幼蟲甲醇粗提物0.12 g，用15 mL甲醇溶解，4 000 r·min-1離心5 min，得到8 mg·mL-1粗提物母液；將粗提物母液稀釋成濃度(mg·mL-1)分別為6、4、3、2、1、0.5、0.25、0.125的待測溶液；吸取2 mL待測溶液，加入2 mL DPPH自由基工作液，混勻，30 ℃暗室放置30 min，測定517 nm處吸光度，按式(1)計算DPPH自由基清除率。以等濃度VC為對照，同時設置試劑空白和樣品空白[22-23]。

(1)

式中：Ai為待測溶液+DPPH自由基溶液的吸光度；Aj為待測溶液+甲醇的吸光度；A0為甲醇+DPPH自由基溶液的吸光度。

清除DPPH自由基能力IC50值的測定：根據DPPH自由基清除率，通過SPSS軟件計算喙尾琵琶甲幼蟲甲醇粗提物對DPPH自由基清除能力的IC50值。

1.3.2.2 ABTS法

ABTS法[24]測定抗氧化活性原理：ABTS與K2S2O8反應可以生成綠色的ABTS自由基，該自由基在734 nm處有最大吸收峰；當具有自由基清除能力的抗氧化劑加入到ABTS自由基溶液后，會使734 nm處的吸收峰強度減弱，據此可通過吸光度的變化來檢測ABTS自由基的清除情況。

ABTS自由基工作液的配制：用蒸餾水分別配制7 mmol·L-1ABTS自由基溶液、2.45 mmol·L-1K2S2O8溶液；將兩種溶液按體積比1∶1混合，4 ℃避光靜置15 h，得到ABTS自由基母液；將ABTS自由基母液用無水乙醇稀釋成734 nm處吸光度為0.70±0.02的工作液。

ABTS自由基清除率的測定：準確稱取喙尾琵琶甲幼蟲甲醇粗提物0.12 g，用15 mL甲醇溶解，4 000 r·min-1離心5 min，得到8 mg·mL-1粗提物母液；將粗提物母液稀釋成濃度(mg·mL-1)分別為6、4、3、2、1、0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25的待測溶液；吸取1 mL待測溶液，加入3 mL ABTS自由基工作液，混勻，25 ℃反應30 min，測定734 nm處吸光度[25]，按式(2)計算ABTS自由基清除率。

(2)

式中：Ai為待測溶液+ABTS自由基溶液的吸光度；Aj為待測溶液+甲醇的吸光度；A0為甲醇+ABTS自由基溶液的吸光度。

清除ABTS自由基能力IC50值的測定：根據ABTS自由基清除率，通過SPSS軟件計算喙尾琵琶甲幼蟲甲醇粗提物對ABTS自由基清除能力的IC50值。

1.3.2.3 FRAP法

FRAP法測定抗氧化活性原理：在酸性條件下，Fe3+-TPTZ可被抗氧化劑還原成Fe2+-TPTZ藍色絡合物，該絡合物在593 nm處有最大吸收峰，可用來反映抗氧化劑的總抗氧化活性。

FRAP工作液的配制：將pH值為3.6的醋酸鹽緩沖液、10 mmol·L-1TPTZ溶液、20 mmol·L-1FeCl3溶液按體積比10∶1∶1混合，即得。

FeSO4·7H2O標準曲線的繪制：取2 mmol·L-1、1 mmol·L-1、0.5 mmol·L-1、0.25 mmol·L-1、0.125 mmol·L-1、0.062 5 mmol·L-1的FeSO4·7H2O溶液各0.15 mL，加入3.6 mL FRAP工作液，混勻，于37 ℃反應30 min，測定各濃度溶液在593 nm處吸光度；以FeSO4·7H2O溶液濃度為橫坐標、593 nm處吸光度為縱坐標繪制標準曲線。

FRAP值的測定：準確稱取喙尾琵琶甲幼蟲甲醇粗提物0.12 g，用15 mL甲醇溶解，4 000 r·min-1離心5 min，得到8 mg·mL-1粗提物母液；將粗提物母液稀釋成濃度(mg·mL-1)分別為6、4、2、1、0.5的待測溶液；吸取0.15 mL待測溶液，加入3.6 mL FRAP工作液，混勻，37 ℃反應30 min，測定593 nm處吸光度。以FRAP值表征總抗氧化活性，以1 mmol·L-1FeSO4·7H2O為標準，總抗氧化活性以達到同樣吸光度時為一個FRAP值[24-25]。

