龔妙添 楊桂生 黃仕堯

宮頸癌(cervical cancer)是世界八大惡性腫瘤之一，在女性惡性腫瘤中發(fā)病率居第二位，僅次于乳腺癌，據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年宮頸癌新發(fā)病例約有53萬例，死亡病例達(dá)27萬[1]。宮頸癌的發(fā)病原因已逐漸明確，該病主要是由于高危型人乳頭狀瘤病毒(human papillomavirus，HPV)的持續(xù)感染，引起人體皮膚黏膜的鱗狀上皮增殖，形成上皮內(nèi)瘤[2]。根治性子宮切除術(shù)及輔助性放化療是宮頸癌的主要治療方式，可以在一定程度上提高宮頸癌患者的生存率，但多數(shù)轉(zhuǎn)移性宮頸癌患者預(yù)后較差，并且隨著放射治療劑量的累積，腫瘤對(duì)于放射的敏感性減弱，嚴(yán)重影響放療效果[3,4]。漢防己甲素(tetrandrine，Tet)是由中藥粉防己的塊根提取，又被稱為粉防己堿，是一種雙芐基異喹啉類生物堿，Tet為天然的非選擇性鈣離子通道阻滯劑，具有抗高血壓、抗炎和抗纖維化等作用[5]。已有研究表明，Tet具有抗癌作用，在結(jié)腸癌[6]、膀胱癌[7]和肝癌[8]等疾病中，Tet可以抑制癌細(xì)胞的增殖、遷移侵襲，促進(jìn)其凋亡，逆轉(zhuǎn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。為研究漢防己甲素在宮頸癌中的作用，本文通過體外培養(yǎng)宮頸癌Hela細(xì)胞的方法，探究漢防己甲素對(duì)宮頸癌細(xì)胞的增殖、凋亡和放射敏感性的影響，并探討其作用機(jī)制，旨在為宮頸癌的治療提供新理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人宮頸癌細(xì)胞株Hela購(gòu)自ATCC；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco；胎牛血清、青霉素、鏈霉素購(gòu)自杭州四季青公司；胰蛋白酶、噻唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、漢防己甲素購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、SDS-PAGE試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司；PVDF膜、RIPA裂解液、ECL發(fā)光液購(gòu)自北京Solarbio公司；吉姆薩(Giemsa)染液購(gòu)自Applichem公司；control siRNA和Chk1 siRNA由山東維真生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成；兔抗人Chk1多克隆抗體、兔抗人GAPDH多克隆抗體、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG購(gòu)自Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng):Hela細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基(含10% 胎牛血清、1% 青霉素和1% 鏈霉素)中，置于37℃、5% CO2及飽和濕度條件下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，至細(xì)胞融合度達(dá)到80% 左右時(shí)加入胰蛋白酶進(jìn)行細(xì)胞傳代。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞使用胰蛋白酶消化后重懸，以1×106個(gè)/孔接種至6孔板，按照Lipofectamine 2000說明書分別將control siRNA、Chk1 siRNA、pcDNA、pcDNA-Chk1轉(zhuǎn)染至Hela細(xì)胞，記為si-NC組、si-Chk1組、pcDNA組、pcDNA-Chk1組；選擇轉(zhuǎn)染pcDNA和pcDNA-Chk1的細(xì)胞，在培養(yǎng)液中加入Tet并調(diào)整終濃度為5.00 μg/ml，常規(guī)培養(yǎng)48 h。

1.2.3 分組:將Hela細(xì)胞隨機(jī)分為Con組、不同濃度Tet處理(0.01 μg/ml、0.10 μg/ml、1.00 μg/ml、5.00 μg/ml、10.00 μg/ml)組、Tet組。處理方法：Con組：不添加Tet；不同濃度Tet處理組：在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入Tet并調(diào)整終濃度分別為0.01 μg/ml、0.10 μg/ml、1.00 μg/ml、5.00 μg/ml、10.00 μg/ml；Tet組：以含Tet終濃度為5.00 μg/ml的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。每組6個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次。

1.3 qRT-PCR檢測(cè) 收集Tet(5.00 μg/ml)處理的Hela細(xì)胞，研磨充分后加入Trizol試劑提取總RNA，微量核酸測(cè)定儀檢測(cè)RNA純度和濃度。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用TaKaRa 熒光定量試劑盒，按照使用說明配制反應(yīng)體系，以GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行PCR擴(kuò)增，每個(gè)樣品重復(fù)3次，采用2-ΔΔCt法分析基因相對(duì)表達(dá)量。

1.4 Western blot檢測(cè) 加入RIPA裂解液裂解各組細(xì)胞，4℃，12 000 g離心15 min，收集蛋白上清液，BCA蛋白定量法檢測(cè)蛋白濃度。將蛋白樣品煮沸變性冷卻至室溫后，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜后，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。分別加入Chk1抗體(1∶500)和GAPDH抗體(1∶1 000)，4℃孵育過夜，TBST洗膜3次；加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶2 000)室溫孵育2 h，TBST洗膜3次。采用ECL化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)蛋白的表達(dá)，計(jì)算相對(duì)灰度值。每個(gè)蛋白樣品重復(fù)3次。

