楊慧敏 周倩揚 李靜 武靖 徐娜 劉繼鑫 張蓓蓓 顏超 鄭葵陽 于倩

(徐州醫(yī)科大學病原生物學與免疫學教研室 江蘇省免疫與代謝重點實驗室，江蘇 徐州 221004)

膽管上皮細胞因先天性、遺傳性、寄生蟲性、腫瘤性等因素導致膽管反應(DR)分泌不同的細胞因子和相關蛋白，進而誘發(fā)一系列反應，包括細胞增生、自噬、衰老甚至癌變〔1～4〕。DR引發(fā)的疾病包括：膽道華支睪吸蟲病、原發(fā)性膽汁性肝硬化、膽道閉鎖等。膽管增生是肝膽疾病的早期表現。早期在受到外界刺激、損傷和其他因素作用時，膽管上皮細胞增生，其后發(fā)生膽管周圍纖維組織增生〔5～7〕，纖維組織增生又刺激膽管細胞形態(tài)發(fā)生肥大、化生、萎縮、消失等改變，很多在匯管區(qū)的增生和纖維化病灶逐漸連接起來，形成早期肝硬化的病變趨勢。因此，膽管損傷增生已成為免疫系統疾病研究的新熱點〔8〕。

哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是一種進化保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶，通過形成兩個多蛋白復合物mTORC1和mTORC2來調控細胞的生長、運動和代謝。mTORC1對營養(yǎng)物質敏感，mTORC2通過磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)和生長因子信號通路等參與細胞代謝調控〔6〕。文獻報道顯示mTORC1通過促進下游分子如核翻譯起始因子4E結合蛋白(4E-bp)1和p70核糖體S6激酶(p70S6K)的磷酸化啟動mRNA翻譯。mTORC2通過磷酸化一些環(huán)腺苷酸端依賴蛋白激酶(AGC)激酶〔如蛋白激酶B(Akt)和血清和糖皮質激素調節(jié)蛋白激酶(SGK)〕的c端疏水基序，對生長因子信號傳遞發(fā)生應答。PI3K/Akt/mTOR信號軸調控多種生理功能，包括細胞周期進展、轉錄、mRNA翻譯、分化、增生、凋亡、自噬、運動和代謝。然而mTOR信號通路在3，5-二乙氧基羰基-1,4-二氫-尿嘧啶(DDC)誘導的膽管損傷中的重要性尚未闡明〔8,9〕。Torin1是mTOR的抑制劑，Torin1通過耐雷帕霉素機制引起細胞周期阻滯，可分別抑制mTORC1 和mTORC2底物的磷酸化〔10〕。本研究通過Torin1抑制mTOR信號通路，擬闡明mTOR信號通路在DDC誘導的膽管損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物 SPF 級 C57BL/6J雌鼠，6～8周齡，體重20～30 g，購自北京斯貝福生物技術有限公司〔SCXX(京)2016-0002〕。飼養(yǎng)于徐州醫(yī)科大學實驗動物中心〔SYXK(蘇)2015-0030〕。自由攝食和飲水，每 2 d 更換一次飲水瓶，每4 d 更換一次墊料，室溫保持在22～25℃，相對濕度(55±10)%，每天光照 12 h 左右。所有實驗符合徐州醫(yī)科大學實驗動物倫理學要求(審批號：201801w003)。

1.2實驗試劑 Anti-Akt(華安生物技術有限公司，ETI609-47)，Anti-pSer473-Akt(華安生物技術有限公司，ETI607-73)，Anti-mTOR(華安生物技術有限公司，ETI608-5)，Anti-磷酸化(p)-mTOR(ABclnal，4000000094)，Anti-P65(Abcam，ab32536)，Anti-p-P65(bioworld，BS4137)，Anti-細胞角蛋白(CK19)(Abcam，ab7755)，Anti-Ki67(Cell Signaling Technology，#12202)，DDC (北京科澳協力飼料有限公司)，Torin1(MCE，HY-13003)，鼠二抗 (凱基，SA00001-1)，兔二抗 (凱基，SA00001-2)，小鼠二步法檢測試劑盒 (北京中杉金橋生物技術有限公司，PV-9002)，兔二步法檢測試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司，PV-9001)。

1.3實驗儀 正置顯微鏡(Olympus 公司，日本)，制冰機 (Scotsman公司，中國) 實時熒光定量PCR儀〔羅氏診斷產品(上海)有限公司，德國〕，石蠟切片機(Leica 公司，德國)，5804R 高速冷凍離心機(Eppendorf公司，德國)，-80℃ 超低溫冰箱(Thermo 公司，德國)，BMJ-B包埋機(常州市中威儀器有限公司，中國)。