2 結果與討論

2.1 DPPH法測定喙尾琵琶甲幼蟲甲醇粗提物抗氧化活性結果

從DPPH自由基標準曲線(圖2)可以看出：DPPH自由基溶液濃度在6.25～50 mg·mL-1范圍內，與517 nm處吸光度線性關系良好，線性方程為y=0.0226x+0.0162，R2=0.9994。

圖2 DPPH自由基標準曲線

喙尾琵琶甲幼蟲甲醇粗提物對DPPH自由基的清除率如圖3所示。

圖3 喙尾琵琶甲幼蟲甲醇粗提物對DPPH自由基的清除率

從圖3可以看出，喙尾琵琶甲幼蟲甲醇粗提物具有清除DPPH自由基的能力。粗提物對DPPH自由基的清除率隨著濃度的增加逐漸升高，當粗提物濃度增至3 mg·mL-1時，DPPH自由基清除率升至(92.53±2.26)%；之后，繼續(xù)增加粗提物濃度，清除率基本無變化；粗提物對DPPH自由基清除能力的IC50值為1.086 mg·mL-1(VC的IC50值為1.470 mg·L-1)。

2.2 ABTS法測定喙尾琵琶甲幼蟲甲醇粗提物抗氧化活性結果

喙尾琵琶甲幼蟲甲醇粗提物對ABTS自由基的清除率如圖4所示。

圖4 喙尾琵琶甲幼蟲甲醇粗提物對ABTS自由基的清除率

從圖4可以看出，喙尾琵琶甲幼蟲甲醇粗提物具有清除ABTS自由基的能力。在0.031 25～1 mg·mL-1濃度范圍內，粗提物對ABTS自由基的清除率隨著濃度的增加迅速升高，在粗提物濃度為1 mg·mL-1時，清除率達到(99.60±0.49)%；之后，繼續(xù)增加粗提物濃度，清除率基本無變化；粗提物對ABTS自由基清除能力的IC50值為0.177 mg·mL-1(VC的IC50值為7.822 mg·L-1)。

與DPPH自由基清除率相比，喙尾琵琶甲幼蟲甲醇粗提物對ABTS自由基的清除率更高。與文獻[14,16]報道結果比較，喙尾琵琶甲幼蟲甲醇粗提物對ABTS自由基的清除作用低于7種云南可食用昆蟲生樣和熟樣醇提液對ABTS自由基的清除作用，但是高于喙尾琵琶甲成蟲醇提物依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取的提取物。

2.3 FRAP法測定喙尾琵琶甲幼蟲甲醇粗提物抗氧化活性結果

從FeSO4·7H2O標準曲線(圖5)可以看出：FeSO4·7H2O溶液濃度在0.062 5～2 mmol·L-1范圍內，與593 nm處吸光度呈良好的線性關系，線性方程為y=0.9057x+0.0638，R2=0.9972。

圖5 FeSO4·7H2O的標準曲線

喙尾琵琶甲幼蟲甲醇粗提物的總抗氧化活性隨著濃度的增加而升高，在0.5～8 mg·mL-1濃度范圍內，FRAP值從0.12增至0.70(圖6)。

圖6 喙尾琵琶甲幼蟲甲醇粗提物的總抗氧化活性

3 結論

DPPH法、ABTS法、FRAP法等3種體外抗氧化活性評價方法都表明喙尾琵琶甲幼蟲提取物具有體外抗氧化活性。在喙尾琵琶甲幼蟲甲醇粗提物濃度為3 mg·mL-1時，其對DPPH自由基的清除率為(92.53±2.26)%；在喙尾琵琶甲幼蟲甲醇粗提物濃度為1 mg·mL-1時，其對ABTS自由基的清除率為(99.60±0.49)%；在喙尾琵琶甲幼蟲甲醇粗提物濃度為8 mg·mL-1時，其總抗氧化活性的FRAP值為0.70。在低濃度下，粗提物的抗氧化活性雖然低于VC，但隨著濃度的增加，其抗氧化活性逐漸升高，甚至可以達到VC的抗氧化效果。本研究僅對喙尾琵琶甲幼蟲粗提物進行了抗氧化活性分析，其幼蟲蟲態(tài)是否具有成蟲一樣的藥用功效還有待進一步研究。未來將進一步對喙尾琵琶甲幼蟲粗提物進行分離純化，提高其抗氧化活性，并對有效成分進行鑒定以促進其開發(fā)利用。