金浩 余佳 王梓瑜 喬鷗 王軍 韓江 李兆連

(1云南省第一人民醫(yī)院，云南 昆明 650032；2昆明理工大學附屬醫(yī)院普通外科；3武漢大學人民醫(yī)院肝膽外科)

肝癌是世界上常見的癌癥之一，90%的肝細胞癌發(fā)生于肝硬化〔1〕。肝細胞癌主要采用外科(切除、肝移植)、局部(消融和栓塞治療)等治療方法〔2〕，但是肝癌復發(fā)率高，導致患者生存期短、生存質量較差，晚期肝癌患者通常采用中藥綜合治療，改善患者生存質量，延長生存期〔3〕。研究中藥抑癌的機制，成為基礎研究的熱點。

北沙參是傘形科珊瑚菜的干燥根，有養(yǎng)陰清肺、益胃生津之功效,主要用于肺熱，燥咳，勞嗽痰血，熱病津傷口渴〔4〕。研究發(fā)現(xiàn)北沙參提取物對肝癌、肺癌細胞有一定的抑制作用〔5〕，其可抑制肺癌細胞增殖侵襲能力〔6〕，在腫瘤臨床治療上有一定的應用價值。遺傳印記基因(PEG)10在大多數(shù)肝癌組織中特異性高表達，沉默PEG10表達可抑制肝癌細胞生長〔7〕。miR-34家族在細胞中參與調控細胞周期、誘導細胞凋亡、抑制細胞遷移等生物行為，其與腫瘤關系密切，且發(fā)現(xiàn)miR-34在肝癌細胞中下調表達〔8,9〕。miR34和PEG10在肝癌中都有很重要的作用，而北沙參提取物抑制肝癌的機制是否與前述兩者有關，尚未可知。

本研究以北沙參提取物(EEAR)處理肝癌細胞，研究EEAR對肝癌細胞增殖和凋亡的影響及miR-34a-5p和PEG10在此機制中的作用。

1 材料與方法

1.1材料 人肝癌細胞系MHCC97-H購自ATCC；杜爾貝科改良伊格爾培養(yǎng)液(DMEM)高糖培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)購自Gibco公司，抗PEG10抗體和抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體購自Abcam公司；胰蛋白酶Trypsin、四甲基偶氮唑藍(MTT)和二甲基亞砜(DMSO)購自Sigma-Aldrich公司；Total RNA提取試劑盒、Real-time PCR 試劑盒、反轉錄試劑盒(RT-PCR)購自美國Invitrogen公司；雙熒光素酶報告系統(tǒng)(Dual-Luciferase Reporter Assay System)購自美國Promega公司；流式法細胞凋亡檢測試劑盒、流式細胞儀購自美國BD公司，發(fā)光儀、全自動酶標儀及Real-time PCR儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2細胞培養(yǎng)和藥物處理 細胞培養(yǎng)：將MHCC97-H細胞接種于含10% FBS、1% 青-鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中，于濕度95%、37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，細胞培養(yǎng)至融合為一層時，Trysin消化，傳代。

藥物處理：北沙參提取物EEAR根據(jù)文獻〔4〕的方法進行提取，用水溶解后配成不同濃度。待細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期時，收集細胞，稀釋，以1×104個/孔接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后，加入50 μl不同濃度(300.000、150.000、75.000、37.500、18.750、9.375 μg/ml)的北沙參提取物EEAR，對照用PBS代替EEAR，培養(yǎng)48 h，進行后續(xù)實驗。

1.3細胞轉染 收集對數(shù)生長期的MHCC97-H細胞，消化稀釋，以每孔2×105個/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)至細胞融合為一層時進行轉染。先用無血清OptiMEM培養(yǎng)液稀釋脂質體Lipofectamine2000和各組載體，取等體積脂質體和載體混合，室溫孵育20 min，加入到培養(yǎng)好的細胞孔板中，培養(yǎng)6 h，換成高糖DMEM培養(yǎng)基，轉染48 h，收集細胞，進行實驗。

