高彥龍,張 德,張 瑞,張仲興,趙 婷,王雙成,王延秀
(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院,甘肅 蘭州 730070)
蘋(píng)果(MalusdomesticaBorkh.)是我國(guó)西北地區(qū)重要的經(jīng)濟(jì)果品[1],但該地區(qū)日趨加劇的土壤鹽漬化嚴(yán)重制約了蘋(píng)果產(chǎn)業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展,影響果實(shí)產(chǎn)量和品質(zhì)的形成[2]。生產(chǎn)發(fā)現(xiàn),一定濃度的硝普鈉(SNP)、亞精胺(Spd)和水楊酸(SA)能夠提高麻黃幼苗的抗鹽性能[3],外源SAM(S腺苷甲硫氨酸)也可顯著緩解鹽脅迫對(duì)植株的傷害[4]。故適宜的外源物質(zhì)對(duì)植物在逆境下生長(zhǎng)具有重要意義。
在生產(chǎn)中應(yīng)用外源物質(zhì)以期提高植物抗逆性的研究已成為焦點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn),外源鈣處理可增強(qiáng)干旱脅迫下水稻的滲透調(diào)節(jié)能力,使其保持較高的組織含水量[5],趙小紅[6]發(fā)現(xiàn)外源CaCl2處理可增加植株脯氨酸和SSC含量,從而提高其抗旱性;低溫容易引起植物細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的破壞,而鈣離子可與磷脂發(fā)生聚合作用,來(lái)增強(qiáng)膜的硬度和完整性[7],以上研究均表明,適宜濃度的CaCl2可減緩干旱及低溫脅迫對(duì)植物造成的傷害。鹽脅迫下,外源CaCl2處理可提高百合體內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量及抗氧化酶活性[8],還會(huì)引起質(zhì)膜上Ca2+內(nèi)流,從而激活SOS、CBL-CIPK等通路以增強(qiáng)耐鹽性[9];此外,張浩等[10]在玉米的研究中證實(shí)外源CaCl2可改變氣孔結(jié)構(gòu)特征增強(qiáng)葉片光合作用,提高其耐鹽性。目前,外源CaCl2在植物鹽脅迫中的應(yīng)用多集中蔬菜[11]和主要的糧食作物[12-13]上,在梨[14]、酸棗[15]等木本植物中也有研究,而在蘋(píng)果砧木逆境脅迫中鮮見(jiàn)應(yīng)用及報(bào)道。
T337是英國(guó)東茂林試驗(yàn)站選育的優(yōu)良矮化砧木,蘋(píng)果生產(chǎn)中應(yīng)用較廣,具有育苗簡(jiǎn)單、苗圃整齊、結(jié)果早、產(chǎn)量高、品質(zhì)優(yōu)等特點(diǎn)[16]。本試驗(yàn)以T337為試材,研究鹽脅迫下外源噴施不同濃度CaCl2對(duì)其葉片光合及生理特性影響,并利用主成分綜合評(píng)價(jià)不同濃度間效果,以期為CaCl2在蘋(píng)果砧木抗性研究及栽培生產(chǎn)中提供理論依據(jù),從而實(shí)現(xiàn)蘋(píng)果高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)栽培。
本試驗(yàn)于2020年5-9月在甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)(N 36°1′~37°9′,E 106°21′~107°44′)避雨棚中進(jìn)行,選擇長(zhǎng)勢(shì)相似且生長(zhǎng)健壯的二年生蘋(píng)果砧木T337 90株,栽植于盛裝3.5 kg基質(zhì)(蛭石∶珍珠巖∶泥炭=1∶1∶3,按比例混合后鈣含量約為0.02 mg/kg,對(duì)試驗(yàn)的影響可忽略不計(jì))、質(zhì)量約為0.65 kg的大營(yíng)養(yǎng)缽中(25 cm×38 cm),每盆一株,置于避雨棚中統(tǒng)一管理。
