陳麗娜，王建剛，王亞俊，秦 歡，丁會芹,*

(1.康立泰生物醫(yī)藥(青島)有限公司，山東 青島 266112；2.青島大學(xué)，山東 青島 266001)

目前市場上尚未有任何一種上市藥物能夠單品種、單次劑量實(shí)現(xiàn)抑制腫瘤細(xì)胞生長，調(diào)節(jié)免疫功能且能夠同時促進(jìn)全血象恢復(fù)。臨床上常需將多種藥物或治療方式聯(lián)合，治療方案復(fù)雜且效果有限。白介素-12(interleukin-12，IL-12)是一種具有多種生物學(xué)功能的細(xì)胞因子，具有明確的免疫調(diào)節(jié)、抑制腫瘤細(xì)胞生長功能，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的唯一能夠促進(jìn)造血功能全面恢復(fù)的細(xì)胞因子類藥物[1]。IL-12同時具有抗腫瘤[2]、免疫調(diào)節(jié)[3]及血象恢復(fù)[4]等作用，能夠填補(bǔ)臨床治療的空白。重組人白介素-12(rhIL-12)產(chǎn)品在全球范圍內(nèi)還未上市，是真正意義上的國家一類創(chuàng)新藥物，其市場潛力巨大。rhIL-12蛋白結(jié)構(gòu)與天然IL-12的一致，是由α亞基和β亞基經(jīng)1個二硫鍵共價結(jié)合而成的異二聚體糖蛋白。α亞基由197個氨基酸組成，包含7個半胱氨酸殘基和3個潛在的N-連接糖基化位點(diǎn)；β亞基由306個氨基酸組成，包括10個半胱氨酸殘基和4個潛在的N-連接糖基化位點(diǎn)[5]。

生物技術(shù)藥物的生物學(xué)活性通常與種屬和/或組織特異性相關(guān)，因此應(yīng)進(jìn)行報(bào)審前的非臨床藥效研究及安全性評價，以闡明藥理學(xué)及毒理學(xué)等特征[6]。這就需要確定能夠預(yù)測臨床風(fēng)險的相關(guān)種屬或動物模型，在進(jìn)行非臨床藥效研究和安全性評價前，需關(guān)注種屬間IL-12氨基酸序列的特異性及其同源性，并進(jìn)行氨基酸信息學(xué)比對分析。為此，作者通過UniProt數(shù)據(jù)庫檢索人、鼠、兔、犬和猴的IL-12氨基酸序列，運(yùn)用ClustalW及Espript軟件進(jìn)行兩序列比對，運(yùn)用Blat數(shù)據(jù)庫進(jìn)行多序列比對，為IL-12產(chǎn)品以及相關(guān)衍生產(chǎn)品的非臨床研究和評價中動物種屬的選擇提供依據(jù)，以指導(dǎo)新藥產(chǎn)品的注冊申報(bào)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料

在UniProt數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)分別輸入關(guān)鍵詞“IL-12 α”和“IL-12 β”，獲得蛋白質(zhì)氨基酸序列，選擇小鼠、大鼠、兔、犬、食蟹猴及人的IL-12氨基酸序列，排除“同物種序列”、“相似序列”及其它不相關(guān)序列；其中，人IL-12氨基酸序列去除信號肽序列。

1.2 方法

采用ClustalW及Espript軟件將獲取的人IL-12氨基酸序列與各種屬IL-12氨基酸序列進(jìn)行兩序列比對。即分別將人與另一種動物的IL-12氨基酸序列復(fù)制到ClustalW軟件中，點(diǎn)擊“Execute Multiple Alignment”運(yùn)行軟件，獲得兩序列比對文件，將所得文件上傳至Espript軟件，點(diǎn)擊“Submit”獲得兩序列比對結(jié)果文件。

采用Blat數(shù)據(jù)庫(http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat)依次選擇小鼠、大鼠、兔、犬、恒河猴、食蟹猴數(shù)據(jù)庫并輸入獲取的人IL-12氨基酸序列，點(diǎn)擊“Submit”運(yùn)行數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行多序列比對；另外，選擇人數(shù)據(jù)庫并輸入獲取的5種動物種屬的IL-12氨基酸序列，運(yùn)行數(shù)據(jù)庫進(jìn)行多序列比對。完成比對后，分析人IL-12與各種屬IL-12的同源性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 各種屬IL-12氨基酸序列檢索結(jié)果

在UniProt數(shù)據(jù)庫檢索到與IL-12 α亞基氨基酸相關(guān)序列共435個，與IL-12 β亞基氨基酸相關(guān)序列共737個，排除“同物種序列”、“相似序列”及其它不相關(guān)序列。選擇非臨床研究中常用5種動物的IL-12 α亞基氨基酸序列，包括：小鼠(mouse，P43431)、大鼠(rat，Q9R103)、兔(rabbit，A0A5F9CIX7)、犬(dog，F(xiàn)1PPC0)、食蟹猴(crab-eating macaque，A0A2K5V4L8)；選擇5種動物的IL-12 β亞基氨基酸序列，包括：小鼠(mouse，P43432)、大鼠(rat，Q9R278)、兔(rabbit，G1TBD7)、犬(dog，F(xiàn)1PK70)、食蟹猴(crab-eating macaque，G7P6S2)。選擇人的IL-12 α亞基(human，p29459)及IL-12 β亞基(human，p29460)氨基酸序列，去除信號肽序列，即分別為197個氨基酸的IL-12 α亞基及306個氨基酸的IL-12 β亞基。

