李 藝，唐啟盛，王 戈，趙瑞珍

廣泛性焦慮障礙(generalized anxiety disorder，GAD)是以缺乏明確對象和具體內(nèi)容的持續(xù)而明顯的緊張不安，并以伴有自主神經(jīng)功能興奮和過分警覺為特征的慢性焦慮障礙，為焦慮障礙最常見的亞型之一[1]。隨著現(xiàn)代社會的快速發(fā)展，工作、生活壓力越來越大，GAD的發(fā)病率呈逐年上升趨勢[2]。神經(jīng)營養(yǎng)因子(neurotrophic factors，NTFs)主要由神經(jīng)元、神經(jīng)支配的靶組織和膠質(zhì)細(xì)胞合成并分泌，能有效營養(yǎng)和保護(hù)中樞和外周神經(jīng)，促進(jìn)神經(jīng)元的分化、生長和存活，神經(jīng)營養(yǎng)因子及其相關(guān)的受體在神經(jīng)系統(tǒng)正常生理功能的維持和病理狀態(tài)下的修復(fù)與再生中扮演著重要角色。Papez環(huán)路是多種精神情感障礙的病理學(xué)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。腦內(nèi)神經(jīng)營養(yǎng)因子在GAD發(fā)病與修復(fù)中的作用目前尚未闡明，通過病理學(xué)、細(xì)胞學(xué)和分子生物學(xué)等實(shí)驗(yàn)手段研究發(fā)現(xiàn)，GAD大鼠Papez環(huán)路區(qū)域內(nèi)(包括海馬、乳頭體、杏仁核復(fù)合體、丘腦前核等部位)存在著廣泛的細(xì)胞損傷、凋亡與壞死，而機(jī)體自身進(jìn)行的神經(jīng)修復(fù)與再生需要包含多種神經(jīng)營養(yǎng)因子及其受體在內(nèi)的局部微環(huán)境的營養(yǎng)與調(diào)控[3-4]。因此，本實(shí)驗(yàn)從神經(jīng)修復(fù)的角度出發(fā)，采用天敵暴露飲水沖突刺激法建立GAD大鼠模型，通過免疫組織化學(xué)方法檢測GAD大鼠腦Papez環(huán)路區(qū)域內(nèi)海馬(包括CA1、CA2、CA3、DG區(qū))、杏仁核和丘腦前核等部位神經(jīng)營養(yǎng)因子[腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、堿性成纖維生長因子(bFGF)、神經(jīng)生長因子(NGF)]及腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子受體(TrkB)、堿性成纖維生長因子受體(bFGFR)的表達(dá)水平以及丹梔逍遙散的干預(yù)效用，以期進(jìn)一步揭示神經(jīng)營養(yǎng)因子及其受體在GAD發(fā)病與修復(fù)中的作用以及疏肝清熱健脾法對GAD中樞神經(jīng)修復(fù)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量(200±10)g，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK(京)2012-0001。大鼠購入后，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，自由攝食飲水。明暗光照各12 h，室溫(20±2)℃，相對濕度50%～60%，保持安靜。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 中藥丹梔逍遙散(柴胡15 g、梔子10 g、牡丹皮10 g、炒白術(shù)15 g等)由北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院提供，按灌胃劑量煎藥濃縮，濃度為1.05 g/mL，貯存于4 ℃冰箱中備用，臨用前加熱。鹽酸丁螺環(huán)酮片(西南合成藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字H19990302)按照成人用量的7倍計(jì)算大鼠用量為每天2 mg/kg，臨用時(shí)溶于蒸餾水中混勻，濃度為0.20 g/L。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 兔抗大鼠BDNF一抗兔抗大鼠TrkB一抗、兔抗大鼠bFGF一抗、兔抗大鼠bFGFR一抗、兔抗大鼠NGF一抗，均購于武漢博士德公司；SP法超敏二抗試劑盒，購于福州邁新生物技術(shù)公司；DAB顯色試劑盒購于福州邁新生物技術(shù)公司；磷酸緩沖鹽溶液(PBS)、枸櫞酸、多聚賴氨酸、蛋白酶K均購于福州邁新生物技術(shù)公司；多聚甲醛、二甲苯、石蠟、水合氯醛均購于北京化工廠；中性樹膠購于北京中杉金橋生物公司。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器 十字迷宮(北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院提供)；DHG-9023A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥機(jī)(廣州漢迪環(huán)境試驗(yàn)設(shè)備公司)；6D生物組織包埋機(jī)(金華市益迪醫(yī)療設(shè)備公司)；PN006072石蠟切片機(jī)(北京亞興泰機(jī)電設(shè)備公司)；Olympus BX53正置顯微鏡(日本Olympus株式會社)；Olympus DP72照相系統(tǒng)(日本Olympus株式會社)；Olympus Cellsense成像軟件(日本Olympus株式會社)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分組與給藥 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行OPEN-FIELD行為學(xué)評分，取評分相近的大鼠32只，按照隨機(jī)數(shù)字表分為正常組、模型組、中藥組和西藥組，每組8只。自造模第1天起，正常組和模型組予蒸餾水灌胃，西藥組予鹽酸丁螺環(huán)酮溶液1 mL/100 g灌胃，中藥組予丹梔逍遙散濃縮藥汁1 mL/100 g灌胃，每天1次，連續(xù)21 d。

