黃貝，王鵬,2*，溫明霞，吳韶輝，徐建國,2

（1.浙江省柑橘研究所，浙江臺州 318026；2.國家柑橘品種改良中心浙江分中心，浙江臺州 318026）

柑橘花芽形成是營養(yǎng)生長向生殖生長轉(zhuǎn)變的重要標志[1]，這一過程包含形態(tài)學、生理學、遺傳表達等多方面的復雜變化。柑橘實生苗童期長達3～8年，其間花芽分化受阻，只進行營養(yǎng)生長，但嫁接的枝條經(jīng)過誘導，次年便可形成花芽，進入生殖生長[2]?；ㄑ渴欠癯晒Ψ只苯佑绊懜涕俚膾旃亢秃笃诠麑嵠焚|(zhì)，對果樹大小年的控制有極大的意義。充足的養(yǎng)分積累有利于樹勢的保持，水分供應是植物生長代謝的物質(zhì)基礎，花芽分化期間需要適當?shù)乃使?。生產(chǎn)上通過控制水分對果樹的發(fā)育周期進行調(diào)節(jié)，檸檬[3-4]、金柑和四季橘[5]在水分調(diào)控作用下實現(xiàn)全年多次集中開花，具有可觀的經(jīng)濟效益。李文慶等[6]曾在干旱條件下研究砂糖橘花芽分化與形成，發(fā)現(xiàn)干旱可以誘導砂糖橘花芽分化提前，且在不同強度干旱處理下花芽萌發(fā)率皆高于對照組，開花樹比例及成花數(shù)量均隨誘導時間延長而增加。柑橘花芽生理分化過程伴隨著一系列成花相關(guān)基因的表達，并受轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄水平和表觀調(diào)控的影響。同源FLOWERING LOCUS T（FT）基因產(chǎn)物在多數(shù)植物體內(nèi)被認定為“成花素”，NISHIKAWA等克隆了溫州蜜柑成花同源基因FT，并在后續(xù)實驗中驗證了FT基因轉(zhuǎn)錄水平的高低可以作為評估柑橘花芽分化是否形成和完全的指標[7-8]。PILLITTERI等[9]曾報道甜橙花芽形成末期APETALA1（AP1）轉(zhuǎn)錄水平增加明顯，并認為AP1蛋白參與甜橙開花器官的發(fā)育，因而推測溫州蜜柑在花芽形態(tài)學形成期間AP1基因轉(zhuǎn)錄水平會顯著性增加。目前，柑橘干旱脅迫方面的研究大多集中于處理后對樹勢生理和果實品質(zhì)的影響，而干旱促進柑橘成花方面的研究還比較少。本實驗通過設置多種干旱處理，追蹤處理后植株成花狀態(tài)，檢測樹體生理參數(shù)和成花相關(guān)基因FT和AP1的表達量，明確何種處理對溫州蜜柑兩年生嫁接苗成花誘導效果最好。該研究結(jié)果可對干旱調(diào)控成花技術(shù)的開發(fā)及其在柑橘設施生產(chǎn)中的應用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與生長環(huán)境

選取長勢一致的兩年生溫州蜜柑‘由良’（Citrus unshiu‘Yura’）嫁接容器苗植株并帶土移栽入44 cm×33 cm×25 cm 的塑料盆中，于2019 年4 月置于浙江省柑橘研究所實驗基地避雨棚內(nèi)生長，樣品隨機區(qū)組排列。2019 年9 月20 日開始進行干旱脅迫，除水分外，其他栽培管理措施均保持一致。制作切片的腋芽采集時間為2020 年3 月9 日，每個處理組重復取樣2 次；用作基因檢測和生理指標測定的新梢葉片和莖的采集統(tǒng)一在干旱設定時間結(jié)束后上午10：00左右，每組樣品重復取樣3次，擦凈表面污物，立即投入液氮中，帶回實驗室于－80 ℃條件下保存，備用。