1.4動物分組及實驗干預 實驗動物分組與模型的建立：Torin1按說明書溶于N-甲基吡咯烷酮(NMP)，儲存濃度為30 mg/ml。 24只雌性C57BL/6J小鼠隨機分為4組；NMP溶劑組(NMP組)、mTOR抑制劑Torin1處理組(Torin1組)、NMP+DDC組、Torin1+DDC組，每組6只。DDC組及Torin1+DDC組給予0.1% DDC飼料喂養(yǎng)3 w； NMP溶劑組及NMP+DDC組給予等量NMP。Torin1組及Torin1+DDC組均隔天腹腔注射Torin1(10 mg/kg)，連續(xù)3 w。此期間對照組每天腹腔注射 0.1% NMP。最后一次注射 Torin1 24 h后進行取材及相關檢測。

1.5Western印跡檢測mTOR、p-mTOR、Akt、p-Akt(Ser473)、p65、p-p65 蛋白表達 提取各組肝臟組織總蛋白，用二喹啉甲酸(BCA)法測濃度，每孔取40 μg蛋白樣品上樣進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，用Bio-Rad 標準轉膜裝置進行濕式轉膜，5%脫脂牛奶室溫封閉 2 h，一抗 4℃冰箱搖床孵育過夜，洗膜，二抗孵育室溫2 h，洗膜，加電化學發(fā)光(ECL)顯影液曝光顯影，用ImageLab軟件分析結果。

1.6蘇木素-伊紅(HE)及Masson染色觀察 小鼠肝臟組織于4%中性甲醛中固定約48 h后經脫水、石蠟包埋制成組織石蠟切片，HE及Masson 染色，于光學顯微鏡下觀察肝臟炎癥浸潤及纖維化情況，并進行半定量計分評價。

1.7免疫組化檢測CK19、Ki67等指標 微波處理(0.01 mmol/L 檸檬酸鹽緩沖液，pH6.0)石蠟切片(4 μm厚)，用5%牛血清蛋白(BSA)室溫封閉樣本組織30 min,使用單克隆小鼠抗CK19、Ki67抗體(稀釋 1∶100)，對照組滴加1% BSA，置于濕盒中4℃過夜。于第2天取出玻片，滴加預先按說明書稀釋的二抗，將玻片置于濕盒中，放于37℃溫箱靜置30 min。水洗后二氨基聯苯胺(DAB)顯色并終止，蘇木素復染后封片。于光學顯微鏡下觀察陽性分布情況，并用ImageJ定量分析。

1.8qRT-PCR檢測白細胞介素(IL)-6、 單核細胞趨化蛋白(MCP)-1、IL-10、精氨酸(Arg1)等指標 檢測IL-6、 MCP-1、IL-10、Arg1的mRNA表達水平。用Trizol法按說明書步驟提取各組肝組織的總RNA，將RNA逆轉錄成cDNA后進行PCR擴增反應。以β-actin作為內參，目的基因mRNA表達量用2-ΔΔCt計算，引物序列：β-actin正義鏈：5'-AACTCCATCATGAAGTGTGA-3'，反義鏈：5'-ACTCCTGCTTGCTGATCCAC-3'；IL-6正義鏈：5'-TCACAGAAGGAGTGGCTAAGGACC-3'，反義鏈：5'-ACGCACTAGGTTTGCCGAGTAGAT-3'；MCP-1正義鏈：5'-TTAAAAACCTGGATCGGAACCAA-3'，反義鏈：5'-GC-ATTAGCTTCAGATTTACGGGT-3'；IL-10正義鏈：5'-GGAAGACAATAACTGCACCCACT-3'，反義鏈：5'-CAACCCAAGTAACCCTTAAAGTCC-3'；Arg1正義鏈：5'-TGCTCACACTGACATCAACACTCC-3'，反義鏈：5'-TCTCTTCCATCACCTTGCCAATCC-3'。

1.9統計學方法 采用SPSS19.0和GraphPad Prism8軟件進行單因素方差分析、獨立樣本t檢驗。

2 結 果

2.1肝臟大體觀 與NMP組相比，NMP+DDC組小鼠肝臟明顯淤血腫大，Torin1+DDC組可以明顯減輕DDC引起的體重下降及肝臟淤血腫大程度。見圖1。

2.2各組ALT、ALP和TBIL水平 NMP+DDC組血清中ALT、ALP和TBIL表達較NMP組及Torin1組顯著升高(P<0.01)，Torin1+DCC組與NMP+DDC組比較可以一定程度降低ALT、ALP和TBIL的含量，但只有ALT差異具有統計學意義(P<0.05)。見表1。