2.2 兩序列比對結(jié)果

采用ClustalW及Espript軟件比對人與5種動物的IL-12 α亞基及IL-12 β亞基氨基酸序列，兩序列比對結(jié)果見表1。

表1 人與5種動物的IL-12氨基酸序列比對結(jié)果/%

相似性數(shù)值越大，表明同源性越高。由表1可以看出，IL-12 α亞基及IL-12 β亞基氨基酸序列同源性在人與小鼠之間分別為80.47%、84.84%，在人與大鼠之間分別為81.40%、84.37%，在人與兔之間分別為88.81%、91.01%，在人與犬之間分別為90.32%、91.95%，在人與食蟹猴之間分別為87.15%、95.88%。其中，人與食蟹猴的IL-12氨基酸序列同源性相對較高。

人與食蟹猴的IL-12 α亞基及IL-12 β亞基氨基酸序列比對見圖1。

注：深色背景序列表示人與食蟹猴相同的IL-12氨基酸序列

2.3 多序列比對結(jié)果

采用Blat數(shù)據(jù)庫，比對人IL-12與6種動物數(shù)據(jù)庫的氨基酸序列，結(jié)果見表2。

表2 人IL-12與6種動物數(shù)據(jù)庫的氨基酸序列比對結(jié)果

得分越高，種屬一致性越高。由表2可以看出，人的IL-12 α亞基及IL-12 β亞基氨基酸序列與恒河猴的一致性分別高達(dá)94.0%、96.2%，與食蟹猴的一致性分別高達(dá)92.8%、96.2%，與其它種屬的一致性相對較低。選擇人IL-12 β亞基氨基酸序列與食蟹猴數(shù)據(jù)庫比對時，產(chǎn)生了4個食蟹猴氨基酸的匹配位置數(shù)據(jù)，第一個匹配數(shù)據(jù)表2中有顯示，另外3個得分都很低，并且跨度≤15 bp(base pair，堿基對)，雖然一致性均為100%，但這些匹配可能具有偶然性，不能代表人的IL-12 β亞基氨基酸序列與此位置有真正關(guān)系。

采用Blat數(shù)據(jù)庫，比對5種動物IL-12與人數(shù)據(jù)庫的氨基酸序列(表3)。分析一致性發(fā)現(xiàn)，5種動物的IL-12 α亞基及IL-12 β亞基氨基酸序列與人的一致性大小順序依次為食蟹猴>犬>兔>大鼠>小鼠。

表3 5種動物IL-12與人數(shù)據(jù)庫的氨基酸序列比對結(jié)果

2.4 討論

IL-12是一種異源二聚體蛋白，具有與二硫鍵共價結(jié)合的α亞基和β亞基，是一種有效的抗腫瘤藥物。能夠通過刺激CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞毒性，誘導(dǎo)Th1細(xì)胞分化，刺激抗原遞呈細(xì)胞對腫瘤抗原的遞呈作用，促進(jìn)NK細(xì)胞、T細(xì)胞等IFN-γ分泌作用，抑制腫瘤血管生成等多種途徑增強(qiáng)機(jī)體免疫系統(tǒng)的腫瘤免疫作用，甚至可通過免疫調(diào)節(jié)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生自身抗腫瘤的“遠(yuǎn)端效應(yīng)”和“免疫記憶”[7-9]。目前，已證實(shí)IL-12是唯一能夠促進(jìn)骨髓造血系統(tǒng)全血象長久恢復(fù)的細(xì)胞因子，也是唯一能在輻射后24 h給藥仍然顯示全血象恢復(fù)功能的細(xì)胞因子[10-11]。IL-12還具有抗病毒[12]、抗肝炎[13]、抗寄生蟲[14]、抗哮喘[15]等多種生物學(xué)活性，其通過一系列復(fù)雜的作用機(jī)制來發(fā)揮作用。

多數(shù)生物技術(shù)藥物在蛋白質(zhì)水平具有嚴(yán)格的種屬特異性，導(dǎo)致相應(yīng)的一般藥理學(xué)、藥代動力學(xué)、藥效學(xué)評價及毒理學(xué)研究都存在種屬特異性問題。因而此類藥物的非臨床研究及安全性評價的主要挑戰(zhàn)就是確定相關(guān)種屬或動物模型。采用相關(guān)種屬進(jìn)行非臨床研究及安全性評價有助于預(yù)測產(chǎn)品在臨床試驗(yàn)中可能出現(xiàn)的治療效果及不良反應(yīng)。

3 結(jié)論

分別采用了兩序列比對及多序列比對的方式進(jìn)行氨基酸序列比對，雖然不同方式得出的一致性數(shù)據(jù)存在差異，但總體上，人的IL-12 α亞基及IL-12 β亞基氨基酸序列與常用種屬的同源性大小順序均為猴源>犬源>兔源>鼠源。即人的IL-12氨基酸序列與恒河猴、食蟹猴的一致性較高，與其它種屬的一致性普遍較低，因此存在種屬特異性。研究結(jié)果提示，IL-12產(chǎn)品以及相關(guān)衍生產(chǎn)品的藥理、藥效研究以及需種屬相關(guān)性動物進(jìn)行的安全性評價應(yīng)該在食蟹猴或恒河猴身上進(jìn)行，才能獲得有意義于申報(bào)臨床及上市的試驗(yàn)結(jié)果。