閆娟 宋玉霞 薛穎 金立娟 閆閃閃

卵巢癌在女性生殖系統(tǒng)中的發(fā)病率僅次于宮頸癌和宮體癌[1]，據(jù)統(tǒng)計(jì)，2016年美國(guó)卵巢癌新增病例人數(shù)為22 440例，死亡人數(shù)為14 080例，卵巢癌目前己成為致死率最高的婦科惡性腫瘤[2]，隨著徹底腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)(R0)+鉑類(lèi)為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療這一治療模式的推廣，卵巢癌的療效獲得了明顯改善，但5年生存率仍低于45%[3]。早期診斷困難及化療耐藥是影響目前卵巢癌臨床療效和預(yù)后的主要原因[4]。雖然多年來(lái)通過(guò)眾多學(xué)者的努力工作，在原癌基因、抑癌基因和相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路研究等方面做出了不懈的努力，取得了不少成果，但是卵巢癌的發(fā)生及化療耐藥的產(chǎn)生機(jī)制仍未完全闡明。近些年一類(lèi)新的非蛋白質(zhì)編碼microRNAs(miRNAs)的出現(xiàn)，為卵巢癌的研究提供了新思路[5]。miR-210莖環(huán)結(jié)構(gòu)序列位于11p15.5,并且參與腫瘤細(xì)胞的增殖、血管生成、侵襲和凋亡[6]。miR-210 在許多腫瘤中表達(dá),有學(xué)者通過(guò)基因芯片技術(shù)證明miR-210在卵巢癌組織及細(xì)胞系中表達(dá)[7]。但是目前miR-210參與卵巢上皮性癌生物學(xué)行為的具體分子機(jī)制仍不清楚，我們利用實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)了卵巢上皮性癌組織、正常卵巢組織中，以及卵巢上皮性癌細(xì)胞系HO-8910/HO-8910PM、COC1、OVCAR3及SKOV3/SKOV3-TR30/SKOV3-DDP中miR-210的表達(dá)，分析miR-210與卵巢癌臨床病理特征及患者預(yù)后的關(guān)系，應(yīng)用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)miR-210的靶基因，分析其參與的信號(hào)通路，為研究miR-210與卵巢上皮性癌生物學(xué)行為的關(guān)系提供研究基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2012年1月至2015年1月在石家莊市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科行手術(shù)切除的卵巢癌組織共56例，并選取同期因子宮脫垂于我科行全子宮加雙附件切除及術(shù)前BRCA基因檢測(cè)突變陽(yáng)性行預(yù)防性雙附件切除者的卵巢組織33例。納入研究的卵巢癌患者年齡35～75歲，平均年齡(50±12.3)歲；其中<50歲19例，≥50歲37例。根據(jù)FIGO分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行區(qū)分：Ⅰ期9例，Ⅱ期10例，Ⅲ期29例，Ⅳ期8例；漿液性42例，粘液性5例，子宮內(nèi)膜樣5例，透明細(xì)胞癌3例，其他類(lèi)型1例。正常卵巢組患者年齡39～70歲，平均年齡(52±11.6)歲。切除組織于離體30 min內(nèi)留存，經(jīng)液氮冷凍處理后保存于-80℃冰箱內(nèi)。隨訪方式主要為電話隨訪和門(mén)診復(fù)查，隨訪截止日期為2020年1月。隨訪截止時(shí)仍存活的患者、隨訪過(guò)程中失訪的患者均視為截尾數(shù)據(jù)，其生存期為確診至末次隨訪之間的時(shí)間；隨訪過(guò)程中已死亡的患者視為完全數(shù)據(jù)，其生存期為確診至死亡之間的時(shí)間。本研究得到本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，且所有納入研究的患者簽署知情同意書(shū)，并自愿參與本研究。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)過(guò)病理確診未卵巢癌；②術(shù)前未經(jīng)過(guò)放化療等抗腫瘤治療；③臨床資料及隨訪記錄完整。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他系統(tǒng)腫瘤；②合并嚴(yán)重急慢性感染性疾??；③合并心、肝、腎等實(shí)質(zhì)性臟器嚴(yán)重功能不全。