1.5 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖 在上述各組細(xì)胞培養(yǎng)至24 h、48 h、72 h時(shí)加入20 μl(5 g/L)的MTT溶液，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄掉培養(yǎng)液，每孔加入150 μl DMSO，置于搖床上室溫振蕩10 min，用酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm處的吸光度(A)，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值)×100%。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 在上述各組細(xì)胞培養(yǎng)至48 h后棄掉培養(yǎng)基，PBS洗滌，用無EDTA的胰酶消化細(xì)胞后，4℃、300 g離心10 min收集，加入PBS制成細(xì)胞懸液。按照Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說明書，加入5 μl FITC標(biāo)記的Annexin-V和5 μl PI輕輕混勻，室溫下避光孵育15 min，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.7 克隆形成實(shí)驗(yàn) 取上述各組細(xì)胞經(jīng)胰酶消化計(jì)數(shù)后，制成細(xì)胞懸液，按照射劑量將不同數(shù)目細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后每板分別以0、2、4、6、8 Gy的劑量進(jìn)行照射，繼續(xù)培養(yǎng)至出現(xiàn)肉眼可見的克隆形成，倒掉培養(yǎng)基，PBS洗滌，甲醇固定10 min，吉姆薩染色10 min，清洗染液，晾干后計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)>50個(gè)的克隆。使用GraphPad Prism 7軟件進(jìn)行單擊多靶模型擬合細(xì)胞存活曲線，計(jì)算平均致死劑量(D0)、準(zhǔn)閾劑量(Dq)、存活分?jǐn)?shù)(SF2)、放射增敏比(SER)。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度Tet對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞增殖抑制的影響 MTT法檢測(cè)結(jié)果，不同濃度Tet(0.01 μg/ml、0.10 μg/ml、1.00 μg/ml、5.00 μg/ml、10.00 μg/ml)處理后的Hela細(xì)胞，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞增殖抑制率逐漸升高，具有濃度依賴性。選取作用時(shí)間48 h，5.00 μg/ml的Tet濃度(抑制率約為50%)用作后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見表1。

表1 不同濃度漢防己甲素對(duì)Hela細(xì)胞增殖抑制的影響

2.2 Tet對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果，與Con組比較，Tet(5.00 μg/ml)處理后的宮頸癌Hela細(xì)胞其凋亡率顯著增加(P<0.05)。見圖1，表2。

2.3 Tet對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞放射敏感性的影響 以不同劑量(0、2、4、6、8Gy)X線照射各組細(xì)胞，與Con組比較，Tet組Hela細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)明顯降低(P<0.05)；單擊多靶模型參數(shù)，D0和Dq分別由Con組的2.621、1.297降低為Tet組的1.458和0.460，SER放射增敏比為1.798，表明，Tet可增強(qiáng)Hela細(xì)胞放射敏感性。見表3。

圖1 漢防己甲素對(duì)Hela細(xì)胞凋亡的影響

表2 漢防己甲素對(duì)Hela細(xì)胞凋亡的影響

表3 單擊多靶模型參數(shù)

2.4 Tet對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞中Chk1基因表達(dá)的影響 qRT-PCR和western blot檢測(cè)結(jié)果，與Con組比較，Tet組宮頸癌Hela細(xì)胞中Chk1基因在mRNA和蛋白水平的表達(dá)均顯著降低(P<0.05)。見圖2，表4。

圖2 漢防己甲素對(duì)Hela細(xì)胞中Chk1基因表達(dá)的影響

表4 漢防己甲素對(duì)Hela細(xì)胞中Chk1基因表達(dá)的影響

2.5 抑制Chk1表達(dá)對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞增殖、凋亡、放射敏感性的影響 轉(zhuǎn)染Chk1 siRNA至Hela細(xì)胞，與si-NC組比較，si-Chk1組的Chk1蛋白表達(dá)顯著降低，細(xì)胞的增殖抑制率與細(xì)胞凋亡率均顯著升高(P<0.05)；以不同劑量(0、2、4、6、8Gy)X線照射后，與si-NC組比較，si-Chk1組Hela細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)明顯降低(P<0.05)，SER放射增敏比為1.542，表明，抑制Chk1表達(dá)可增強(qiáng)Hela細(xì)胞放射敏感性。見圖3，表5、6。

圖3 Chk1蛋白相對(duì)表達(dá)量

組別D0 (Gy)Dq (Gy)NSF2kSERsi-NC組 2.5671.4311.7640.6580.390-si-Chk1組1.6650.7161.5370.4230.6011.542