1.4Real-time PCR檢測mRNA的表達 收集EEAR處理或轉染48 h的各組MHCC97-H細胞，按照Total RNA提取試劑盒的說明書提取總RNA，然后按照反轉錄試劑盒說明書合成cDNA，以cDNA為模板按照Real-time PCR的說明書進行反應，反應程序為：95℃ 4 min；95℃ 30 s、58℃ 40 s、72℃ 35 s，40個循環(huán)；72℃ 10 min。miR-34a-5p 上游引物 5′-TGGCAGTGTCTTAGCTGGTTGT-3′，下游引物 5′-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3′；PEG10 上游引物 5′-AACAACAACAACAACTCCAAGC-3′，下游引物 5 ′-TCTGCACCTGGCTCTGCAG-3′;GAPDH 上游引物5′-ACAACAGCCTCAAGATCATCAG-3′，下游引物5′-GGTCCACCACTGACACGTTG-3′。運用Bio-Rad PCR檢測系統(tǒng)進行數(shù)據(jù)分析，經內參照GAPDH進行校正。

1.5MTT實驗測定細胞生存率 收集培養(yǎng)至對數(shù)生長期的MHCC97-H細胞，接種于95-6微孔板，培養(yǎng)24 h，然后分別加入50 μl終濃度為75 μg/ml的EEAR后，再繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，加入20 μl MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，小心棄去培養(yǎng)液，每孔加入150 μl DMSO，室溫振蕩5 min，酶標儀測定490 nm處的吸光度(A)值，生存率(%)=實驗組A均值/control組A均值×100%。找出半數(shù)抑制濃度最佳條件。

1.6流式細胞術測定細胞凋亡率 各組MHCC97-H細胞經EEAR處理或轉染后，接種于6孔板(2×104個細胞/孔)中，置于37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后棄去培養(yǎng)液，胰酶消化，收集細胞，按照膜聯(lián)歡蛋白V異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)試劑盒說明書進行操作，加入 200 μl結合緩沖液重懸細胞，再加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI混勻，室溫避光孵育20 min，用流式細胞儀測定細胞凋亡率。

1.7Western印跡檢測蛋白表達 收集轉染后經EEAR處理并培養(yǎng)48 h的各組MHCC97-H細胞，加入放射免疫沉淀裂解液(RIPA)，室溫裂解20 min，冰浴超聲破碎收集蛋白，測定蛋白濃度。進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉膜，脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入稀釋的一抗(抗PEG10 1∶500)，4℃孵育過夜，洗膜2次，加入1 000倍稀釋的二抗，室溫孵育2 h，以GAPDH為內參照，分析蛋白表達水平。

1.8統(tǒng)計學處理 采用SPSS21.0軟件進行方差分析、t檢驗。

2 結 果

2.1EEAR對肝癌細胞MHCC97-H中miR-34a-5p的表達及增殖、凋亡的影響 與Con組相比，EEAR組肝癌MHCC97-H細胞中miR-34a-5p表達量顯著上升(P<0.05)，MHCC97-H細胞在48 h和72 h細胞增殖活性顯著下降(P<0.05)，細胞凋亡率顯著上升(P<0.05)，見圖1、表1。

圖1 EEAR對細胞 MHCC97-H、凋亡的影響

表1 EEAR對細胞MHCC97-H增殖、凋亡的影響

2.2miR-34a-5p過表達對肝癌細胞MHCC97-H增殖、凋亡的影響 與miR-NC組相比，miR-34a-5p組肝癌MHCC97-H細胞中miR-34a-5p表達量顯著上升，MHCC97-H細胞在48 h和72 h細胞增殖活性顯著下降，細胞凋亡率顯著上升(P<0.05)，見表2、圖2。