1.3 細(xì)胞系 高轉(zhuǎn)移人卵巢癌細(xì)胞系HO-8910PM、人卵巢癌細(xì)胞系HO-8910、人卵巢癌細(xì)胞系OVCAR3及人卵巢癌細(xì)胞系COC1由河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院河北省腫瘤研究所提供；人卵巢癌細(xì)胞系SKOV3及其紫杉醇耐藥細(xì)胞亞系SKOV3-TR30、順鉑耐藥細(xì)胞亞系SKOV3/DDP購(gòu)自浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院；人正常卵巢細(xì)胞系IOSE386，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)國(guó)家衛(wèi)健委細(xì)胞生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.4 主要試劑 細(xì)胞培養(yǎng)基RPMI 1640gou購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，McCoy’s 5A購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司； M199購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，胎牛血清購(gòu)自杭州四季青公司，Trizol購(gòu)自美國(guó) Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific公司，熒光定量 PCR檢驗(yàn)試劑盒購(gòu)自珠海莫納生物科技公司，PCR引物由上海生工生物有限公司合成，qRT-PCR 采用ABI Step One Plus PCR 儀(美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)。

1.5 方法

1.5.1 細(xì)胞培養(yǎng)： HO-8910、HO-8910PM、COC1及 OVCAR3細(xì)胞系，采用RPMI 1640培養(yǎng)基；SKOV3、SKOV3-TR30及SKOV3/DDP細(xì)胞系，采用McCoy’s 5A培養(yǎng)基；培養(yǎng)基中加入10%胎牛血清。IOSE386細(xì)胞系采用含10%胎牛血清的M199培養(yǎng)。所有耐藥細(xì)胞系均按培養(yǎng)要求加入規(guī)定濃度化療藥物。于37℃、5%CO2、飽和濕度的恒溫密閉培養(yǎng)箱內(nèi)傳代、培養(yǎng)。

1.5.2 RNA提取及realtime-PCR：按照Trizol說(shuō)明書(shū)對(duì)各組組織及細(xì)胞行總RNA抽提，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，miR-210上游引物：5’-GGAGATCTGACCAGGTCATTT

GCATAC-3’；下游引物：5’-GGGAATTCGATATGACCA

CACCTGTG-3’；U6：上游引物：5’-GCTTCGGCAOCACA

TATACTAAAAT-3’;下游引物：5’-CGCTTCACGAATTT

GCGTCAT-3’， 應(yīng)用按以下程序進(jìn)行擴(kuò)增：預(yù)95℃變性5 min，95℃10 s；60℃ 20 s；72℃ 20 s；78℃ 20 s，共40個(gè)循環(huán)。將內(nèi)參引物U6與目的基因引物加入同一反應(yīng)體系，反應(yīng)條件相同，每一樣本PCR反應(yīng)重復(fù)3次。數(shù)據(jù)采用2-△△Ct值進(jìn)行分析。

1.5.3 靶基因預(yù)測(cè)及信號(hào)通路分析：利用生物信息學(xué)分析軟件 Target Scan(http:∥ targetscan.org)、miRanda (http:∥www.microrna.org / miranda_new.html) 和 miR Base Targets (http:∥microna．sanger.ac.uk /targets /v4 /) 綜合分析， 選取3種軟件的共同結(jié)果， 作為表達(dá)差異 miRNA 的可能靶基因，并通過(guò)miRWalk數(shù)據(jù)庫(kù)中的KEGG pathway(http:// www.ma.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk/)功能聚類(lèi)分析miR-210調(diào)控的靶基因及參與的與腫瘤相關(guān)信號(hào)通路[8]。

2 結(jié)果

2.1 miR-210在2組組織中的表達(dá) miR-210在卵巢癌組織中的相對(duì)表達(dá)量為1.539±0.363，顯著高于正常卵巢組織中miR-210的相對(duì)表達(dá)量(1.017±0.289)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.438,P<0.001)。見(jiàn)圖1。