試驗(yàn)共設(shè)6個(gè)處理(表1),對(duì)照(CK)澆灌去離子水,T2~T5處理澆灌鹽溶液,每個(gè)處理3次重復(fù),每個(gè)重復(fù)5株。各處理均隔7 d分別澆灌4 L去離子水和鹽溶液,在澆灌鹽溶液的同時(shí),CK和T1葉面噴施200 mL去離子水,對(duì)T2~T5處理每盆葉面噴施相同體積的CaCl2溶液。此外,噴施時(shí)間一般選擇晴天的清晨(9∶00-10∶30)進(jìn)行,從脅迫處理次日開(kāi)始,第1次取樣時(shí)間為2020年5月11日,后每隔5 d取生長(zhǎng)一致的幼苗頂端相同節(jié)位葉片進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定。
表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案Tab.1 Test design scheme
1.2.1 葉綠素含量的測(cè)定 相對(duì)葉綠素含量(SPAD)用SPAD-502葉綠素計(jì)測(cè)量,使用前進(jìn)行校準(zhǔn)。于脅迫0,5,10,15,20 d后,采植株中上部大葉節(jié)以上的功能性葉片,洗凈擦干表面污物,選用中脈兩邊寬度一致且對(duì)稱的葉片進(jìn)行指標(biāo)測(cè)定,重復(fù)3次,取平均值。
1.2.2 光合及熒光參數(shù)的測(cè)定 光合參數(shù)測(cè)定:光合特性在早晨9:00-11:00測(cè)定,于脅迫0,5,10,15,20 d后選取向陽(yáng)枝條上的成熟功能葉片,使用 LI-6400XT便攜式開(kāi)放氣體交換器系統(tǒng)(Li-COR Biosciences,Lincoln,美國(guó))測(cè)定凈光合速率(Pn)、蒸騰速率(Tr)、胞間CO2(Ci)、氣孔導(dǎo)度(Gs),光合有效輻射為400~600 μmol/(m2·s),葉室內(nèi)空氣流量設(shè)定為500 mL/min,室內(nèi)CO2濃度為(385±10)μL/L,每個(gè)處理選取3株。
熒光參數(shù)測(cè)定:暗處理30 min后使用Imag-ing-Pam葉綠素?zé)晒庥?jì)和成像WinGegE軟件(Walz,Effeltrich,德國(guó))測(cè)定初始熒光(F0)、PSⅡ最大光能轉(zhuǎn)化率 (Fv/Fm)、光合電子傳遞效率(ETR)的變化,測(cè)定時(shí)間與光合參數(shù)測(cè)定同步。
1.2.3 抗氧化酶活性及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的測(cè)定 在脅迫0,5,10,15,20 d后,采取植株中上部大葉節(jié)以上的功能性葉片,用蒸餾水洗凈并去除葉脈磨碎,用于測(cè)定生理指標(biāo)。相對(duì)電導(dǎo)率采用電導(dǎo)儀法[17];超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)參照Singh等[18]的方法測(cè)定;丙二醛(MDA)、脯氨酸含量參照Rozi等[19]的方法測(cè)定,重復(fù)3次。
利用SPSS 22.0(BM,Armonk,NY,美國(guó))進(jìn)行顯著性分析、相關(guān)性和主成分分析,Origin 9.1軟件(OriginLab,Hampton,MA,美國(guó))作圖。顯著性分析檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)差異,Duncan檢驗(yàn)比較平均差異(P< 0.05)。
由圖1-A可知,隨著鹽脅迫的持續(xù),葉片的Tr呈持續(xù)下降趨勢(shì),具有明顯濃度效應(yīng)。脅迫至20 d,T2~T5處理下的Tr降至最低,分別為1.39,1.32,1.54,1.29 mmol/(m2·s),均顯著高于T1(1.21 mmol/(m2·s),顯著低于CK(2.42 mmol/(m2·s))。相較于T1,Tr分別提高了14.88%(T2),9.09%(T3),27.27%(T4),6.61%(T5),以T4處理效果最佳。
葉片的Pn呈現(xiàn)出與Tr相同的趨勢(shì),且在同一時(shí)間點(diǎn)Tr隨CaCl2處理濃度的增加呈先升后降的趨勢(shì)(圖1-B)。脅迫至20 d,各處理Pn降至最低值,其中T4處理值最高(3.45 μmol/(m2·s)),T2處理值最低(3.14 μmol/(m2·s)),均顯著高于T1(3.02 μmol/(m2·s)),相對(duì)于T1,T2和T4處理Pn增幅分別為3.97%,14.24%。