1.2.2 模型制備 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)及分組結(jié)束后，模型組、西藥組、中藥組與灌胃同步進(jìn)行天敵暴露飲水沖突模型制備。模型制備分兩種方式進(jìn)行應(yīng)激，兩種應(yīng)激每天使用1種，交替使用21 d。①飲水沖突應(yīng)激：大鼠先剝奪飲水24 h后再允許飲水，每當(dāng)舔吸水管口達(dá)20次就給予1.2 mA電流令其遭受電擊，電流來自于鼠籠底部有導(dǎo)電功能且與電擊控制設(shè)備相連接的金屬柵欄，每次應(yīng)激持續(xù)時(shí)間3 min。應(yīng)激時(shí)由3名觀察者觀察并記錄大鼠應(yīng)激期間飲水次數(shù)，以3位觀察者觀察結(jié)果的平均數(shù)作為飲水沖突應(yīng)激時(shí)飲水次數(shù)的值。②天敵暴露應(yīng)激：本實(shí)驗(yàn)以貓作為對大鼠造成威脅的天敵，實(shí)驗(yàn)用貓每日僅進(jìn)食30 g小鼠1只，確保在實(shí)驗(yàn)中處于饑餓狀態(tài)，維持其對大鼠天然的攻擊性。在大鼠進(jìn)行飲水沖突的次日進(jìn)行天敵暴露應(yīng)激，應(yīng)激時(shí)將大鼠以每籠1只置于貓籠內(nèi)，將貓引入貓籠，貓可在籠內(nèi)自由活動(dòng)，大鼠暴露于貓每次45 min。模型制備期間，3組大鼠應(yīng)激操作均于每日08：00～11：30進(jìn)行，應(yīng)激前3組大鼠提前30 min進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)環(huán)境，操作時(shí)抓取動(dòng)物保持輕柔。

1.2.3 行為學(xué)測試 分別在造模開始后的第7天、第14天、第21天對4組大鼠進(jìn)行高架十字迷宮(EPM)行為學(xué)測試[5-6]。實(shí)驗(yàn)開始時(shí)將大鼠從中央?yún)^(qū)面向閉合臂放入迷宮，記錄5 min內(nèi)大鼠的活動(dòng)情況。觀察大鼠閉合臂進(jìn)入次數(shù)(CE，必須有兩只前爪進(jìn)入壁內(nèi))、開放臂進(jìn)入次數(shù)(OE)、閉合臂停留時(shí)間(CT)、開放臂停留時(shí)間(OT)。計(jì)算OE占兩臂總次數(shù)(TE)的百分比、OT占兩臂總時(shí)間(TT)的百分比。

1.2.4 取材及處理 最后一次行為學(xué)測試結(jié)束后進(jìn)行取材，將大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，劑量為0.4 mL/100 g。將大鼠固定在解剖板上，斷頭取腦后，投入4%多聚甲醛中固定。24 h后，取出腦組織，經(jīng)預(yù)處理后，在自動(dòng)石蠟包埋機(jī)上對大鼠的腦標(biāo)本進(jìn)行石蠟包埋，待冷卻堅(jiān)硬后，在輪轉(zhuǎn)切片機(jī)上對腦的丘腦前核層面、海馬杏仁核層面進(jìn)行切片，切片厚度為6 μm。在撈片機(jī)中將組織切片貼于涂有多聚賴氨酸的載玻片上，40 ℃溫箱烘烤過夜，備用。