1.2 干旱脅迫程度的確立與保持

干旱處理前正常澆水管理4 個月以恢復樹勢，實驗開始前將參試的盆栽苗澆透，待含水量下降到預設值時開始進行實驗。據(jù)前人測定，柑橘根系生長適宜的土壤（絕對）含水量為17%～18%[10]，本實驗根據(jù)土壤水分含量不同設對照（CK，土壤含水量為15%～20%）、輕度干旱（12%～15%）、中度干旱（8%～10%）和重度干旱（4%～6%）4 個處理水平，每個處理設置3 個生物學重復。每天上午9：00 用農(nóng)業(yè)環(huán)境監(jiān)測儀（浙江托普云農(nóng)科技股份有限公司）測定柑橘根圍3個不同位置的土壤含水量，并根據(jù)每日測定數(shù)據(jù)和耗水量，定時定量澆水，使之維持在設定的土壤水分波動范圍內(nèi)。實驗處理時間為20、30 和40 d，每個處理組設3 個生物學平行實驗。不同的干旱處理結(jié)束之后，皆對盆栽進行正常的水分管理，使之恢復樹勢。

1.3 干旱處理結(jié)束后對溫州蜜柑花芽形態(tài)分化、開花及坐果的追蹤

2020 年花芽形態(tài)學觀察從現(xiàn)蕾期持續(xù)到盛花期結(jié)束，并統(tǒng)計坐果率。

1.4 石蠟切片的制作

經(jīng)甲醛-乙酸-乙醇（formaldehyde-acetic acidethanol, FAA）固定之后的腋芽用于植物切片的制作[11]，染色液為愛氏蘇木精染液，切片完成后直接脫蠟、封片，最后用BX43顯微攝影機（日本OLYMPUS株式會社）進行觀察攝影。

1.5 溫州蜜柑生理指標的檢測

葉綠素a和葉綠素b的含量用分光光度法測定，檢測波長分別為645和663 nm，根據(jù)經(jīng)驗公式可計算得葉綠素a和葉綠素b以及總?cè)~綠素含量[12]；可溶性糖含量的測定采用蒽酮法[13]，檢測波長為625 nm；可溶性蛋白質(zhì)含量的測定采用2，2-聯(lián)喹啉-4，4-二甲酸二鈉（bicinchoninic acid hydrate disodium salt,BCA）法[14]，檢測波長為562 nm。以上檢測試劑盒均購自江蘇科銘生物技術(shù)有限公司。

1.6 溫州蜜柑FT 及AP1 基因轉(zhuǎn)錄水平定量分析

以NCBI網(wǎng)站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）上登錄的柑橘屬甜橙（Citrus sinensis）、溫州蜜柑、枳（Poncirus trifoliata）的同源cDNA 為模板，結(jié)合甜橙基因組數(shù)據(jù)庫序列信息克隆FT和AP1基因的保守區(qū)域序列，序列信息見附圖1（http://www.zjujournals.com/agr/CN/10.3785/j.issn.1008-9209.2020.12.251）。再用Premier Primer 軟件設計特異性定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction, PCR）引物，引物序列信息為：Actin-F，TTCTTTCCTTGTATGCGAGTG；Actin-R，ATAGTCAAGAGCGATGTAAGC。FT-F，CGGCAACTTGGAAGGCAGAC；FT-R，GGAGGT CCCAGATTGTAAAG。AP1-F，TTTCTACTTCCA CAGCCACCTC；AP1-R，CAAAGCATCCAAGGCT ACAC。RNA的提取采用TransZol Up Plus RNA試劑盒，模板反轉(zhuǎn)錄采用TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix 試劑盒進行，采用實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR, qRT-PCR）檢測試劑盒Perfect Start Green qPCR SuperMix 進行定量檢測，以上試劑盒均購自北京全氏金生物技術(shù)有限公司；選用β-actin作為內(nèi)參基因；目的基因的相對表達水平用2－ΔΔCT的方法進行分析[15]。qRT-PCR 擴增程序：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，39 個循環(huán)。擴增結(jié)束后于65～95 ℃之間做熔解曲線分析。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Excel 2016 對數(shù)據(jù)進行整理，利用GraphPad Prism 8.0.2 軟件對數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析，并制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤水分的維持

干旱期間土壤水分記錄如圖1 所示。經(jīng)統(tǒng)計，對照組保持設定水分39 d，輕度干旱組保持設定水分36 d，中度干旱組保持設定水分38 d，重度干旱組保持設定水分39 d，基本滿足土壤干旱設定條件。