由圖1-C可得,隨脅迫時(shí)間延長(zhǎng),葉片Ci呈持續(xù)上升趨勢(shì),但各處理下的增幅不同。脅迫至10 d后,Ci隨CaCl2處理濃度的增加呈先降后升的趨勢(shì)。脅迫至20 d,各處理下Ci差異顯著,其中T4增幅最小,相對(duì)于CK,增幅為44.03%。
圖1-D可知,T337砧木葉片的Gs隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)呈持續(xù)下降趨勢(shì),脅迫至20 d,各處理下的Gs降至最低值,均顯著低于CK,其中T2降幅最小,為CK的44.97%,以T2處理效果最佳。
由圖2-A、B、C可知,隨脅迫時(shí)間的持續(xù),T337葉片的F0、Fv/Fm、ETR均呈持續(xù)下降的趨勢(shì),且具有明顯的濃度效應(yīng),即不同濃度的CaCl2均能夠有效降低脅迫對(duì)植株光合的影響,但不同濃度下其降幅不同。脅迫至20 d,各處理下的F0、Fv/Fm、ETR降至最低值且各處理之間差異顯著。與CK相比,F(xiàn)0在T4下降幅最小,為45.17%,F(xiàn)v/Fm在T5下降幅最小,為48.92%;與T1相比,ETR在T3下升幅最大,為8.51%。
隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng),T337葉片的SPAD呈持續(xù)下降的趨勢(shì),不同處理下SPAD的降幅不同(圖2-D)。脅迫5 d后,各處理下SPAD均顯著低于CK且差異顯著。脅迫至20 d,各處理下SPAD下降至最低值,分別為57.94(T2),56.39(T3),58.99(T4),57.06(T5),與T1相比,SPAD分別提高3.08%,1.80%,5.49%,2.03%,其中,以T4處理下效果最好。
由圖3可知,隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng),REC呈持續(xù)升高的趨勢(shì),在脅迫至15 d各處理之間差異顯著。脅迫至20 d,CaCl2處理下REC達(dá)到最大值。相對(duì)于CK,T4處理下葉片REC上升了14.76百分點(diǎn)。
脅迫0~15 d,T2~T5處理下Pro含量隨CaCl2濃度的增加呈下降趨勢(shì)。脅迫至20 d,T1處理使Pro含量降至最低值,T3處理下Pro含量最高,與CK相比,T3處理下Pro含量上升了43.67%。
圖4-A顯示,各處理下的MDA含量隨鹽脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)呈持續(xù)上升的趨勢(shì),且不同濃度下增幅不同。脅迫至20 d,葉片MDA含量達(dá)到峰值,各個(gè)處理下MDA含量均顯著高于CK(P<0.05),分別為CK的2.19(T2),2.05(T3),1.88(T4),2.11倍(T5),其中以T4效果最佳。
隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng),葉片的CAT活性呈先升后降趨勢(shì)(圖4-B)。脅迫至15 d,葉片CAT活性在各處理下達(dá)到峰值,分別為229.678(T2),209.151(T3),230.611(T4),210.712(T5)。脅迫至20 d,CAT活性降至最低,各處理下CAT活性均顯著低于CK(P<0.05),顯著高于T1,與T1(125.266 U/(g·min))相比,T2~T5處理升幅分別為14.26%,20.04%,11.15%,3.16%,以T3效果最為顯著。
由圖4-C、D可知,鹽脅迫下T337葉片的SOD和POD活性均呈先升后降的趨勢(shì)。各處理分別在脅迫10 d達(dá)到峰值后不斷下降,且隨CaCl2濃度的增加,其活性也表現(xiàn)出先升后降的趨勢(shì)。脅迫至20 d,SOD和POD活性在各處理下降至最低,均顯著高于T1(P<0.05),與T1相比,T4處理升幅最大,升幅分別為37.30%(SOD),36.05%(POD)。