圖1 miR-210在卵巢癌及正常卵巢組織中的表達(dá)情況

2.2 miR-210在卵巢癌細(xì)胞系中的表達(dá) 在卵巢癌細(xì)胞系及正常卵巢上皮細(xì)胞IOSE386,miR-210存在差異表達(dá)，與人正常卵巢細(xì)胞系IOSE386(1.000±0.043)相比，miR-210在卵巢癌細(xì)胞系HO-8910/HO-8910PM、COC1、OVCAR3、SKOV3/SKOV3-TR30/SKOV3-DDP均呈上調(diào)表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=12.64，P<0.001)。HO-8910 與HO-8910 PM 相比(t=7.328,P=0.0004)，SKOV3 與SKOV3-TR30 相比(t=9.869,P=0.0001)，SKOV3與SKOV-3/DDP相比(t=6.6376，P=0.0006)，miR-210的表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。

表1 miR-210在卵巢癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況

2.3 miR-210的表達(dá)與卵巢癌臨床病理特征的關(guān)系 將卵巢癌組織中的miR-210表達(dá)量按照其中位數(shù)分為高表達(dá)(n=31)和低表達(dá)(n=25)，并對(duì)表達(dá)水平和卵巢癌患者的臨床病理特征進(jìn)行相關(guān)性分析。研究結(jié)果表明，miR-210表達(dá)與年齡及病理類(lèi)型無(wú)關(guān)(P>0.05)，miR-210與FIGO分期、分化類(lèi)型存在相關(guān)(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 miR-210表達(dá)與卵巢癌臨床病理特征的關(guān)系 例(%)

2.4 miR-210的表達(dá)與卵巢癌患者預(yù)后的關(guān)系 miR-210低表達(dá)組患者術(shù)后的3年生存率為80.0%、5年生存率為36.0%，中位生存時(shí)間為49個(gè)月；miR-210高表達(dá)患者術(shù)后的3年生存率為32.3%、5年生存率為25.8%，中位生存時(shí)間為23.5個(gè)月。經(jīng)過(guò)Log-Rank檢驗(yàn)，miR-210高表達(dá)組5年生存率低于低表達(dá)組的5年生存率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.380，P=0.020)。見(jiàn)圖2。

2.5 miR-210調(diào)控的靶蛋白及參與的信號(hào)通路分析 通過(guò)查詢(xún)Target Scan、miRanda 和 miR Base Targets數(shù)據(jù)庫(kù)，取3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中共同預(yù)測(cè)的靶基因作為miR-210的可能靶基因，包括GPD1L、NFKB1、ABCB9、U2AF2、XPA、RAD52、MRE11A、ACVR1B、BDNF、APC、NFKB1、E2F3、ESPL1、EFNA3、NCAM1、PTPN1、PIM1、BDNF、PIM1、HOXA9、FGFRL1、EFNA3、VEGF共23個(gè)基因。應(yīng)用miRWalk數(shù)據(jù)庫(kù)中的KEGG pathway功能聚類(lèi)分析miR-210調(diào)控的靶基因參與的與腫瘤相關(guān)的信號(hào)通路，可見(jiàn)miR-210參與了包括MAPK信號(hào)通路，Wnt信號(hào)通路等。見(jiàn)圖3、表3。

圖2 miR-210 高表達(dá)組和低表達(dá)組患者生存率比較(Kaplan-Meier法)

圖3 miR-210靶基因的預(yù)測(cè)結(jié)果分析

表3 miR-210調(diào)控的靶基因參與腫瘤相關(guān)信號(hào)通路分析

3 討論

卵巢癌是婦科三大惡性腫瘤之一，其病死率在女性生殖道腫瘤中居首位，5年生存率長(zhǎng)期徘徊在30～45%左右[2]。目前對(duì)卵巢癌主要的治療以手術(shù)+鉑類(lèi)為基礎(chǔ)的化療為主,并輔以放療、靶向治療等，但晚期患者遠(yuǎn)期存活率并無(wú)明顯改善。其主要原因是：(1)由于卵巢癌患者缺乏早期的典型臨床癥狀，因此大多數(shù)患者在就診時(shí)已屬晚期；(2)對(duì)化療藥物易產(chǎn)生耐藥。因此對(duì)于卵巢癌患者的早期發(fā)現(xiàn)及化療耐藥的預(yù)防及逆轉(zhuǎn)就顯得尤為重要。通過(guò)探究卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展及耐藥機(jī)制，從而為卵巢癌患者提供新的早期診斷標(biāo)志物和耐藥治療靶點(diǎn)已經(jīng)成為研究者迫切需要解決的問(wèn)題[9]。