1.2.5 免疫組織化學(xué)SP法檢測Papez環(huán)路內(nèi)海馬(CA1、CA2、CA3、DG區(qū))和杏仁核、丘腦前核的BDNF、bFGF、NGF、TrkB、bFGFR的表達(dá) 具體步驟如下：每組隨機(jī)選取丘腦前核層面、海馬杏仁核層面各8張石蠟切片，脫蠟，水合；PBS沖洗切片3遍，每次5 min，分別在每張切片滴加50 μL蛋白酶K以增加細(xì)胞通透性，37 ℃下避光孵育10 min；PBS沖洗切片3遍，每次5 min；將切片放入枸櫞酸溶液內(nèi)，煮沸10 min，取出，自然冷卻至室溫；每張切片滴加50 μL 3% 過氧化氫(H2O2)，室溫避光反應(yīng)10 min；PBS沖洗切片3遍，每次5 min；每張切片滴加50 μL羊血清工作液，室溫避光孵育10 min；甩干羊血清，每張切片滴加50 μL兔抗大鼠一抗，避光孵育，4 ℃過夜；PBS沖洗切片3遍，每次5 min；每張切片分別滴加羊抗兔二抗工作液50 μL，避光室溫孵育10 min；PBS沖洗切片3遍，每次5 min；每張切片分別滴加鏈霉菌抗生素蛋白-過氧化物酶50 μL，避光室溫孵育10 min；PBS沖洗切片3遍，每次5 min；每張切片上滴加二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液50 μL，光鏡下觀察并控制顯色時(shí)間，約為10 min；蒸餾水洗玻片3次，每次5 min，以終止顯色反應(yīng)；脫水；通風(fēng)櫥內(nèi)浸泡入二甲苯Ⅰ10 min，二甲苯Ⅱ10 min；每張切片滴加1滴中性樹膠，封片；待玻片完全干燥后，在光學(xué)顯微鏡下觀察，拍照。每張切片隨機(jī)選取1個(gè)200倍視野和4個(gè)400倍視野照相，image pro plus 6.0軟件測算陽性表達(dá)部位的積分光密度值(integral optical density，IOD)，并根據(jù)公式IOD=AOD(平均光密度值)×A(陽性表達(dá)區(qū)域的面積)計(jì)算出AOD。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠一般情況 21 d造模及藥物干預(yù)結(jié)束后，肉眼觀察4組大鼠的一般情況。天敵暴露期間的大鼠在面對天敵威脅時(shí)表現(xiàn)出焦慮樣行為，如四處閃躲、行動(dòng)較少、反復(fù)蹲伏、瑟縮顫抖、動(dòng)作僵硬、排泄糞便變多等；飲水沖突應(yīng)激期間大鼠被電擊后表現(xiàn)出短暫的停滯僵硬、毛發(fā)聳立或逃竄、不停尖叫，電擊后再飲水時(shí)表現(xiàn)出膽怯、畏縮。正常組大鼠體型飽滿、皮毛濡潤、精力旺盛、活動(dòng)靈活、飲食正常、體質(zhì)量增加；模型組、中藥組和西藥組大鼠較正常組體型瘦薄、皮毛枯糙、神情慵懶、活動(dòng)遲鈍、飲食減少、易被激惹。造模及藥物干預(yù)期間，4組大鼠均無死亡。

2.2 丹梔逍遙散對GAD大鼠行為學(xué)的影響 與正常組比較，模型組、中藥組、西藥組在第7天、第14天時(shí)，OE/TE、OT/TT值均下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。第21天時(shí)，與正常組比較，模型組、西藥組OE/TE、OT/TT值均下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；與模型組比較，中藥組、西藥組OE/TE、OT/TT值均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠于造模開始后第7天、第14天、第21天高架十字迷宮測試結(jié)果比較(±s) 單位：%

2.3 丹梔逍遙散對大鼠腦Papez環(huán)路區(qū)域內(nèi)神經(jīng)營養(yǎng)因子及其受體表達(dá)的影響 與正常組比較，模型組海馬各區(qū)和杏仁核區(qū)TrkB、NGF的表達(dá)水平有明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；模型組海馬各區(qū)bFGF、bFGFR表達(dá)水平明顯升高，杏仁核區(qū)表達(dá)水平明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；模型組海馬各區(qū)及杏仁核區(qū)、丘腦前核區(qū)BDNF表達(dá)與其他3組間比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但海馬CA1區(qū)模型組較正常組有下降趨勢。

