高彥龍，張 德，張 瑞，張仲興，趙 婷，王雙成，王延秀

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

蘋(píng)果(MalusdomesticaBorkh.)是我國(guó)西北地區(qū)重要的經(jīng)濟(jì)果品[1]，但該地區(qū)日趨加劇的土壤鹽漬化嚴(yán)重制約了蘋(píng)果產(chǎn)業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展，影響果實(shí)產(chǎn)量和品質(zhì)的形成[2]。生產(chǎn)發(fā)現(xiàn)，一定濃度的硝普鈉(SNP)、亞精胺(Spd)和水楊酸(SA)能夠提高麻黃幼苗的抗鹽性能[3]，外源SAM(S腺苷甲硫氨酸)也可顯著緩解鹽脅迫對(duì)植株的傷害[4]。故適宜的外源物質(zhì)對(duì)植物在逆境下生長(zhǎng)具有重要意義。

在生產(chǎn)中應(yīng)用外源物質(zhì)以期提高植物抗逆性的研究已成為焦點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，外源鈣處理可增強(qiáng)干旱脅迫下水稻的滲透調(diào)節(jié)能力，使其保持較高的組織含水量[5]，趙小紅[6]發(fā)現(xiàn)外源CaCl2處理可增加植株脯氨酸和SSC含量，從而提高其抗旱性；低溫容易引起植物細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的破壞，而鈣離子可與磷脂發(fā)生聚合作用，來(lái)增強(qiáng)膜的硬度和完整性[7]，以上研究均表明，適宜濃度的CaCl2可減緩干旱及低溫脅迫對(duì)植物造成的傷害。鹽脅迫下，外源CaCl2處理可提高百合體內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量及抗氧化酶活性[8]，還會(huì)引起質(zhì)膜上Ca2+內(nèi)流，從而激活SOS、CBL-CIPK等通路以增強(qiáng)耐鹽性[9]；此外，張浩等[10]在玉米的研究中證實(shí)外源CaCl2可改變氣孔結(jié)構(gòu)特征增強(qiáng)葉片光合作用，提高其耐鹽性。目前，外源CaCl2在植物鹽脅迫中的應(yīng)用多集中蔬菜[11]和主要的糧食作物[12-13]上，在梨[14]、酸棗[15]等木本植物中也有研究，而在蘋(píng)果砧木逆境脅迫中鮮見(jiàn)應(yīng)用及報(bào)道。

T337是英國(guó)東茂林試驗(yàn)站選育的優(yōu)良矮化砧木，蘋(píng)果生產(chǎn)中應(yīng)用較廣，具有育苗簡(jiǎn)單、苗圃整齊、結(jié)果早、產(chǎn)量高、品質(zhì)優(yōu)等特點(diǎn)[16]。本試驗(yàn)以T337為試材，研究鹽脅迫下外源噴施不同濃度CaCl2對(duì)其葉片光合及生理特性影響，并利用主成分綜合評(píng)價(jià)不同濃度間效果，以期為CaCl2在蘋(píng)果砧木抗性研究及栽培生產(chǎn)中提供理論依據(jù)，從而實(shí)現(xiàn)蘋(píng)果高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)栽培。

1 材料和方法

1.1 材料與處理

本試驗(yàn)于2020年5-9月在甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)(N 36°1′～37°9′，E 106°21′～107°44′)避雨棚中進(jìn)行，選擇長(zhǎng)勢(shì)相似且生長(zhǎng)健壯的二年生蘋(píng)果砧木T337 90株，栽植于盛裝3.5 kg基質(zhì)(蛭石∶珍珠巖∶泥炭=1∶1∶3，按比例混合后鈣含量約為0.02 mg/kg，對(duì)試驗(yàn)的影響可忽略不計(jì))、質(zhì)量約為0.65 kg的大營(yíng)養(yǎng)缽中(25 cm×38 cm)，每盆一株，置于避雨棚中統(tǒng)一管理。