2.5.1 相關(guān)性分析 利用SPSS軟件對(duì)鹽脅迫后的14個(gè)指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析,獲得相關(guān)系數(shù)矩陣(表2)。結(jié)果表明,T337砧木的Pn與Tr、Gs、F0、Fv/Fm、ETR、SPAD呈極顯著正相關(guān)(P<0.01),與MDA、Ci、REC呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01),與CAT呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。表明可以用Pn、Tr、Gs、F0、Fv/Fm、ETR、SPAD、MDA、Ci、REC等指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)外源CaCl2對(duì)T337在鹽脅迫下的緩解程度。
2.5.2 主成分分析 為綜合評(píng)價(jià)鹽脅迫下不同濃度外源CaCl2對(duì)蘋(píng)果砧木T337生理特性的影響,將脅迫后的14個(gè)耐鹽指標(biāo)進(jìn)行主成分分析,并提取特征值大于1的2個(gè)主成分(特征值分別為11.190,2.295)(表3)。第一、二主成分的方差貢獻(xiàn)率依次為79.930%,16.394%,累計(jì)方差貢獻(xiàn)率達(dá)到96.324%,符合分析要求。第一主成分代表了SPAD、ETR、POD、CAT、Pn、Ci、Gs、Tr、F0和Fv/Fm等10個(gè)指標(biāo),第二主成分綜合了REC、MDA、SOD和Pro等指標(biāo),說(shuō)明鈣對(duì)鹽脅迫下植株的調(diào)節(jié)主要是通過(guò)提高葉綠素含量和增強(qiáng)葉片光合能力,其次是通過(guò)提高滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量來(lái)增強(qiáng)耐鹽性。
表3 主成分分析方差解釋Tab.3 Total variance explained
綜合得分(F)是每個(gè)主成分得分與對(duì)應(yīng)貢獻(xiàn)率的乘積之和,即:F=F1×79.930%+F2×16.394%。由表4可知,各處理下的綜合得分分別為1.516 57(CK)、-0.887 92(T1)、-0.314 76(T2)、-0.115 08(T3)、0.133 29(T4)、-0.332 11(T5)。因此,鹽脅迫下不同濃度外源CaCl2對(duì)蘋(píng)果砧木T337葉片生理特性的影響排名依次為:CK>T4>T3>T2>T5>T1。
表4 蘋(píng)果葉片在不同濃度CaCl2處理下的綜合得分及排名Tab.4 The comprehensive score and ranking of apple leaves treated with different concentrations of exogenous calcium chloride
葉綠素含量會(huì)直接影響植物耐鹽性[20],鹽脅迫會(huì)破壞葉綠體結(jié)構(gòu),直接或間接影響葉綠素含量[21]。本試驗(yàn)中,T337砧木葉片的葉綠素含量在鹽脅迫后顯著下降,可能是鹽脅迫破壞了葉綠體結(jié)構(gòu),抑制了光合色素的生成[22],這與李青云等[23]在草莓中的研究結(jié)論相一致;施加外源CaCl2后,其葉綠素含量降幅減緩,可能是CaCl2維持了良好的葉綠體片層結(jié)構(gòu),保持其結(jié)構(gòu)完整性,這與劉藝平等[24]提出CaCl2可調(diào)節(jié)葉綠素合成觀點(diǎn)一致。
光合作用對(duì)保障植物正常生長(zhǎng)發(fā)育有重要意義[25],研究發(fā)現(xiàn),在植物遭受逆境時(shí),氣孔限制或非氣孔限制都會(huì)引起植物光合速率的下降[26]。氣孔限制是由于CO2進(jìn)入葉片受阻所致,非氣孔限制則是由于光合細(xì)胞機(jī)構(gòu)和功能受損所致[27];本研究發(fā)現(xiàn),NaCl脅迫下T337砧木葉片的Pn和Gs均隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)呈下降的趨勢(shì),Ci卻升高,說(shuō)明該光合速率的下降是由氣孔限制所致,這可能是鹽脅迫使葉片氣孔下腔到葉綠體羧化點(diǎn)CO2的路徑受損,導(dǎo)致葉片氣孔導(dǎo)度降低和葉片蒸騰速率下降[28]。