圖2 miR-34-5p過表達對肝癌細胞MHCC-97H凋亡的影響

表2 miR-34-5p過表達對肝癌細胞MHCC-97H增殖、凋亡的影響

2.3抑制miR-34a-5p表達能逆轉EEAR對肝癌細胞MHCC97-H增殖、凋亡的影響 與anti-miR-NC組相比，anti-miR-34a-5p組miR-34a-5p表達量顯著下降(0.40±0.04 vs 0.13±0.02；t=18.112,P=0.000)。與Con組相比，EEAR組肝癌MHCC97-H細胞在48 h和72 h細胞增殖活性顯著下降，細胞凋亡率顯著上升(均P<0.05)；與anti-miR-NC+EEAR組相比，anti-miR-34a-5p+EEAR組肝癌MHCC97-H細胞在48 h和72 h細胞增殖活性顯著上升，細胞凋亡率顯著下降(均P<0.05)，見表3。

表3 抑制miR-34-5p表達能逆轉EEAR對肝癌細胞MHCC-97H增殖、凋亡的影響

2.4miR-34a-5p靶向PEG10 通過Targetscan軟件預測發(fā)現(xiàn)，PEG10的3′UTR序列中含有與miR-34a-5p互補的核苷酸序列，見圖3。與miR-NC組相比，miR-34a-5p組野生型WT-PEG10的螢火蟲熒光素酶相對活性顯著下降(P<0.05)，而突變型MUT-PEG10的螢火蟲螢光素酶相對活性沒有明顯變化。見表4。Western印跡結果發(fā)現(xiàn)，與miR-NC組(1.02±0.06)相比，miR-34a-5p組PEG10表達量顯著下降(0.38±0.03，P<0.05)；與anti-miR-NC組(1.01±0.08)相比，anti-miR-34a-5p組PEG10表達量顯著上升(1.92±0.12，P<0.05)，見圖4。

圖3 PEG10的3′UTR中含有與miR-34-5p互補的核苷酸序列

表4 雙熒光素酶報告實驗

1～4：miR-NC組，miR-34a-5p組，anti-miR-NC組，anti-miR-34a-5p組圖4 miR-34a-5p調控PEG10的表達

2.5EEAR對PEG10表達的影響 與Con組相比，EEAR組PEG10 mRNA和蛋白表達量均顯著下降(P<0.05)，見圖5、表5。

表5 EEAR對PEG10表達的影響

圖5 EEAR對PEG10表達的影響

2.6過表達PEG10可逆轉EEAR對肝癌細胞MHCC97-H增殖、凋亡的影響 與pcDNA3.1組相比，pcDNA3.1-PEG10組PEG10 mRNA表達量顯著上升(0.98±0.08 vs 2.13±0.22，t=14.738,P=0.000)。與Con組相比，EEAR組MHCC97-H細胞增殖活性在48 h和72 h均顯著下降，細胞凋亡率顯著上升(均P<0.05)；與pcDNA3.1+EEAR組相比，pcDNA3.1-PEG10+EEAR組MHCC97-H細胞增殖活性在48 h和72 h均顯著上升，細胞凋亡率顯著下降(P<0.05)，見表6。

表6 過表達PEG10能逆轉EEAR對細胞MHCC-97H增殖、凋亡的影響

3 討 論

肝癌的主要病因是HBV、HCV感染、黃曲霉毒素、藍藻毒素、吸煙、飲酒、肥胖、糖尿病和代謝綜合征等，術后5年復發(fā)率高，5年相對生存率僅為12.1%〔10〕。2015年我國肝癌發(fā)病約46.6萬人，死亡42.2萬人〔11〕。中藥是肝癌治療中的重要組成部分，中藥抑制肝癌細胞增殖、抗肝癌復發(fā)和轉移等機制研究也取得很大進展〔12〕。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，北沙參提取物具有抗腫瘤作用〔13,14〕。Cruz等〔15〕研究發(fā)現(xiàn)，北沙參根提取物通過增加p21和p27的誘導作用，抑制CDK4和細胞周期蛋白D1表達，從而抑制乳腺癌MCF-7細胞在G1期的增殖。Wu等〔16〕研究表明，北沙參多糖通過下調增殖細胞核抗原的表達，抑制肺癌細胞A549的遷移、增殖，并誘導細胞凋亡。北沙參也可以抑制肝癌細胞增殖，誘導細胞分化〔17〕。本研究發(fā)現(xiàn)，北沙參提取物EEAR能夠抑制肝癌MHCC-97H細胞增殖，促進癌細胞凋亡，證實了北沙參提取物EEAR的腫瘤抑制作用。

