邵春芝 陳靜 王棟宇 王君

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是臨床上常見(jiàn)的危重癥，膿毒癥、創(chuàng)傷、電擊和吸入有害氣體等多種因素都可能導(dǎo)致ALI，其中膿毒癥是常見(jiàn)的因素[1]。研究證明，嚴(yán)重感染后，一些患者會(huì)發(fā)生某些反應(yīng)，包括促炎信號(hào)通路的激活和炎性介質(zhì)的過(guò)度表達(dá)，導(dǎo)致全身性炎性反應(yīng)，最終導(dǎo)致嚴(yán)重休克，多器官衰竭和死亡[2,3]。越來(lái)越多的證據(jù)表明，過(guò)度炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激是ALI的主要發(fā)病機(jī)制[4,5]。因此，開(kāi)發(fā)預(yù)防和(或)治療膿毒癥誘導(dǎo)的ALI的有效方法顯得尤為重要。肺泡上皮充當(dāng)保護(hù)肺部免受吸入物質(zhì)影響的屏障。有研究顯示，肺泡上皮細(xì)胞的異常凋亡與ALI密切相關(guān)[6]。文獻(xiàn)指出，環(huán)氧化酶-2(COX-2)是前列腺素物質(zhì)合成過(guò)程中的一種限速酶，參與多種炎癥性疾病，其中包括AIL[7]。因此，有效抑制肺泡上皮細(xì)胞凋亡、炎性反應(yīng)及氧化應(yīng)激對(duì)ALI傷的治療至關(guān)重要。麻黃具有宣肺平喘、發(fā)汗解表等功效，常用于治療咳喘病，麻黃堿是麻黃的主要成分。研究顯示，麻黃堿能夠抑制氣道炎癥、氣道重塑以及支氣管哮喘等[8,9]。目前關(guān)于麻黃堿對(duì)膿毒癥性ALI的影響筆者所見(jiàn)尚未報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)探討麻黃堿對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞凋亡、炎癥以及COX-2基因表達(dá)的影響，以期為麻黃堿用于ALI的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人肺泡上皮細(xì)胞A549(中國(guó)科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心)；鹽酸麻黃堿(中國(guó)食品藥品檢定研究院)；RPMI-1640培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)；胎牛血清(杭州四季青生物科技有限公司)；胰蛋白酶(美國(guó)Abcam公司)；CCK-8試劑(日本同仁化學(xué)研究所)；TNF-α、IL-1β和IL-6 ELISA檢測(cè)試劑盒(深圳達(dá)科為生物技術(shù)有限公司)；Trizol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green PCR Master Mix試劑盒(日本TaKaRa公司)；ROS、MDA和SOD檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9和COX-2單抗(美國(guó)Affinity Biosciences公司)；辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的IgG二抗(美國(guó)Santa Cruz公司)；AnnexinⅤ-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(賽默飛世爾科技有限公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 肺泡上皮細(xì)胞A549復(fù)蘇后培養(yǎng)在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，放置在5% CO2、飽和濕度、37℃培養(yǎng)箱中，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，每隔1 d更換1次新的培養(yǎng)液，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)匯合至80%時(shí)進(jìn)行傳代，取對(duì)數(shù)增殖期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞分組和處理 對(duì)數(shù)期的肺泡上皮細(xì)胞A549以1×105個(gè)/孔接種至24孔板中，于37℃培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)融合至50%時(shí)加入10 μg/ml LPS進(jìn)行干預(yù)，設(shè)10 μg/ml LPS干預(yù)的A549細(xì)胞為L(zhǎng)PS組，10 μg/ml LPS 和800 μg/ml麻黃堿干預(yù)的A549細(xì)胞為Ephedrine組，不做任何處理的A549細(xì)胞為對(duì)照Control組，3組細(xì)胞作用24 h，收集細(xì)胞及細(xì)胞上清液，進(jìn)行后續(xù)相關(guān)指標(biāo)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。

1.4 qRT-PCR檢測(cè) 在24孔板中接種肺泡上皮細(xì)胞A549，每孔接種1×106個(gè)/孔，按照1.3分組處理24 h后，以胰酶消化并收集細(xì)胞，采用Trizol法提取抽提細(xì)胞總RNA，將RNA逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，采用cDNA作為模板，β-actin作為內(nèi)參，在熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束獲得數(shù)據(jù)以2-ΔΔCt法分析基因的相對(duì)表達(dá)情況。所有引物。COX-2 F 5’-GTCTGATGATGTATGCCACAATCTG-3’；R 5’-GATGCCAGTGATAGAGGGTGTTAAA-3’。β-actin F 5’-AACCCTAAGGCCAACCGTGAAAAG-3’；R 5’-TCATGAGGTAGTCTGTCAGGT-3’。