圖1 控水處理期間盆栽土壤絕對含水量Fig.1 Soil moisture of pot plants during the period of controlling the watering

2.2 干旱脅迫對溫州蜜柑花芽形態(tài)分化的影響

柑橘花芽形態(tài)分化時期分為5個過程：初期、萼片期（S期）、花瓣期（P期）、雄蕊期和雌蕊期（ST期）。對不同處理組間腋芽切片顯微觀察發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫30 d組形態(tài)分化較其他干旱脅迫時間更早，因此，本文只展示干旱脅迫30 d 處理組。如圖2 所示，輕度干旱和重度干旱30 d 的腋芽處于花芽分化初期狀態(tài)，而中度干旱組植株的萼片和花瓣原基顯現(xiàn)。繼續(xù)追蹤植株花芽分化情況，2019年4月3日中度干旱脅迫30 d處理組最先露白，花苞萌發(fā)且開放最早（圖3），花期相比CK組提前9 d，進一步直觀證實中度干旱脅迫30 d處理最有利于溫州蜜柑花芽分化。

圖2 不同程度干旱脅迫30 d組溫州蜜柑花芽分化的形態(tài)特征Fig.2 Flower bud differentiation’s morphological characteristics of the Satsuma mandarin in different degrees of drought stress for 30 d group

圖3 不同程度干旱脅迫30 d組與CK組的溫州蜜柑花序發(fā)育特征Fig.3 Inflorescence developmental characteristics of the Satsuma mandarin in different degrees of drought stress for 30 d and CK groups

2.3 干旱脅迫對溫州蜜柑花枝類型和坐果率的影響

對不同程度干旱脅迫30 d 的溫州蜜柑植株在盛花期的花枝類型和二次生理落果后的坐果率進行統(tǒng)計，結(jié)果如圖4所示：干旱處理后溫州蜜柑有葉花枝的比例有所增加，坐果率稍微下降。

圖4 不同程度干旱脅迫30 d組與CK組溫州蜜柑花枝和坐果率的統(tǒng)計Fig.4 Statistics of flower branches and fruit setting rates of the Satsuma mandarin in different degrees of drought stress for 30 d and CK groups

2.4 干旱脅迫對溫州蜜柑莖和葉片生理參數(shù)的影響

2.4.1 干旱脅迫對溫州蜜柑莖和葉片葉綠素含量的影響

隨著干旱脅迫強度的增加和時間的延長，溫州蜜柑莖和葉的葉綠素含量變化如圖5 所示。其中：輕度和中度干旱脅迫20 d組植株莖中葉綠素a的含量與CK 相比顯著下降，其他組葉綠素a、葉綠素b及總?cè)~綠素含量未表現(xiàn)出顯著變化（圖5A1～A3）；所有重度干旱處理組葉片中葉綠素a 含量與CK 相比均有顯著升高，而葉綠素b和總?cè)~綠素含量與CK相比無顯著性差異（圖5B1～B3）。葉綠素a/b的比值可以反映捕光復合體Ⅱ（light harvesting complexⅡ,LHCⅡ）在所有含葉綠素結(jié)構(gòu)中所占的比值，其值升高表明LHCⅡ含量減少。與對照組相比，輕度和中度干旱脅迫20 d，莖中葉綠素a/b的比值明顯下降，說明莖中LHCⅡ的占比有所增加，且隨著處理時間延長，處理組葉綠素a/b 的值與CK 組持平，無顯著性差異（圖5A4）；葉片中葉綠素a/b的比值在干旱脅迫20 和30 d 組都較CK 組有不同程度的上升，葉片中LHCⅡ的占比減少，說明葉片中葉綠素結(jié)構(gòu)較莖更易受干旱脅迫的破壞（圖5B4）。

圖5 不同程度干旱脅迫下溫州蜜柑莖（A1～A4）和葉片（B1～B4）葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素的含量以及葉綠素a/b的比值Fig.5 Chlorophyll a,chlorophyll b and total chlorophyll contents and ratio of chlorophyll a/b in stems(A1-A4)and leaves(B1-B4)of the Satsuma mandarin under different drought stress treatments