miRNA 是一類(lèi)長(zhǎng)度約20-25個(gè)核苷酸的非編碼RNA，以往認(rèn)為miRNA 無(wú)生物學(xué)功能[10]。但隨后研究發(fā)現(xiàn)人類(lèi)各種類(lèi)型腫瘤發(fā)生、發(fā)展均與miRNA的異常表達(dá)相關(guān)[11]。miRNA可通過(guò)調(diào)控其靶mRNA的表達(dá)參與腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲、血管生成和免疫逃避的發(fā)生及進(jìn)展[12]。miRNA 是通過(guò)與靶基因的3’端非翻譯區(qū)互補(bǔ)結(jié)合進(jìn)而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)節(jié)作用，并且同時(shí)調(diào)控多個(gè)目標(biāo)基因。因此，miRNA在生物體的生理及病理過(guò)程中發(fā)揮廣泛作用。目前研究認(rèn)為：與腫瘤相關(guān)的miRNAs 被分為兩類(lèi)：抑癌miRNAs 和促癌miRNAs[13]。盡管如此，有關(guān)人類(lèi)miRNAs 異常表達(dá)導(dǎo)致惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的研究才剛剛開(kāi)始，這是因?yàn)橐粋€(gè)miRNA可以同時(shí)調(diào)控多個(gè)靶基因，一個(gè)靶基因也可以被多個(gè)miRNA調(diào)控，miRNA與靶基因之間形成了復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。研究表明，在卵巢癌患者中，miRNA異常表達(dá)參與不同卵巢癌通路在卵巢癌的發(fā)病機(jī)制和發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[14，15]。

miR-210 是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種與缺氧環(huán)境密切相關(guān)的miRNA，其下游靶基因通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期、分化、凋亡、惡變、糖酵解等過(guò)程而發(fā)揮著重要作用，與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[6,8]。正因?yàn)槿绱?，miR-210成為科學(xué)家關(guān)注的熱點(diǎn)之一。國(guó)內(nèi)學(xué)者以miRNA微陣列技術(shù)為平臺(tái),最終篩選了卵巢癌化療耐藥與敏感組織之間表達(dá)差異的miRNA,其中在耐藥組織中表達(dá)上調(diào)為has-miR-210、has-miR-1307，表達(dá)下調(diào)為has-miR-134[7]。本研究通過(guò)Real-time PCR方法檢測(cè)了卵巢癌組織中miR-210的表達(dá)情況，結(jié)果提示與正常卵巢組織相比，miR-210在卵巢癌組織中表達(dá)明顯上調(diào)(1.539±0.363 vs 1.017±0.289)，進(jìn)一步分析顯示卵巢癌組織中miR-210的表達(dá)水平與卵巢癌的FIGO分期、分化類(lèi)型具有明顯相關(guān)性，這提示miR-210的上調(diào)表達(dá)可能參與了卵巢癌的疾病進(jìn)展和腫瘤細(xì)胞的分化。同時(shí)，我們檢測(cè)了卵巢上皮性癌細(xì)胞系中miR-210的表達(dá)，結(jié)果顯示miR-210在各卵巢上皮性癌細(xì)胞系中均高表達(dá)，并且卵巢癌耐藥細(xì)胞系與各對(duì)應(yīng)卵巢癌細(xì)胞系miR-210的表達(dá)存在明顯差異性，這一結(jié)果提示miR-210可能參與了卵巢癌發(fā)生、發(fā)展、耐藥等各生物學(xué)過(guò)程。目前研究認(rèn)為在絕大多數(shù)腫瘤中，miR-210的表達(dá)通常是升高的，例如頭頸部腫瘤、胰腺癌等,這與miR-210能夠促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程有關(guān)[16，17]。研究表明miR-210是缺氧條件下變化最明顯的miRNA，這種過(guò)表達(dá)可能只是腫瘤乏氧的反應(yīng)，但也有學(xué)者認(rèn)為miR-210表達(dá)有可能參與腫瘤乏氧狀態(tài)下的發(fā)生、發(fā)展[18]。另外，在某些腫瘤中觀察到miR-210表達(dá)下降和基因缺失，暗示它具有潛在的抑制腫瘤功能。有研究發(fā)現(xiàn)miR-210能夠明顯地抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)[19]。根據(jù)這些研究，我們認(rèn)為miR-210在腫瘤發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中的作用具有多面性，它可能是調(diào)節(jié)細(xì)胞自身穩(wěn)態(tài)的重要分子，擾亂細(xì)胞內(nèi)miR-210水平將不利于細(xì)胞的生存。因此，闡明miR-210參與卵巢癌發(fā)生、發(fā)展、耐藥的具體分子機(jī)制可為卵巢癌早期診斷和治療提供新的靶點(diǎn)。

