徐小娜,牛海青,王曉霞,田 晴,高 茜,蘇 春

(1.咸陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)藥化工學(xué)院，陜西 咸陽 712000；2.陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710119)

海洋占地球表面積的70%，擁有非常豐富的微生物資源[1]。高壓、低溫、氧氣和鹽含量分布不均勻、營養(yǎng)匱乏、環(huán)境復(fù)雜等特殊性造就了海洋放線菌獨特復(fù)雜的代謝途徑，使得海洋放線菌代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)新穎、復(fù)雜多樣和生物活性較高[2]。人們從19世紀(jì)20年代開始對海洋放線菌代謝產(chǎn)物進行研究，大多集中在抗腫瘤、抗病毒和抗菌等方面，對抗補體活性方面的研究非常少。

補體系統(tǒng)是由30多種膜結(jié)合性蛋白、補體受體和可溶性蛋白組成的多分子系統(tǒng)，是存在于正常動物和人組織液及血清中的一組經(jīng)活化后具有酶活性的蛋白質(zhì)。補體系統(tǒng)的主要組分為C1～C9化合物，激活途徑主要有3種：經(jīng)典途徑(classical pathway，CP)、旁路途徑(alternative pathway，AP)和凝集素途徑(lectin pathway，LP)[3]。但是，補體異常激活會引起許多疾病，如阿爾茲海默癥、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等，其過度激活也會對紅細胞、血管、腎臟和關(guān)節(jié)等組織造成實質(zhì)性損傷[4]。所以，抗補體活性藥物的研發(fā)引起了人們的廣泛關(guān)注。目前，臨床上普遍使用甲胺蝶呤、糖皮質(zhì)激素、環(huán)磷酰胺等免疫抑制劑治療某些與補體異常激活相關(guān)的疾病，但這些抑制劑并非專一的補體抑制劑，選擇性較差，長期使用會造成機體的防御機能降低，從而造成抗感染能力下降，容易使?jié)撛诓≡顢U散和繼發(fā)感染，并產(chǎn)生多種副作用和并發(fā)癥[5]。所以，臨床醫(yī)學(xué)上急需具有高效、低毒和專一等特性的補體抑制劑。

作者以抗補體活性為評價指標(biāo)，在單因素實驗的基礎(chǔ)上，采用正交實驗優(yōu)化海洋放線菌S187產(chǎn)抗補體活性物質(zhì)的發(fā)酵工藝，擬為海洋放線菌S187抗補體活性物質(zhì)的開發(fā)研究奠定基礎(chǔ)。

1 實驗

1.1 菌株與培養(yǎng)基

海洋放線菌S187，采自大連星海灣海底沉積物，保存于-80 ℃冰箱。

TSB培養(yǎng)基(M1)(g·L-1)：胰蛋白胨 17，大豆蛋白胨 3，葡萄糖 5，NaCl 5，K2HPO42.5，自然pH值。

二號培養(yǎng)基(M2)(g·L-1)：葡萄糖 10，可溶性淀粉 20，牛肉膏 3，蛋白胨 5，酵母提取物 5，(NH4)2SO45，CaCO34，pH值7.5。

ISP4培養(yǎng)基(M3)(g·L-1)：可溶性淀粉 10，(NH4)2SO42，K2HPO41，NaCl 1，蛋白胨 1，酵母粉 0.5，CaCO32，微量元素 100 μL，pH值7.2～7.5。

ISP2培養(yǎng)基(M4)(g·L-1)：酵母提取物 4，麥芽提取物 10，葡萄糖 4，pH值7.2～7.5。

AM2ab 培養(yǎng)基(M5)(g·L-1)：大豆粉 5，酵母粉 5，可溶性淀粉 20，蛋白胨 2，CaCO32，pH值7.2～7.5。

RA培養(yǎng)基(M6)(g·L-1)：麥芽提取物10，葡萄糖 10，玉米粉 5，可溶性淀粉 20，麥芽糖 10，微量元素 100 μL，pH值7.2～7.5。

豆粉培養(yǎng)基(M7)(g·L-1)：可溶性淀粉 20，大豆粉 25，(NH4)2SO42，NaCl 2，K2HPO40.5，CaCO35，pH 值7.2。

A1培養(yǎng)基(M8)(g·L-1)：可溶性淀粉 10，酵母粉 4，蛋白胨 2，人造海鹽 28(可用75%的海水代替人造海鹽)，自然pH值。

九號培養(yǎng)基(M9)(g·L-1)：玉米粉 30，大豆粉 7，KNO31.5，K2HPO40.5，pH值7.5。

大豆粉先煮沸，用8層紗布過濾后再加入到培養(yǎng)基中；微量元素(mg·L-1)：ZnCl2800，F(xiàn)eCl3·6H2O 4 000，CuCl2·2H2O 200，MnCl2·4H2O 200，NaB4O7·10H2O 200；配制固體培養(yǎng)基均加入2%瓊脂；所有培養(yǎng)基均用滅菌鍋121 ℃滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 菌種活化及種子液的制備

