付娟 李娜 袁清敏

(1河南護理職業(yè)學院口腔醫(yī)學系，河南 安陽 455000；2安陽市口腔醫(yī)院修復科)

舌鱗狀細胞癌(TSCC)屬于頭頸部惡性腫瘤之一，其具有惡性程度高、高復發(fā)轉(zhuǎn)移率等病理特征，由于其具有較強的侵襲性導致患者預后不良，嚴重時還可能出現(xiàn)局部擴散及遠處轉(zhuǎn)移等〔1，2〕。因而積極探尋TSCC發(fā)生機制對早期診斷及改善患者預后均具有重要臨床意義。長鏈非編碼RNA(LncRNA)是一種長度超過200 nt的非編碼RNA分子，研究表明LncRNA表達異常與TSCC細胞增殖密切相關，并可能作為TSCC生物標志物及靶向治療靶點〔3〕。相關研究用芯片分析法獲得TSCC細胞癌組織和正常舌組織中差異表達的LncRNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LncRNA DLEU2在TSCC細胞中下調(diào)表達〔4〕。研究表明DLEU2在宮頸癌組織及細胞中下調(diào)表達，過表達DLEU2可抑制癌細胞增殖、遷移能力〔5〕。DLEU2還可通過調(diào)控miR-16-1信號通路而影響喉癌細胞遷移、侵襲能力〔6〕。但DLEU2對TSCC細胞生物行為的影響及其機制目前還不清楚。研究表明TSCC組織中微小RNA-30d-5p(miR-30d-5p)的表達量顯著高于癌旁組織，且miR-30d-5p的表達量與患者TNM分期、分化程度和頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關，抑制miR-30d-5p表達可有效抑制TSCC細胞增殖、遷移、侵襲能力〔7〕。通過生物信息學軟件預測到miR-30d-5p可能是DLEU2作用的靶基因，DLEU2是否可通過調(diào)控miR-30d-5p表達進而參與TSCC發(fā)生及發(fā)展過程尚未可知。因此本研究對TSCC組織中DLEU2的表達進行分析，構建DLEU2過表達載體上調(diào)TSCC Tca8113細胞中DLEU2的表達，探討其對TSCC細胞增殖及凋亡的影響，并分析其對miR-30d-5p的調(diào)控作用，以期為TSCC早期診斷及靶向治療奠定理論基礎。

1 資料與方法

1.1一般資料

1.1.1實驗對象 選取2015年3月至2016年4月安陽市口腔醫(yī)院修復科收治的TSCC患者26例為研究對象，所有患者經(jīng)手術病理證實為TSCC，男15例，女11例，年齡為60～70歲，平均為(65.32±3.26)歲，收集患者臨床病理資料，TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期11例，Ⅲ～Ⅳ期15例；分化程度：低分化10例，中分化6例，高分化10例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移10例，未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移16例。納入標準：所有患者術前未接受放療或化療；臨床資料完整。排除標準：合并其他惡性腫瘤；既往手術史者；患有嚴重代謝性疾病者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，所有患者及家屬知情且簽署同意書。于術中切取TSCC組織及其癌旁組織(>5 cm)，迅速放于液氮中，術后將組織標本存放于-80℃超低溫冰箱保存。