在我們檢測(cè)的多種卵巢上皮性癌細(xì)胞系中miR-210均有不同程度的高表達(dá)，但是通過(guò)比較具有高轉(zhuǎn)移特性的HO-8910PM與親本HO-8910細(xì)胞系，miR-210呈下調(diào)表達(dá)(35.857VS21.970，P=0.0004)，通過(guò)對(duì)靶基因的分析可知：miR-210可能調(diào)控ACVR1B，PTPN1，NCAM1，而這些蛋白參與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)生物學(xué)過(guò)程，這提示在卵巢上皮性癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中miR-210是一重要的角色。同時(shí)，我們對(duì)比SKOV3與耐藥細(xì)胞系發(fā)現(xiàn)，在耐藥細(xì)胞系中miR-210明顯上調(diào)，這一結(jié)果與雙婷等[7]對(duì)miR-210在卵巢癌耐藥與敏感組織中的檢測(cè)結(jié)果一致，這是否說(shuō)明miR-210的表達(dá)水平差異，參與通過(guò)細(xì)胞信號(hào)通路，改變腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感度，為此，我們認(rèn)為進(jìn)一步研究miR-210在卵巢癌化療耐藥中的機(jī)制有重要的意義。

此外，在本研究中，我們對(duì)miR-210的表達(dá)情況與卵巢癌患者的生存情況進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，miR-210高表達(dá)的卵巢癌患者中位生存時(shí)間為23.5個(gè)月，5年生存率為25.8%；miR-210低表達(dá)患者的中位生存期為49個(gè)月，5年生存率為36.0%，經(jīng)Log-Rank檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.020)，miR-210高表達(dá)卵巢癌患者的生存較低表達(dá)患者差。Greither等[20]在胰腺癌患者中研究結(jié)果表明miR-210高表達(dá)胰腺癌患者的預(yù)后差于miR-210低表達(dá)患者，這與我們的研究結(jié)果是一致的。雖然CA125、HE4等腫瘤標(biāo)記物在臨床工作中廣泛應(yīng)用，但其都存在敏感性或特異性不高的問(wèn)題。因此，目前卵巢癌的診療過(guò)程中仍然缺乏較為有效的評(píng)價(jià)預(yù)后的生物標(biāo)志物，進(jìn)一步研究miR-210在卵巢癌預(yù)后中的價(jià)值可以為卵巢癌的診療過(guò)程及預(yù)后判斷提供新分子標(biāo)志物。

綜上所述，本研究的結(jié)果提示miR-210在卵巢癌組織及卵巢癌細(xì)胞系中均表達(dá)上調(diào)，其異常表達(dá)與卵巢癌患者的年齡及病理類(lèi)型無(wú)關(guān)，與卵巢癌FIGO分期及腫瘤細(xì)胞分化程度顯著相關(guān)，并且與卵巢癌患者的不良預(yù)后相關(guān)，可以作為預(yù)后判斷指標(biāo)，具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值，深入研究miR-210在卵巢癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的詳細(xì)分子機(jī)制，探討其所起到的作用，可為將來(lái)卵巢癌的臨床診斷、治療以及預(yù)后判斷提供詳細(xì)的理論依據(jù)。