2.3Western印跡檢測各組肝臟組織mTOR、Akt、p65的磷酸化水平 與NMP組和Torin1組相比，NMP+DDC組蛋白磷酸化水平明顯升高，而Torin1+DDC組磷酸化水平相比NMP+DDC組顯著降低。見表1、圖2。

圖2 各組肝臟組織mTOR、Akt、p65磷酸化表達

表1 各組ALT、ALP、TBIL、p-mTOR、p-Akt、p-p65水平比較

2.4HE和Masson染色結果 NMP組小鼠未見炎性細胞浸潤、膽管增生和肝臟膠原沉積，NMP+DDC組肝臟可見大量炎癥細胞浸潤、膽管增生和肝臟膠原纖維沉積。Torin1+DDC組較DDC組該現象顯著減輕。見圖3。

圖3 各組肝臟組織HE和Masson染色(箭頭所指為炎性浸潤和膠原沉積，×200)

2.5免疫組織化學法檢測各組小鼠肝臟組織膽管增生情況 與NMP組相比，NMP+DDC組CK19、Ki67表達顯著增加(P<0.05)；Torin1+DDC組較NMP+DDC組比較肝臟CK19、Ki67的表達顯著降低(P<0.05)。見圖4、表2。

2.6qRT-PCR結果顯示 與NMP組和Torin1組相比，NMP+DDC組IL-6、MCP-1和Arg1 mRNA的表達明顯升高，IL-10明顯下降，與NMP+DDC組相比，Torin1+DDC組小鼠肝組織中IL-6、MCP-1等促炎細胞因子的表達水平降低，IL-10、Arg1等抑炎因子水平升高，以上結果進一步證實，抑制mTOR信號通路，可以降低 DDC誘導小鼠肝臟炎癥，見圖4、表2。

圖4 免疫組化檢測各組肝組織中CK19、Ki67 蛋白表達(箭頭所指為表達的CK19和Ki67，×10)

表2 各組小鼠肝臟組織炎性相關基因表達水平比較

3 討 論

膽汁淤積性膽管損傷是一種由膽汁流動停滯或肝細胞和膽管細胞膽汁分泌轉運失敗或是由于肝外自由膽汁流動排泄通路受阻所引起的細胞損傷和炎癥反應，最終導致膽管增生〔11～13〕。目前已有的治療膽汁淤積性膽管損傷的藥物，主要機制是減輕膽管早期炎癥、促進細胞外基質的降解等。但為了進一步提高患者的生活質量、降低病死率，有必要對其發(fā)病機制進行更加深入的研究，尋找更有效的抗膽管損傷藥物〔14～16〕。

DDC是一種具有肝毒性的化學物質，通過給小鼠喂食含0.1% DDC的飼料3 w，可引起卟啉色素栓塞和膽管增生，伴洋蔥皮型導管周圍纖維化，小鼠可發(fā)展為硬化性膽管炎〔17,18〕。該模型極大地模擬了人類原發(fā)性膽汁性肝硬化(PBC)和原發(fā)性硬化性膽管炎(PSC)〔19〕的病理變化過程，是研究膽汁淤積性肝纖維化的常用模型。本研究在成功建立DDC誘導膽汁淤積性肝纖維化小鼠模型的基礎上，證實mTOR信號在此損傷過程中發(fā)揮重要作用。

本實驗說明DDC飲食后mTOR信號活化，mTOR抑制劑Torin1的使用可以抑制DDC誘導的mTOR通路活化；Torin1可以在一定程度上減輕DDC飲食小鼠肝臟炎性浸潤，膽管增生和膠原沉積程度。以上結果證明：mTOR在DDC誘導的膽管增生、膽管周圍炎癥形成中發(fā)揮著重要的作用，抑制該通路，可以顯著緩解以上病理損傷。

CK19不存在于成體肝細胞中而主要存在于肝祖細胞和膽管上皮細胞中，是最廣泛使用的膽管細胞和肝祖細胞標記物，也是膽管反應標志物〔20,21〕。Ki67是一種非組蛋白，表達于活躍分裂的細胞核中，是細胞增殖的標志物〔22〕。本研究結果說明Torin1可以減輕DDC 引起的膽管上皮增生，進一步證實mTOR信號在膽管損傷中的重要作用。