1.1.2材料與試劑 TSCC細胞Tca8113購自中國科學院細胞庫。RPMI1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶-EDTA、Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑均購自美國Invitrogen公司；胎牛血清、青霉素-鏈霉素混合溶液均購自美國Hyclone公司；RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒與實時熒光定量-聚合酶鏈反應(PCR)試劑盒均購自大連寶生物工程有限公司；miR-30d-5p mimics及其陰性對照序列均購自上海博亞生物技術有限公司；pcDNA3.1與si-DLEU2及其陰性對照均購自廣州銳博生物科技有限公司；四甲基偶氮唑藍(MTT)試劑購自美國Sigma公司；細胞凋亡檢測試劑盒購自華阜康生物科技股份有限公司；B細胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關x蛋白(Bax)、細胞周期蛋白(Cyclin)D1、p21抗體均購自美國CST公司；雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)購自美國Progema公司；細胞裂解液、二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度檢測試劑盒與電化學(ECL)發(fā)光液均購自中國碧云天生物技術研究所；辣根過氧化物酶(HRP)標記的IgG二抗購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及分組 將TSCC Tca8113細胞置于含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，放入含有5%CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)，當細胞融合度達80%左右時用胰蛋白酶消化細胞進行傳代培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細胞，使用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑盒進行轉(zhuǎn)染，根據(jù)轉(zhuǎn)染物不同對Tca8113細胞進行分組：pcDNA3.1組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1序列)；pcDNA3.1-DLEU2組(轉(zhuǎn)染DLEU2過表達載體)；si-DLEU2組(轉(zhuǎn)染DLEU小干擾RNA序列)；si-NC組(轉(zhuǎn)染DLEU陰性對照序列)；pcDNA3.1-DLEU2+miR-NC組(共轉(zhuǎn)染DLEU2過表達質(zhì)粒與miR-30d-5p陰性對照)；pcDNA3.1-DLEU2+miR-30d-5p組(共轉(zhuǎn)染DLEU2過表達質(zhì)粒與miR-30d-5p mimics)。轉(zhuǎn)染6 h后將培養(yǎng)基更換為含有10%胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基，放入含有5%CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.2.2qRT-PCR檢測DLEU2、miR-30d-5p的表達 取凍存TSCC組織及癌旁組織標本，剪碎后研磨，加入細胞裂解液，冰上裂解30 min，使用RNA提取試劑盒提取組織總RNA。細胞RNA提取方法：收集各組轉(zhuǎn)染后TSCC Tca8113細胞，用胰蛋白酶消化后加入細胞裂解液，冰上裂解30 min后提取細胞總RNA。核酸微量檢測儀檢測RNA濃度與純度，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA合成cDNA，以cDNA為模板進行qRT-PCR反應，反應條件為95℃ 5min循環(huán)1次，95℃ 30 s循環(huán)38次，60℃ 30 s循環(huán)38次，72℃ 30 s循環(huán)38次。每個樣品均設置3個復孔，采用2-ΔΔCt法計算DLEU2、miR-30d-5p的相對表達量。

1.2.3MTT比色法檢測細胞增殖 取轉(zhuǎn)染后各組Tca8113細胞，胰蛋白酶消化細胞，制備細胞懸浮液，調(diào)整細胞密度至3×105個/ml，以每孔1×105個細胞的密度接種于96孔板，分別于培養(yǎng)24 h、48 h、72 h時各孔分別加入濃度為5 mg/ml的MTT溶液20 μl，室溫孵育4 h，棄上清，分別加入150 μl DMSO溶液，振蕩10 min，放入酶標儀檢測各孔光密度值(OD)，檢測波長為490 nm，每組均設置3次重復。

1.2.4流式細胞儀檢測細胞凋亡率 收集各組對數(shù)生長期Tca8113細胞，預冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞，胰蛋白酶消化細胞，調(diào)整細胞密度為1×105個/ml，以每孔1×105個細胞的密度接種于6孔板，加入100 μl結(jié)合緩沖液重懸細胞，分別加入5 μl濃度為250 ng/L的膜聯(lián)蛋白(Annexin)V-異硫氰酸熒光素(FITC)與濃度為250 ng/L的碘化丙啶(PI)5 μl，室溫避光孵育20 min，加入400 μl結(jié)合緩沖液，于1 h內(nèi)在流式細胞儀上檢測細胞凋亡率。

1.2.5Western印跡檢測CyclinD1、p21、Bax、Bcl-2蛋白表達 取轉(zhuǎn)染后各組Tca8113細胞，預冷PBS洗滌細胞，加入100 μl細胞裂解液，4℃條件下裂解30 min，4℃條件下12 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min提取蛋白，BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白濃度，以每泳道30 μg總蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)反應，將分離的蛋白凝膠轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，分別加入蛋白一抗(1∶1 000)，置于搖床孵育24 h(溫度為4℃)，TBST洗膜后再與二抗(1∶2 000)室溫下孵育1 h，TBST洗膜，ECL顯影，用凝膠成像系統(tǒng)及Quantityone軟件檢測條帶灰度值。