2.4.2 干旱脅迫對溫州蜜柑可溶性糖與可溶性蛋白質(zhì)含量的影響

干旱脅迫期間，葉片中淀粉水解為單糖，可溶性糖的增加有利于植物抵抗逆境。莖中可溶性糖含量隨著干旱強度和時間的積累有升高趨勢，重度干旱處理組與其他處理組相比差異顯著（圖6A）；葉片中可溶性糖含量隨著干旱強度和時間的積累而增加，但相對于CK組，稍有下降（圖6B）。在干旱脅迫期間，蛋白質(zhì)合成受阻，分解過程加強，莖中可溶性蛋白質(zhì)含量為重度干旱脅迫40 d組比CK組顯著升高（圖6C）；葉片中可溶性蛋白質(zhì)含量變化沒有表現(xiàn)出顯著性差異（圖6D）。

圖6 不同程度干旱脅迫下溫州蜜柑莖和葉片可溶性糖和可溶性蛋白質(zhì)的含量Fig.6 Contents of soluble sugar and soluble protein in stems and leaves of the Satsuma mandarin under different drought stress treatments

2.5 干旱脅迫對溫州蜜柑成花相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響

NISHIKAWA 等[7-8]在溫州蜜柑體內(nèi)克隆出了“成花素”基因FT的3 個轉(zhuǎn)錄本，并證實FT基因的表達量可以反映柑橘花芽分化進程。本實驗檢測了不同干旱脅迫下溫州蜜柑莖和葉片中FT基因的相對表達量，結(jié)果顯示：不同干旱條件下莖中FT的表達量與CK組相比有不同程度上升（圖7A），其中在30 d 處理組中，隨著干旱強度增加，植株莖中FT的表達量逐步上升，且皆達到顯著差異水平；葉片中FT的表達量隨著干旱程度和處理時間的延長逐漸上升，處理30 和40 d 組均能夠明顯誘導FT基因的表達加強，與CK 組相比表達倍數(shù)差異在2～12之間（圖7B）。但總的來說，植株干旱處理30 d 后，莖中FT基因的表達量比葉片中高2～3 倍。PILLITTERI 等[9]報道甜橙在開花誘導末期AP1轉(zhuǎn)錄水平增加明顯，并認為AP1參與了開花器官的發(fā)育。對干旱處理之后溫州蜜柑莖和葉片AP1基因的表達進行定量分析，發(fā)現(xiàn)干旱30 d溫州蜜柑莖和葉片中AP1基因的表達量明顯高于其他處理組（圖7C～D）。

圖7 不同程度干旱脅迫下溫州蜜柑莖（A、C）和葉片（B、D）FT和AP1基因的相對表達量Fig.7 Relative expression levels of FT and AP1 in stems(A and C)and leaves(B and D)of the Satsuma mandarin under different drought stress treatments

3 討論

3.1 干旱脅迫對溫州蜜柑成花生理的影響

石蠟切片顯微觀察發(fā)現(xiàn)，中度干旱脅迫30 d的花芽形態(tài)分化最早，開放最早，這一結(jié)果與大量研究表明的適度干旱促進柑橘花芽生理分化提前的結(jié)果[3]一致。對有葉花枝統(tǒng)計數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，中度干旱脅迫30 d組有葉花枝數(shù)比CK組有一定程度的增加，這一結(jié)果與暗柳橙在適度干旱條件下有葉花枝增多的情況相吻合[16]。干旱處理組坐果率沒有顯著下降，仍在溫州蜜柑正常栽培的坐果率范圍內(nèi)。這可能與溫州蜜柑是栽培適應性較強的品種有關(guān)，同時也說明中度干旱（土壤含水量8%～10%）脅迫30 d是一個促進溫州蜜柑花芽提前分化較優(yōu)的處理手段。