與模型組比較,中藥組海馬各區(qū)和杏仁核區(qū)bFGF、TrkB、NGF表達(dá)水平明顯升高,西藥組bFGF在海馬CA2區(qū)、CA3區(qū)、DG區(qū)和杏仁核區(qū)均升高,西藥組TrkB在海馬各區(qū)和杏仁核區(qū)均升高,西藥組NGF在杏仁核區(qū)升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；中藥組海馬各區(qū)和杏仁核區(qū)bFGFR表達(dá)水平明顯升高,西藥組海馬各區(qū)bFGFR表達(dá)水平明顯降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；丘腦前核區(qū)的表達(dá)在模型組與正常組以及中藥組與西藥組之間比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表2。

表2 各組大鼠腦Papez環(huán)路區(qū)域內(nèi)神經(jīng)營養(yǎng)因子及其受體表達(dá)的變化(±s)

3 討 論

Perez于2009年發(fā)現(xiàn)bFGF是參與調(diào)節(jié)心境的關(guān)鍵因素，但是bFGF與其受體bFGFR在 GAD 中的表達(dá)水平變化目前尚無定論。有研究發(fā)現(xiàn)，慢性應(yīng)激可以引起皮質(zhì)、海馬 CA1、CA3 區(qū)的錐體細(xì)胞及齒狀回的顆粒細(xì)胞內(nèi)的bFGF含量明顯下降。同時(shí)，肖娟娟等[7]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，接受慢性復(fù)合應(yīng)激刺激的大鼠海馬內(nèi) bFGF 的陽性細(xì)胞數(shù)增加而且bFGF的平均表達(dá)水平上調(diào)。常憲魯?shù)萚8]發(fā)現(xiàn)青少年首發(fā)GAD病人血清BDNF、IL-6水平較健康對照均升高，且兩者存在相關(guān)性，可能參與了青少年首發(fā)GAD病理生理過程。BDNF已被報(bào)道具有抗焦慮作用，增強(qiáng)γ氨基丁酸(GABA)突觸傳遞。Iba等[9]發(fā)現(xiàn)治療經(jīng)前期綜合征(PMS)伴焦慮的中草藥乙醇提取物(EE-IHW)通過增加杏仁核β2-亞基和BDNF，增加GABA受體介導(dǎo)的信號，從而減弱孕酮戒斷引起的焦慮樣行為。Dutt等[10]發(fā)現(xiàn)帕羅西汀對GAD病人的治療效果明顯改善，反映了心臟自主張力和BDNF水平的恢復(fù)，暗示了他們作為潛在的生物標(biāo)志物的作用。此外，何正初等[11]發(fā)現(xiàn)越鞠丸可明顯降低創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙(PTSD)大鼠的恐懼記憶和自主活動(dòng)、改善焦慮行為，并維持PTSD大鼠海馬組織中的BDNF、5-羥色胺1A(5-HT1A)、5-HT2A的表達(dá)。趙小林等[12]實(shí)驗(yàn)證實(shí)，抑郁伴焦慮病人血漿NGF水平較正常組有明顯升高。Fernandes等[13]實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示NGF在實(shí)驗(yàn)性腦缺血再灌注后14 d參與了焦慮樣行為。

本研究結(jié)果顯示，bFGF與其bFGFR在海馬、杏仁核和丘腦前核內(nèi)的神經(jīng)元的胞漿與軸突內(nèi)均有表達(dá)，模型組大鼠海馬各區(qū)bFGF及其受體bFGFR的AOD值較正常組明顯升高，表明在以上腦區(qū)內(nèi)bFGF和bFGFR的蛋白總量和陽性表達(dá)區(qū)域內(nèi)的平均含量均增加，提示bFGF及其受體對神經(jīng)損傷較為敏感，機(jī)體自身在神經(jīng)元損傷或凋亡的早期能夠反應(yīng)性的分泌更多bFGF，使得bFGF能夠相對于其他神經(jīng)營養(yǎng)因子更為積極的代償性表達(dá)，同時(shí)其受體bFGFR適應(yīng)性的表達(dá)上調(diào)，從而積極地促進(jìn)神經(jīng)的修復(fù)和再生。模型組大鼠bFGF和bFGFR在杏仁核內(nèi)的表達(dá)水平相比正常組明顯下降，提示杏仁核內(nèi)的bFGF和bFGFR可能對損傷性刺激的代償性反應(yīng)不如海馬區(qū)敏感。但是，經(jīng)過中藥丹梔逍遙散干預(yù)后的GAD大鼠海馬各區(qū)和杏仁核區(qū)內(nèi)bFGF和其受體bFGFR的表達(dá)水平相較于模型組都明顯升高，提示疏肝清熱健脾法能夠通過刺激bFGF和bFGFR在杏仁核的表達(dá)以及在海馬內(nèi)的進(jìn)一步表達(dá)來發(fā)揮二者的促神經(jīng)修復(fù)功能。