施加外源CaCl2后,Gs和Pn降幅減小,Ci逐漸下降,說(shuō)明Ca2+可通過(guò)改善氣孔開(kāi)張程度來(lái)提高植株光合性能,這與Farquhar等[29]觀點(diǎn)相同。葉綠素?zé)晒鈪?shù)在一定程度上可反映環(huán)境對(duì)光合作用的影響,一般認(rèn)為,F(xiàn)0降低表明PS Ⅱ天線色素的熱耗散增加,而F0升高表明PS Ⅱ反應(yīng)中心受到傷害[30]。Fv/Fm的變化反映脅迫下PS Ⅱ的損傷程度,F(xiàn)v/Fm下降越多,表示PS Ⅱ損傷越大[31]。在本試驗(yàn)中,隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng),T337葉片的F0、Fv/Fm和ETR均逐漸降低,說(shuō)明鹽脅迫破壞了PS Ⅱ反應(yīng)中心,電子傳遞效率下降。噴施CaCl2后,T337砧木光合性能得到有效改善,并具有明顯的濃度效應(yīng),這與張士功等[32]在小麥上的研究結(jié)果一致,說(shuō)明外源CaCl2可緩解鹽脅迫對(duì)PS Ⅱ系統(tǒng)的損傷,維持PS Ⅱ光化學(xué)活性及光合電子傳遞的正常進(jìn)行,從而維持較高的光合效率。
MDA和REC是反映逆境脅迫對(duì)植物細(xì)胞膜脂過(guò)氧化傷害程度的重要指標(biāo)[33]。本研究中,鹽脅迫下T337葉片REC、MDA含量均顯著增加,表明脅迫下可能加劇了細(xì)胞膜脂過(guò)氧化程度,質(zhì)膜遭到破壞[34]。噴施外源CaCl2后,REC下降、MDA含量顯著降低,這可能是鈣與磷脂和蛋白質(zhì)結(jié)合影響膜的相變和流動(dòng)性,導(dǎo)致膜透性降低,同時(shí)鈣離子緩解細(xì)胞膜脂過(guò)氧化程度減緩了MDA生成,這與Yang等[35]在黃瓜幼苗中研究結(jié)論一致。研究表明,逆境脅迫會(huì)促進(jìn)植物積累大量脯氨酸來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外滲透壓,以維持細(xì)胞的動(dòng)態(tài)平衡[36-37]。本試驗(yàn)中,脯氨酸含量隨脅迫時(shí)間延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì),可能是鹽脅迫激活脯氨酸合成酶并抑制脯氨酸降解酶,使得脯氨酸大量積累[38];在噴施外源CaCl2后,T337葉片的脯氨酸含量顯著高于未施CaCl2處理,這與黃健等[39]、周雙云等[40]在豌豆和巴西蕉研究結(jié)果一致,可能是Ca2+參與了脯氨酸的另一條合成路徑,促進(jìn)鳥(niǎo)氨酸和精氨酸的合成[41],從而加速脯氨酸的積累。非生物脅迫下,植物自身會(huì)啟動(dòng)酶促和非酶促兩類保護(hù)系統(tǒng)來(lái)減輕或消除活性氧自由基的傷害[42-43],SOD、POD活性通常表現(xiàn)出先升后降的趨勢(shì)[44],本研究中,T337葉片在鹽脅迫下POD、SOD、CAT均呈先升后降趨勢(shì),這可能是長(zhǎng)期鹽脅迫下過(guò)氧化程度加劇,質(zhì)膜受損所致[45];噴施CaCl2后,T337砧木葉片的POD、SOD降幅減小,可能是Ca2+緩解了自由基對(duì)膜的破壞,從而維持細(xì)胞內(nèi)正常的活性氧水平,這與王策[46]在酸棗中的研究結(jié)果相似,說(shuō)明鈣對(duì)抗氧化酶的保護(hù)可能是Ca2+可以與鈣調(diào)蛋白結(jié)合增強(qiáng)過(guò)氧化酶的活性,相比之下,關(guān)于鈣在鹽脅迫下促進(jìn)脯氨酸積累的機(jī)制尚不明確,有待下一步深入研究。
植物耐鹽性的強(qiáng)弱取決于多種因素的共同作用,本試驗(yàn)對(duì)鹽脅迫后T337葉片的14個(gè)生理指標(biāo)進(jìn)行抗鹽性綜合評(píng)價(jià),通過(guò)相關(guān)性和主成分分析得出外源CaCl2調(diào)節(jié)T337抗鹽性的主要生理指標(biāo),同時(shí)可知,鹽脅迫下不同濃度外源CaCl2對(duì)T337生理特性的影響排名依次為:T4>T3>T2>T5。
鹽脅迫下,外源CaCl2可通過(guò)維持植物葉綠體片層結(jié)構(gòu)保持較強(qiáng)的光合效率,通過(guò)改善抗氧化酶活性和調(diào)節(jié)滲透物質(zhì)的積累,從而清除過(guò)量的活性氧,以提高生物膜的穩(wěn)定性來(lái)緩解鹽脅迫對(duì)植株的傷害,且具有濃度效應(yīng)。10 mmol/L CaCl2能有效改善蘋(píng)果砧木T337的耐鹽性。