表6 抑制Chk1表達(dá)對(duì)Hela細(xì)胞增殖、凋亡的影響

2.6 過表達(dá)Chk1逆轉(zhuǎn)了Tet對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞增殖、凋亡和放射敏感性的影響 以Tet(5.00 μg/ml)處理Hela細(xì)胞，與Con組相比，Tet組Chk1蛋白表達(dá)量顯著降低，Hela細(xì)胞的增殖抑制率和細(xì)胞凋亡率明顯升高，Tet組Hela細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)明顯降低(P<0.05)；轉(zhuǎn)染pcDNA-Chk1至Hela細(xì)胞，并經(jīng)過Tet(5.00 μg/ml)處理后，與Tet+pcDNA組比較，Tet+pcDNA-Chk1組Chk1蛋白表達(dá)量顯著升高，Hela細(xì)胞的增殖抑制率與細(xì)胞凋亡率均顯著降低，Tet+pcDNA-Chk1組Hela細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)明顯升高(P<0.05)。提示，過表達(dá)Chk1逆轉(zhuǎn)了Tet對(duì)Hela細(xì)胞增殖、凋亡和放射敏感性的影響。見表7、8，圖4。

表7 單擊多靶模型參數(shù)

表8 過表達(dá)Chk1逆轉(zhuǎn)了漢防己甲素對(duì)Hela細(xì)胞增殖、凋亡的影響

圖4 Chk1蛋白相對(duì)表達(dá)量

3 討論

宮頸癌的發(fā)生與環(huán)境衛(wèi)生、居住地域、受教育水平、HPV疫苗覆蓋率等多種因素有關(guān)[9,10]。全球85%的宮頸癌病例發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家，在我國(guó)城市地區(qū)，與農(nóng)村地區(qū)相比，宮頸癌發(fā)病率較高，死亡率較低，2013年我國(guó)宮頸癌新發(fā)病例為10萬，死亡病例為2.6萬，其發(fā)病率和死亡率隨年齡增長(zhǎng)而增加[11]。由于宮頸癌早期癥狀不明顯，多數(shù)患者就診時(shí)已處于局部晚期，對(duì)于局部晚期宮頸癌，放療是最主要的治療手段之一，但易復(fù)發(fā)且對(duì)放化療耐受[12]。因此，探究新的宮頸癌治療藥物及其作用機(jī)制具有重要意義。

Tet是從漢防己塊根中提取的有效活性成分，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，Tet具有一定的抗腫瘤作用，例如，在肺癌中，Tet能夠抑制肺癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其凋亡[13]。王君等[14]研究發(fā)現(xiàn)，最大非毒性劑量Tet聯(lián)合放療后可以去除放療導(dǎo)致的G2/M期阻滯，增加放療引起的鼻咽癌細(xì)胞的DNA斷裂及細(xì)胞凋亡。新近研究發(fā)現(xiàn)，Tet呈濃度和時(shí)間依賴性抑制乳腺癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)癌細(xì)胞G1期阻滯，降低Bcl-2的蛋白水平，促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，Tet能明顯抑制宮頸癌Hela細(xì)胞的增殖，且呈濃度依賴性；經(jīng)過5.00 μg/ml濃度的Tet處理的Hela細(xì)胞其凋亡率明顯升高，并且Hela細(xì)胞的放射敏感性顯著增強(qiáng)。

細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)激酶1(cell cycle checkpoint kinase 1，Chk1)是細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)的轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，Chk1在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程及細(xì)胞復(fù)制的調(diào)節(jié)過程中具有重要作用，Chk1抑制劑與DNA損傷試劑聯(lián)用可以增強(qiáng)抗腫瘤的療效[16,17]。有研究發(fā)現(xiàn)，Chk1在肺癌[18]、肝癌[19]的組織或細(xì)胞系中呈高表達(dá)。Zhou等[20]研究表明，在三陰性乳腺癌中，Chk1抑制劑可影響癌細(xì)胞的增殖，增加癌細(xì)胞的放射敏感性。在宮頸癌中，沉默Chk1的表達(dá)抑制了Hela細(xì)胞的增殖，并且能夠增強(qiáng)Hela細(xì)胞的放射敏感性[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，沉默Chk1基因后，Hela細(xì)胞中的Chk1蛋白表達(dá)量顯著降低，Hela細(xì)胞的增殖抑制率和凋亡率顯著升高，對(duì)放射照射的敏感性顯著增加，這與前人研究結(jié)果[21]一致。Tet(5.00 μg/ml)處理后Hela細(xì)胞中Chk1基因在mRNA和蛋白水平的表達(dá)均顯著降低；轉(zhuǎn)染pcDNA-Chk1至Hela細(xì)胞，并經(jīng)過Tet(5.00 μg/ml)處理后，Chk1蛋白表達(dá)量顯著升高，細(xì)胞增殖抑制率與細(xì)胞凋亡率均顯著降低，經(jīng)過放射照射Hela細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)明顯升高。表明過表達(dá)Chk1逆轉(zhuǎn)了Tet對(duì)Hela細(xì)胞增殖、凋亡和放射敏感性的影響。

綜上所述，Tet可抑制Hela細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)細(xì)胞放射敏感性，其機(jī)制可能與Tet抑制Chk1基因的表達(dá)有關(guān)。本研究探討了Tet對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖、凋亡和放射敏感性的影響及其分子機(jī)制，這為漢防己甲素治療宮頸癌提供了新的理論依據(jù)。