1.2.6雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?利用在線數(shù)據(jù)庫預測DLEU2的3′UTR存在miR-30d-5p的結(jié)合位點，用PCR將DLEU2與miR-30d-5p的結(jié)合位點序列進行克隆，構建重組熒光素酶報告基因質(zhì)粒pGL3-DLEU2-3′UTR(WT-DLEU2)；將DLEU2中預測結(jié)合片段改變，構建pGL3-DLEU2-3′UTR-mut(MUT-DLEU2)突變體報告載體，用雙酶切電泳鑒定構建載體。參照Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑將WT-DLEU2、MUT-DLEU2報告載體與miR-30d-5p mimics或陰性對照共轉(zhuǎn)染至TSCC Tca8113細胞，轉(zhuǎn)染48 h后根據(jù)熒光素酶檢測試劑盒檢測細胞熒光素酶活性。

1.3統(tǒng)計學處理 采用SPSS19.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1DLEU2在TSCC組織和對應癌旁組織中的表達 DLEU2在TSCC組織中的表達水平(0.27±0.02)較癌旁組織(0.82±0.08)明顯降低(P<0.05)。

2.2過表達DLEU2對TSCC細胞Tca8113增殖的影響 與pcDNA3.1組相比，pcDNA3.1-DLEU2組Tca8113細胞中DLEU2表達水平明顯升高(P<0.05)，提示轉(zhuǎn)染效率良好。過表達DLEU2可顯著降低細胞增殖活性(P<0.05)，表明DLEU2過表達可明顯抑制TSCC細胞增殖。與pcDNA3.1組相比，pcDNA3.1-DLEU2組ca8113細胞中CyclinD1蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，p21蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)，表明DLEU2過表達可通過抑制CyclinD1蛋白表達及促進p21蛋白表達進而抑制TSCC細胞增殖。見圖1，表1。

圖1 Western印跡檢測過表達DLEU2對TSCC細胞Tca8113增殖蛋白表達的影響

表1 過表達DLEU2對TSCC細胞Tca8113增殖的影響

2.3過表達DLEU2對TSCC細胞Tca8113凋亡的影響 與pcDNA3.1組比較，過表達DLEU2后TSCC Tca8113細胞凋亡率明顯增加(P<0.05)，表明DLEU2過表達可促進TSCC細胞凋亡。pcDNA3.1-DLEU2組TSCC Tca8113細胞中Bax表達水平較pcDNA3.1組顯著升高(P<0.05)，而Bcl-2表達水平顯著降低(P<0.05)。表明DLEU2過表達可通過促進Bax表達及抑制Bcl-2表達進而促進TSCC細胞凋亡。見圖2、圖3、表2。

圖2 過表達DLEU2對TSCC細胞Tca8113凋亡的影響

圖3 Western印跡檢測過表達DLEU2對TSCC細胞Tca8113凋亡蛋白表達的影響

表2 過表達DLEU2對TSCC細胞Tca8113凋亡的影響

2.4DLEU2靶向、調(diào)控miR-30d-5p 生物信息學方法檢測得出miR-30d-5p可能是DLEU2的直接作用靶點，見圖4。通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灧治隹芍?，與miR-NC組比較，miR-30d-5p過表達可明顯降低WT-DLEU2野生型組細胞熒光素酶活性(P<0.05)；而MUT-DLEU2突變型組miR-30d-5p過表達后細胞熒光素酶活性與陰性對照相比無明顯變化(P>0.05)，見表3。表明DLEU2能夠結(jié)合miR-30d-5p而影響其活性。轉(zhuǎn)染si-DLEU2的Tca8113細胞中miR-30d-5p表達水平(1.17±0.10)顯著高于轉(zhuǎn)染si-NC(0.88±0.09，P<0.05)，而轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-DLEU2后miR-30d-5p的表達(0.53±0.05)明顯降低(P<0.05)。表明DLEU2可通過吸附miR-30d-5p而負向調(diào)節(jié)其表達。

圖4 DLEU2靶向miR-30d-5p

表3 雙熒光素酶報告實驗

2.5過表達miR-30d-5p能逆轉(zhuǎn)DLEU2對TSCC細胞Tca8113增殖的影響 共轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-DLEU2與miR-30d-5p mimics后Tca8113細胞增殖活性較pcDNA3.1-DLEU2+miR-NC組明顯升高(P<0.05)，促進CyclinD1表達(P<0.05)，明顯抑制p21表達(P<0.05)。表明過表達miR-30d-5p可逆轉(zhuǎn)DLEU2對TSCC細胞Tca8113增殖的抑制作用。見圖5，表4。