本研究結(jié)果顯示，BDNF和NGF主要在海馬、杏仁核和丘腦前核神經(jīng)元的胞漿中表達(dá)，突起內(nèi)亦有少量表達(dá)，TrkB主要存在于神經(jīng)元胞膜和胞漿內(nèi)。模型組大鼠海馬各區(qū)和杏仁核內(nèi)BDNF蛋白的AOD值與正常組比較并無明顯差異，提示相應(yīng)表達(dá)區(qū)域內(nèi)BDNF的平均含量無明顯變化，但BDNF的陽性表達(dá)區(qū)域面積減小，陽性細(xì)胞數(shù)量減少；模型組大鼠的TrkB在海馬各區(qū)和杏仁核內(nèi)的AOD值明顯下降，陽性表達(dá)區(qū)域內(nèi)TrkB的平均含量亦減少；對NGF表達(dá)水平的測試結(jié)果顯示，模型組大鼠海馬4個(gè)分區(qū)和杏仁核內(nèi)NGF蛋白的AOD值較正常組都明顯下降，表明在以上腦區(qū)內(nèi)TrkB和NGF的蛋白總量和陽性表達(dá)區(qū)域內(nèi)平均含量減少。提示慢性心理應(yīng)激可以導(dǎo)致海馬、杏仁核內(nèi)BDNF表達(dá)水平下降，進(jìn)而導(dǎo)致其高親和力受體TrkB適應(yīng)性表達(dá)下調(diào)，同時(shí)NGF的表達(dá)水平也有明顯降低，BDNF和NGF含量下降可能下調(diào)了多條細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(如MAPK/ERK通路等)的功能，進(jìn)而其營養(yǎng)、保護(hù)神經(jīng)元的作用受到抑制，機(jī)體對外界應(yīng)激的適應(yīng)性降低，神經(jīng)的可塑性被削弱，神經(jīng)易損的敏感性得到提高，或者進(jìn)一步影響了5-羥色胺(5-HT)、去甲腎上腺素(NE)等相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)的合成與釋放，從而導(dǎo)致GAD發(fā)病以及Papez環(huán)路內(nèi)細(xì)胞損傷與凋亡的出現(xiàn)?？梢?，BDNF和NGF表達(dá)水平的下調(diào)有可能作為始動(dòng)環(huán)節(jié)之一參與了GAD的發(fā)病機(jī)制，而且與Papez環(huán)路內(nèi)的細(xì)胞損傷與凋亡密切相關(guān)。

經(jīng)過中藥丹梔逍遙散干預(yù)的GAD大鼠，海馬各區(qū)和杏仁核區(qū)內(nèi)BDNF的受體bFGFR、TrkB和NGF的表達(dá)水平有了明顯回升，有利于BDNF、NGF更好地發(fā)揮其生理功能，促進(jìn)損傷腦區(qū)局部微環(huán)境的恢復(fù)，增強(qiáng)神經(jīng)可塑性，保護(hù)神經(jīng)元，抑制凋亡與壞死，促進(jìn)神經(jīng)的修復(fù)以及神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)的增殖與分化。

丘腦前核作為Papez環(huán)路中的重要組成部分之一，本研究并未發(fā)現(xiàn)丘腦前核中BDNF、bFGF、NGF及受體TrkB、bFGFR的表達(dá)水平的明顯變化，提示丘腦前核區(qū)可能對本實(shí)驗(yàn)采用的天敵暴露飲水沖突應(yīng)激方式并不敏感，或者此5種蛋白與丘腦前核區(qū)的損傷與修復(fù)并無密切聯(lián)系，而其他種類的神經(jīng)營養(yǎng)因子和相關(guān)蛋白是否可能通過不同的途徑或機(jī)制積極地參與了GAD中丘腦前核區(qū)的損傷與修復(fù)進(jìn)程，還有待于進(jìn)一步深入的研究。