3.2 干旱脅迫對溫州蜜柑樹勢生理的影響

在不同土壤水分條件下對植株進行干旱脅迫，發(fā)現(xiàn)隨著干旱脅迫強度的增加和時間的延長，溫州蜜柑莖中葉綠素a 含量與CK 相比都有不同程度的下降。莖是水分和營養(yǎng)素的運輸器官，對水分缺失更為敏感，因而莖中葉綠素含量變化較大；葉片葉綠素a含量與CK相比呈上升趨勢，有可能因為植株在干旱條件下對水分的利用更充分[17]。肖玉明等[18]以土壤最大持水量40%對溫州蜜柑進行水分脅迫實驗，處理結(jié)果顯示，在10～40 d之間，隨著時間的積累，溫州蜜柑葉片葉綠素含量升高，40 d以后葉綠素各成分含量呈現(xiàn)下降趨勢，這也說明干旱處理時間不宜超過40 d，否則對樹勢和葉片有較強傷害。葉綠素a/b 的比值在一定程度上與捕光復合體（LHCⅡ）含量成反比。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比各處理組莖中葉綠素a/b 的比值在干旱早期上升，并最終維持在1.4 左右的水平，與CK 組相當，而在不同干旱條件下葉片葉綠素a/b的比值在干旱早中期皆高于對照組，后期穩(wěn)定于2.0 左右。這說明植株葉片捕光復合體在減少，通過減少色素和捕光復合體的含量來降低葉片對光能的捕獲，降低光合機構(gòu)受光氧化破壞的風險[19]。由此推斷，干旱脅迫30 d 對溫州蜜柑的光合生理不會產(chǎn)生嚴重負面影響?？扇苄蕴呛涂扇苄缘鞍踪|(zhì)含量上升，能增加越冬植株碳水化合物的積累，利于樹勢的維持，從而有助于植株花芽分化和滿足翌年植株開花對養(yǎng)分的需求。溫州蜜柑經(jīng)干旱處理后莖中可溶性糖和可溶性蛋白質(zhì)含量隨著干旱時間的延長而增加，這一結(jié)論與大量干旱抗性生理研究報道的結(jié)果[20-21]一致。葉片中可溶性糖和可溶性蛋白質(zhì)含量在干旱初期表現(xiàn)為不同程度的下降，可能是因為葉片作為光合器官，且所受的蒸騰拉力較強，葉片變化更為敏銳，但隨著干旱處理時間延長和強度增加，植株對干旱脅迫表現(xiàn)出一定的適應性，葉片可以通過內(nèi)部生理機制調(diào)節(jié)可溶性糖和可溶性蛋白質(zhì)含量，以維持中長期干旱條件下的生命活動?？偟膩碚f，除了重度干旱條件下莖中葉綠素含量出現(xiàn)顯著下降趨勢外，輕度和中度干旱處理對植株的生理代謝并未造成嚴重影響，植株能夠通過抗逆調(diào)節(jié)機制充分應對。

3.3 成花相關(guān)基因響應干旱對花芽的誘導

干旱脅迫可誘導柑橘花芽生理分化提前，成花基因FT和AP1轉(zhuǎn)錄水平表達量增加。FT的3 條不同轉(zhuǎn)錄本保守區(qū)域高度一致[7]，檢測FT相對表達量的總量顯示干旱脅迫30 d組莖中FT的表達量最高，這一結(jié)果與前人建議以柑橘莖中FT基因相對表達量作為衡量花芽分化程度的結(jié)論[8]一致。AP1是植物花芽分生組織建立的重要基因[9]，中度干旱脅迫30 d 時其表達量最高，表明該環(huán)境條件最有利于溫州蜜柑花芽分生組織的建立，從分子水平上進一步驗證了中度干旱脅迫30 d 是促進溫州蜜柑植株成花的合理選擇。

4 結(jié)論

本研究綜合比較了3個不同干旱脅迫強度與時間的溫州蜜柑處理組，發(fā)現(xiàn)中度干旱（土壤含水量8%～10%）30 d處理不會對植株樹勢造成不可逆的傷害，且早花現(xiàn)象最明顯；基因表達分析也表明莖中“成花素”FT相對表達量處于較高水平，花芽分生組織特有基因AP1相對表達量達到最大值，說明中度干旱脅迫30 d對溫州蜜柑花芽分生組織的形成具有較強的誘導效應。這一結(jié)果對溫州蜜柑設施栽培生產(chǎn)中應用控水調(diào)節(jié)開花具有較強的指導意義。