菌種活化：取保存于-80 ℃冰箱中的菌懸液1 mL，涂布于M9固體培養(yǎng)基平板上，于28 ℃培養(yǎng)4～8 d。

種子液的制備：用接種環(huán)從平板上刮取1 cm2活化的菌株S187孢子，接種于裝有50 mL M1液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，于28 ℃、220 r·min-1培養(yǎng)2 d。

1.2.2 樣品制備

種子液經(jīng)離心后，得到上清液和菌絲體；用乙酸乙酯反復(fù)萃取上清液3次；用甲醇-丙酮(體積比1∶1)過夜破壁浸提菌絲體，減壓蒸餾得到菌絲體水溶液，再用等體積的乙酸乙酯反復(fù)萃取3次；將上述兩個乙酸乙酯萃取液合并，濃縮得到浸膏；再用5% 二甲基亞砜溶液超聲溶解、稀釋，得到濃度為0.06 mg·mL-1的菌株S187代謝產(chǎn)物的粗提物。

1.2.3 菌株S187代謝產(chǎn)物的抗補體活性測定

(1)5倍巴比妥緩沖液(5×BBS)：取2.875 g巴比妥鈉溶于250 mL熱水中，加入42.5 g NaCl、0.84 g MgCl2·6H2O、0.14 g CaCl2、1.0 g巴比妥，再加入三蒸水至1 000 mL，即得。實驗時將5×BBS緩沖液直接稀釋成1×BBS緩沖液。

(2)2%綿羊紅細胞(2%SRBC)：取2 mL綿羊血，用1×BBS緩沖液洗滌后，3 000 r·min-1離心5 min，重復(fù)洗滌3次，再補加1×BBS緩沖液至2 mL，混勻；取約0.5 mL于紅細胞的壓積管中，3 000 r·min-1離心10 min，測定綿羊紅細胞的體積百分比，加入適量1×BBS緩沖液配制成2%SRBC。

(3)溶血素(效價1∶4 000)：實驗時用1×BBS緩沖液將效價1∶4 000的溶血素稀釋成1∶1 000。

采用經(jīng)典途徑溶血法[6-7]測定菌株S187代謝產(chǎn)物的抗補體活性：將樣品與補體混合均勻，置于37 ℃水浴鍋中水浴10 min；按表1加入1×BBS緩沖液、溶血素和2%SRBC，于37 ℃水浴30 min后，放在冰上冷卻；于4 ℃、5 000 r·min-1離心10 min，取上清液0.2 mL于96孔板中，用酶標(biāo)儀測定OD405值。同時設(shè)置樣品對照組、補體組和全溶血組。將樣品組的OD405值扣除相應(yīng)樣品對照組的OD405值后計算溶血抑制率(抑制率越高，抗補體活性越高)。按下式計算抗補體活性：

表1 經(jīng)典途徑溶血法測定抗補體活性實驗中各處理組成分/mL

1.2.4 發(fā)酵工藝優(yōu)化

以抗補體活性為評價指標(biāo)，先分別考察碳源、氮源、發(fā)酵時間、初始pH值對菌株S187代謝產(chǎn)物抗補體活性的影響；然后在單因素實驗的基礎(chǔ)上，選取碳源含量、氮源含量、發(fā)酵時間、初始pH值為考察因素，采用L9(34)正交實驗優(yōu)化菌株S187產(chǎn)抗補體活性物質(zhì)的發(fā)酵工藝，利用SAS軟件分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基的篩選

取3 mL種子液分別接種于M1、M2、M3、M4、M5、M6、M7、M8等8種液體培養(yǎng)基中，于28 ℃、220 r·min-1培養(yǎng)6 d，測定菌株S187代謝產(chǎn)物的抗補體活性，結(jié)果如圖1所示。

圖1 菌株S187在不同培養(yǎng)基中代謝產(chǎn)物的抗補體活性

從圖1可以看出，菌株S187在M7培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，代謝產(chǎn)物的抗補體活性最高。因此，選擇M7培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基進行發(fā)酵工藝優(yōu)化。

2.2 單因素實驗結(jié)果

2.2.1 碳源對抗補體活性的影響

在基礎(chǔ)培養(yǎng)基其它成分不變的條件下，分別以葡萄糖、麥芽糖、蔗糖和乳糖等量替換基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的可溶性淀粉，測定菌株S187代謝產(chǎn)物的抗補體活性，考察碳源對抗補體活性的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 碳源對抗補體活性的影響