1.5 CCK-8實(shí)驗(yàn) 對(duì)數(shù)期的肺泡上皮細(xì)胞A549種植到96孔板中，種植密度為1×105個(gè)/孔，于37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，以1.3分組處理，在處理24、48、72 h時(shí)于每孔中避光添加10 μl MTT溶液，37℃培養(yǎng)箱孵育4 h，棄去細(xì)胞上清液，于每孔中添加150 μl二甲基亞砜溶液，充分混勻，振蕩反應(yīng)至結(jié)晶沉淀完全溶解，放入全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定每孔吸光度值(OD值)，波長(zhǎng)設(shè)置為490 nm。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) 收集對(duì)數(shù)期的肺泡上皮細(xì)胞A549，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/ml，于6孔板中進(jìn)行種植，每孔2 ml，以1.3分組處理，于常規(guī)培養(yǎng)箱連續(xù)培養(yǎng)24 h，棄細(xì)胞上清液，收集細(xì)胞，加入500 μl Binding Buffer重懸細(xì)胞，添加5 μl AnnexinⅤ-FITC混勻，再加入5 μl PI，混勻后室溫避光孵育10～15 min，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.7 ELISA檢測(cè) 肺泡上皮細(xì)胞A549分組處理后，收集細(xì)胞上清液，采用ELISA試劑盒分別檢測(cè)3組細(xì)胞上清中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量，具體步驟嚴(yán)格按照ELISA試劑盒使用說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.8 SOD活力和MDA含量檢測(cè) 肺泡上皮細(xì)胞A549分組處理后，收集細(xì)胞上清液，采用硫代巴比妥酸法測(cè)定MDA的含量，采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定SOD的活力，具體方法見(jiàn)MDA和SOD檢測(cè)試劑盒使用說(shuō)明書。

1.9 ROS水平檢測(cè) 收集處理后的3組肺泡上皮細(xì)胞A549，與5 μmol/L的DCFH-DA工作液混勻，放置在37℃培養(yǎng)箱孵育10 min，參照ROS檢測(cè)試劑盒說(shuō)明測(cè)定ROS水平。

1.10 Western blot實(shí)驗(yàn) 使用RIPA細(xì)胞裂解液抽提細(xì)胞中的總蛋白，經(jīng)BCA法對(duì)蛋白濃度進(jìn)行定量，向蛋白樣品中加入5×上樣緩沖液，金屬浴致蛋白質(zhì)變性。制備SDS-PAGE凝膠，電泳分離蛋白，隨后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，放置在5%脫脂奶粉中室溫封阻1 h，孵育相應(yīng)一抗(Cleaved Caspase-3一抗1∶500稀釋，Cleaved Caspase-9一抗1∶500稀釋，COX-2一抗1∶800稀釋)，4℃過(guò)夜，次日加入二抗(1∶2 00稀釋)，室溫孵育2 h，加入ECL發(fā)光試劑進(jìn)行顯色，于暗室中曝光、采集蛋白條帶圖像，以β-actin作內(nèi)參，分析目的蛋白灰度值，計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 麻黃堿對(duì)LPS誘導(dǎo)的A549細(xì)胞增殖能力的影響 與Control組相比，LPS組肺泡上皮細(xì)胞A549在24、48和72 h時(shí)增殖能力均明顯降低(P<0.05)；與LPS組相比，Ephedrine組A549細(xì)胞在各時(shí)間點(diǎn)增殖能力均明顯升高(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 3組肺泡上皮細(xì)胞A549在24、48和72 h時(shí)OD值比較

2.2 麻黃堿對(duì)LPS誘導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡能力的影響 與Control組相比，LPS組肺泡上皮細(xì)胞A549凋亡率明顯升高(P<0.05)；與LPS組相比，Ephedrine組A549細(xì)胞凋亡率明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)表2，圖1。

表2 3組肺泡上皮細(xì)胞凋亡率比較

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組肺泡上皮細(xì)胞A549的凋亡率

2.3 麻黃堿對(duì)LPS誘導(dǎo)的凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與Control組相比，LPS組肺泡上皮細(xì)胞A549中Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9的表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)；與LPS組相比，Ephedrine組A549細(xì)胞中Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9的表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)。見(jiàn)表3，圖2。

表3 3組肺泡上皮細(xì)胞中Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9表達(dá)比較

圖2 Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9的表達(dá)

2.4 麻黃堿對(duì)LPS誘導(dǎo)的炎性因子分泌的影響 與Control組相比，LPS組肺泡上皮細(xì)胞A549上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量明顯增多(P<0.05)；與LPS組相比，Ephedrine組A549細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6含量明顯減少(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 3組肺泡上皮細(xì)胞上清中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量比較

2.5 麻黃堿對(duì)LPS誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激的影響 與Control組相比，LPS組肺泡上皮細(xì)胞A549中MDA含量增多(P<0.05)，ROS水平升高(P<0.05)，SOD活性降低(P<0.05)；與LPS組相比，Ephedrine組A549細(xì)胞中MDA含量減少(P<0.05)，ROS水平降低(P<0.05)，SOD活性升高(P<0.05)。見(jiàn)表5。

表5 3組肺泡上皮細(xì)胞中MDA含量、ROS水平和SOD活性比較

2.6 麻黃堿對(duì)LPS誘導(dǎo)的COX-2表達(dá)的影響 與Control組相比，LPS組肺泡上皮細(xì)胞A549中COX-2 mRNA和蛋白表達(dá)均明顯升高(P<0.05)；與LPS組相比，Ephedrine組A549細(xì)胞中COX-2 mRNA和蛋白表達(dá)均明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)表6，圖3。