miR-34包括miR-34a、miR-34b、miR-34c等成員，是p53的直接靶基因，miR-34的異位表達通常誘導細胞凋亡、細胞周期停滯或衰老，并通過E2F3、SIRT1與p53形成正反饋環(huán)路，不斷增強與p53的作用〔18,19〕。Gao等〔20〕發(fā)現(xiàn)，miR-34a-5p在結直腸癌組織中表達下調，在p53野生型結腸癌細胞HCT116中過表達miR-34a-5p顯著抑制了細胞的生長、遷移、侵襲和轉移，而在敲除p53的細胞中則沒有這種作用，說明miR-34a-5p通過p53的誘導使癌細胞凋亡和細胞周期停滯來抑制結直腸癌的復發(fā)。Pu等〔21〕發(fā)現(xiàn)，miR-34a-5p通過靶向酪氨酸激酶CD117促進骨肉瘤(OS)對多種藥物的耐藥性。Li等〔22〕發(fā)現(xiàn)，miR-34a-5p在肝細胞癌組織中表達下調，過表達miR-34a-5p可抑制肝癌細胞的增殖，促進癌細胞凋亡，降低對順鉑的耐藥性，miR-34a-5p通過靶向AXL增強肝癌細胞對化療的敏感性。本研究結果表明，北沙參提取物EEAR能夠促進肝癌MHCC-97H細胞中miR-34a-5p表達，過表達miR-34a-5p可抑制MHCC-97H細胞增殖，促進細胞凋亡；抑制miR-34a-5p表達則可逆轉EEAR對MHCC-97H細胞增殖、凋亡的影響，說明EEAR通過促進miR-34a-5p表達進而抑制肝癌。

PEG10位于人類染色體7q21.3上，是一種與腫瘤的增殖、凋亡和轉移有關的癌基因，在多種腫瘤中呈現(xiàn)陽性表達〔23〕。Okabe等〔24〕通過全基因組cDNA微陣列發(fā)現(xiàn)，PEG10在大多數(shù)肝細胞癌組織中表達量顯著上調，抑制PEG10表達可抑制肝癌細胞生長，過表達PEG10則降低了細胞凋亡介質SIAH1介導的細胞死亡。本研究發(fā)現(xiàn)，EEAR能夠抑制MHCC97-H細胞中PEG10 mRNA和蛋白表達，過表達PEG10可逆轉EEAR對MHCC-97H細胞增殖、凋亡的影響。說明EEAR通過抑制MHCC97-H細胞中PEG10的表達抑制肝癌。

另外，通過Targetscan軟件預測發(fā)現(xiàn)，PEG10的3′UTR序列中含有與miR-34a-5p互補的核苷酸序列，說明兩者可能存在結合位點或調控關系。通過雙螢光素酶報告系統(tǒng)結果發(fā)現(xiàn)，miR-34-5p靶向負調控PEG10的表達，說明EEAR通過上調miR-34a-5p靶向抑制PEG10表達，進而抑制MHCC-97H細胞增殖，促進細胞凋亡。

本研究首次闡述了在肝癌MHCC97-H細胞中北沙參提取物EEAR通過miR-34a-5p抑制PEG10蛋白表達，從而抑制MHCC97-H細胞增殖，促進肝癌細胞凋亡。北沙參提取物對人肝癌具有潛在治療作用，本研究為人肝癌的中藥治療提供了新的思路，對中藥控制肝癌機制的基礎研究具有重要意義。