從圖2可以看出，以可溶性淀粉為碳源時，菌株S187代謝產(chǎn)物的抗補體活性最高，其次是葡萄糖、蔗糖和麥芽糖；以乳糖為碳源時的抗補體活性最低。因此，確定最佳碳源為可溶性淀粉。

2.2.2 氮源對抗補體活性的影響

在基礎(chǔ)培養(yǎng)基其它成分不變的條件下，分別以花生粉、蛋白胨、玉米粉和牛肉粉等量替換基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的大豆粉，測定菌株S187代謝產(chǎn)物的抗補體活性，考察氮源對抗補體活性的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 氮源對抗補體活性的影響

從圖3可以看出，以大豆粉為氮源時，菌株S187代謝產(chǎn)物的抗補體活性最高，其次是玉米粉、花生粉和牛肉粉；以蛋白胨為氮源時的抗補體活性最低。因此，確定最佳氮源為大豆粉。

2.2.3 發(fā)酵時間對抗補體活性的影響

將種子液按6%的接種量接種于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，于28 ℃、220 r·min-1下分別發(fā)酵3 d、4 d、5 d、6 d、7 d，測定菌株S187代謝產(chǎn)物的抗補體活性，考察發(fā)酵時間對抗補體活性的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 發(fā)酵時間對抗補體活性的影響

從圖4可以看出，發(fā)酵時間對菌株S187代謝產(chǎn)物的抗補體活性影響較大；隨著發(fā)酵時間的延長，抗補體活性呈先升高后降低的趨勢，在發(fā)酵第6 d時，抗補體活性達到最高。這是因為，隨著發(fā)酵時間的延長，抗補體活性物質(zhì)的產(chǎn)量逐漸增多，抗補體活性相應(yīng)逐漸升高；但發(fā)酵時間過長，抗補體活性物質(zhì)逐漸被消耗，抗補體活性反而會降低。因此，發(fā)酵時間以6 d為宜。

2.2.4 初始pH值對抗補體活性的影響

將基礎(chǔ)培養(yǎng)基初始 pH值分別調(diào)至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，將種子液按6%的接種量接種于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，28 ℃、220 r·min-1下發(fā)酵6 d，測定菌株S187代謝產(chǎn)物的抗補體活性，考察初始pH值對抗補體活性的影響，結(jié)果如圖5所示。

圖5 初始pH值對抗補體活性的影響

從圖5可以看出，當(dāng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基初始pH值為7.0時，菌株S187代謝產(chǎn)物的抗補體活性最高，進一步證明，在發(fā)酵過程中，只有在合適的環(huán)境下，菌株才能正常生長并產(chǎn)生代謝產(chǎn)物；當(dāng)初始pH值低于7.0或者高于7.0時，代謝產(chǎn)物的抗補體活性均有不同程度的降低。因此，基礎(chǔ)培養(yǎng)基初始pH值以7.0為宜。

2.3 正交實驗結(jié)果與方差分析

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，選取可溶性淀粉含量(A)、大豆粉含量(B)、發(fā)酵時間(C)、初始pH值(D)為考察因素，采用L9(34)正交實驗優(yōu)化菌株S187產(chǎn)抗補體活性物質(zhì)的發(fā)酵工藝。正交實驗的結(jié)果與分析見表2，方差分析見表3。

表2 正交實驗的結(jié)果與分析

從表2、3可以看出，各因素對抗補體活性影響的大小順序依次為D>B>C>A；因素B和D有顯著性差異，因素A和C沒有顯著性差異。結(jié)合極差分析，最終確定最佳發(fā)酵工藝為A2B3C3D3，即可溶性淀粉20 g·L-1、大豆粉35 g·L-1、發(fā)酵時間7 d、初始pH值7.5。

2.4 工藝驗證

分別稱取20 g·L-1可溶性淀粉、35 g·L-1大豆粉，基礎(chǔ)培養(yǎng)基其余成分不變，調(diào)節(jié)初始pH值為7.5，發(fā)酵7 d，進行3次重復(fù)實驗。測得菌株S187代謝產(chǎn)物的抗補體活性分別為69.35%、69.38%、69.33%，平均抗補體活性為69.35%。表明該工藝穩(wěn)定可靠。

3 結(jié)論

采用單因素實驗和正交實驗優(yōu)化了海洋放線菌S187產(chǎn)抗補體活性物質(zhì)的發(fā)酵工藝。確定最佳發(fā)酵工藝為：可溶性淀粉20 g·L-1，大豆粉35 g·L-1，(NH4)2SO42 g·L-1，NaCl 2 g·L-1，K2HPO40.5 g·L-1，CaCO35 g·L-1，初始pH值7.5，于28 ℃、220 r·min-1下發(fā)酵7 d。在此條件下，海洋放線菌S187代謝產(chǎn)物的抗補體活性為69.35%。為海洋放線菌S187代謝產(chǎn)物的抗補體活性的進一步研究奠定了基礎(chǔ)。