表6 3組肺泡上皮細(xì)胞中COX-2 mRNA和蛋白表達(dá)比較

圖3 Western blot檢測(cè)COX-2蛋白表達(dá)

3 討論

ALI的特征是富含蛋白質(zhì)的水腫液在肺泡隔室中積聚。ALI的機(jī)制因病因而異，例如血管通透性增加，細(xì)胞因子過(guò)度生產(chǎn)，白細(xì)胞募集和表面活性劑功能障礙，導(dǎo)致間質(zhì)和肺泡肺水腫、肺泡塌陷和低氧血癥[10]。上皮和內(nèi)皮細(xì)胞的損傷在ALI的發(fā)展中起著重要作用。上皮的完整性和通透性通過(guò)細(xì)胞層之間的緊密連接而得以緊密保持，這允許細(xì)胞與細(xì)胞之間的通訊，但阻止吸入的有害物質(zhì)的進(jìn)入[11]。

LPS是革蘭陰性細(xì)菌的主要成分，是感染疾病中的主要促炎反應(yīng)因子之一，可導(dǎo)致體內(nèi)外的過(guò)度炎性反應(yīng)[12]。據(jù)報(bào)道LPS是引起炎性反應(yīng)的主要因素之一，LPS誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞損傷模型已被廣泛用于膿毒癥相關(guān)的ALI的機(jī)制研究[13,14]。在ALI模型中，LPS顯著增加了包括TNF-α，IL-1β和IL-6在內(nèi)的炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，這已被證明與ALI的發(fā)展有關(guān)[15]。

在本研究中，根據(jù)Zhu等[16]的研究，通過(guò)用10 μg/ml的LPS刺激肺泡上皮細(xì)胞A549創(chuàng)建了類似的膿毒癥性ALI細(xì)胞模型，結(jié)果顯示，LPS誘導(dǎo)的A549細(xì)胞增殖活力明顯降低，凋亡率明顯升高，凋亡相關(guān)蛋白Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9的表達(dá)明顯上調(diào)，炎性因子TNF-α，IL-1β和IL-6的分泌增多，該發(fā)現(xiàn)與先前的研究[16]一致，表明成功建立了LPS誘發(fā)的ALI細(xì)胞模型。

麻黃堿是從傳統(tǒng)中藥麻黃的主要活性成分，具有廣泛的抗氧化和抗炎的作用[17]。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過(guò)800 μg/ml麻黃堿干預(yù)LPS誘導(dǎo)的A549細(xì)胞，結(jié)果顯示，細(xì)胞增殖活力升高，凋亡率下降，Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9蛋白表達(dá)下調(diào)，TNF-α，IL-1β和IL-6的含量減少，表明麻黃堿能夠逆轉(zhuǎn)LPS誘導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡及炎性反應(yīng)，對(duì)LPS誘導(dǎo)的A549細(xì)胞具有保護(hù)作用。

此外，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LPS誘導(dǎo)的A549細(xì)胞中MDA含量增多，ROS水平增加，而SOD活性降低，而麻黃堿能夠逆轉(zhuǎn)LPS誘導(dǎo)的A549細(xì)胞中ROS水平、MDA含量和SOD活性。研究顯示，膿毒癥誘導(dǎo)的ALI中ROS水平升高，過(guò)量的ROS又可促進(jìn)局部炎性反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致肺組織的進(jìn)一步損傷[18]。

SOD是機(jī)體內(nèi)非常重要的抗氧化酶，能夠有效清除機(jī)體內(nèi)的氧自由基，增加抗氧化能力。MDA是一種過(guò)氧化產(chǎn)物，其含量的高低間接反應(yīng)細(xì)胞損傷程度。ALI中肺組織中SOD活力降低，MDA含量上升[19]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與以往的研究[18,19]一致，提示麻黃堿能夠通過(guò)抑制氧化應(yīng)激對(duì)LPS誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞A549起保護(hù)作用。研究表明，在正常肺組織中COX-2基因的表達(dá)量較低，而在ALI的肺組織中COX-2的表達(dá)急劇上升，COX-2基因參與ALI發(fā)病過(guò)程[20]。有研究顯示，在ALI中，抑制COX-2的表達(dá)可有效減輕肺組織的炎性反應(yīng)[21]。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，LPS能夠上調(diào)A549細(xì)胞中COX-2的表達(dá)，麻黃堿能夠下調(diào)LPS誘導(dǎo)的COX-2的表達(dá)。這提示麻黃素對(duì)LPS處理的A549細(xì)胞炎性反應(yīng)的抑制作用可能通過(guò)下調(diào)COX-2的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)，然而該推測(cè)仍需后續(xù)進(jìn)行驗(yàn)證。

綜上所述，麻黃堿能夠抑制LPS誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞A549凋亡、炎性反應(yīng)及氧化應(yīng)激，并下調(diào)COX-2基因的表達(dá)，為麻黃堿用于ALI的臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。