1～2：pcDNA3.1-DLEU2+miR-NC組、pcDNA3.1-DLEU2+miR-30d-5p組，下圖同圖5 過表達miR-30d-5p能逆轉(zhuǎn)DLEU2對TSCC細胞Tca8113增殖蛋白表達的影響

表4 過表達miR-30d-5p能逆轉(zhuǎn)DLEU2對TSCC細胞Tca8113增殖的影響

2.6過表達miR-30d-5p能逆轉(zhuǎn)DLEU2對TSCC細胞Tca8113凋亡的影響 相較于pcDNA3.1-DLEU2+miR-NC組，pcDNA3.1-DLEU2+miR-30d-5p組Tca8113細胞凋亡率顯著降低，Bax表達水平顯著降低(P<0.05)，而Bcl-2表達水平顯著升高(均P<0.05)，見表5、圖6。表明過表達miR-30d-5p可逆轉(zhuǎn)DLEU2對TSCC細胞Tca8113凋亡的促進作用。

圖6 過表達miR-30d-5p能逆轉(zhuǎn)DLEU2對TSCC細胞Tca8113凋亡蛋白表達的影響

表5 過表達miR-30d-5p能逆轉(zhuǎn)DLEU2對TSCC細胞Tca8113凋亡的影響

3 討 論

晚期TSCC患者生存率極低，由于舌組織富含大量血管及淋巴管導致患者常伴有局部擴散及轉(zhuǎn)移，嚴重降低患者生活質(zhì)量〔8〕。研究表明miRNA與TSCC發(fā)生及發(fā)展密切相關，但仍有部分miRNA對TSCC細胞惡性生物學行為的影響尚未可知〔9〕。LncRNA可作為miRNA的海綿分子競爭性吸附其與靶基因的結(jié)合位點進而間接調(diào)控靶基因表達從而調(diào)控腫瘤細胞增殖、分化等生物學進程〔10〕。

DLEU2在胰腺癌細胞中呈高表達，沉默DLEU2表達后可通過上調(diào)miR-455表達進而抑制胰腺癌細胞增殖及遷移〔11〕。DLEU2屬于miR-15a/16-1簇的宿主基因，其可通過調(diào)控miR-15a/16-1表達而調(diào)控轉(zhuǎn)錄核因子(NF)-κB信號通路進而抑制腫瘤發(fā)生及發(fā)展〔12〕。這可能由于腫瘤細胞惡性程度及組織部位不同導致DLEU2的表達及其作用效果不同。研究報道指出DLEU2缺失可導致慢性淋巴細胞性白血病及其他腫瘤發(fā)生〔13～15〕。本研究結(jié)果說明DLEU2在TSCC發(fā)生過程中可能發(fā)揮抑癌基因作用。研究報道指出細胞增殖周期中CyclinD1是調(diào)控細胞增殖信號的主要蛋白，其可激活CDK4/CDK6進而正向調(diào)控細胞周期，p21是CDK抑制因子并可抑制CDK4/CDK6激活進而抑制細胞增殖〔16〕。細胞凋亡過程中涉及多種基因調(diào)控，其中Bax、Bcl-2是調(diào)控細胞凋亡的主要基因，Bcl-2是抗凋亡基因，Bax是促凋亡基因，Bax表達水平升高可抑制Bcl-2的作用進而抑制細胞凋亡〔17〕。本研究結(jié)果提示DLEU2可能作為TSCC靶向治療的潛在靶點。miR-30d-5p在宮頸癌患者外泌體中呈高表達，并可作為臨床診斷宮頸癌的重要輔助標志物〔18〕。miR-30d-5p在非小細胞肺癌組織及細胞中均呈低表達，其可通過靶向抑制CCNE2基因表達進而減弱非小細胞肺癌細胞增殖活力〔19〕。分析原因可能為不同腫瘤組織或細胞中miR-30d-5p的表達不同。研究表明前列腺癌組織及細胞中miR-30d-5p的表達水平均顯著降低，上調(diào)miR-30d-5p表達可通過靶向調(diào)控NT5E表達進而抑制前列腺癌細胞增殖和遷移〔20〕。本研究結(jié)果提示DLEU2可通過抑制miR-30d-5p表達而促進TSCC細胞凋亡并抑制其增殖進而參與TSCC發(fā)生及發(fā)展過程。