試驗(yàn)共設(shè)6個(gè)處理(表1)，對(duì)照(CK)澆灌去離子水，T2～T5處理澆灌鹽溶液，每個(gè)處理3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)5株。各處理均隔7 d分別澆灌4 L去離子水和鹽溶液，在澆灌鹽溶液的同時(shí)，CK和T1葉面噴施200 mL去離子水，對(duì)T2～T5處理每盆葉面噴施相同體積的CaCl2溶液。此外，噴施時(shí)間一般選擇晴天的清晨(9∶00-10∶30)進(jìn)行，從脅迫處理次日開(kāi)始，第1次取樣時(shí)間為2020年5月11日，后每隔5 d取生長(zhǎng)一致的幼苗頂端相同節(jié)位葉片進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定。

表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案Tab.1 Test design scheme

1.2 生理指標(biāo)的測(cè)定

1.2.1 葉綠素含量的測(cè)定 相對(duì)葉綠素含量(SPAD)用SPAD-502葉綠素計(jì)測(cè)量，使用前進(jìn)行校準(zhǔn)。于脅迫0，5，10，15，20 d后，采植株中上部大葉節(jié)以上的功能性葉片，洗凈擦干表面污物，選用中脈兩邊寬度一致且對(duì)稱的葉片進(jìn)行指標(biāo)測(cè)定，重復(fù)3次，取平均值。

1.2.2 光合及熒光參數(shù)的測(cè)定 光合參數(shù)測(cè)定：光合特性在早晨9：00-11：00測(cè)定，于脅迫0，5，10，15，20 d后選取向陽(yáng)枝條上的成熟功能葉片，使用 LI-6400XT便攜式開(kāi)放氣體交換器系統(tǒng)(Li-COR Biosciences，Lincoln，美國(guó))測(cè)定凈光合速率(Pn)、蒸騰速率(Tr)、胞間CO2(Ci)、氣孔導(dǎo)度(Gs)，光合有效輻射為400～600 μmol/(m2·s)，葉室內(nèi)空氣流量設(shè)定為500 mL/min，室內(nèi)CO2濃度為(385±10)μL/L，每個(gè)處理選取3株。

熒光參數(shù)測(cè)定：暗處理30 min后使用Imag-ing-Pam葉綠素?zé)晒庥?jì)和成像WinGegE軟件(Walz，Effeltrich，德國(guó))測(cè)定初始熒光(F0)、PSⅡ最大光能轉(zhuǎn)化率 (Fv/Fm)、光合電子傳遞效率(ETR)的變化，測(cè)定時(shí)間與光合參數(shù)測(cè)定同步。

1.2.3 抗氧化酶活性及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的測(cè)定 在脅迫0，5，10，15，20 d后，采取植株中上部大葉節(jié)以上的功能性葉片，用蒸餾水洗凈并去除葉脈磨碎，用于測(cè)定生理指標(biāo)。相對(duì)電導(dǎo)率采用電導(dǎo)儀法[17]；超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)參照Singh等[18]的方法測(cè)定；丙二醛(MDA)、脯氨酸含量參照Rozi等[19]的方法測(cè)定，重復(fù)3次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 22.0(BM，Armonk，NY，美國(guó))進(jìn)行顯著性分析、相關(guān)性和主成分分析，Origin 9.1軟件(OriginLab，Hampton，MA，美國(guó))作圖。顯著性分析檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)差異，Duncan檢驗(yàn)比較平均差異(P< 0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽脅迫下外源CaCl2處理對(duì)T337葉片光合特性影響

由圖1-A可知，隨著鹽脅迫的持續(xù)，葉片的Tr呈持續(xù)下降趨勢(shì)，具有明顯濃度效應(yīng)。脅迫至20 d，T2～T5處理下的Tr降至最低，分別為1.39，1.32，1.54，1.29 mmol/(m2·s)，均顯著高于T1(1.21 mmol/(m2·s)，顯著低于CK(2.42 mmol/(m2·s))。相較于T1，Tr分別提高了14.88%(T2)，9.09%(T3)，27.27%(T4)，6.61%(T5)，以T4處理效果最佳。

葉片的Pn呈現(xiàn)出與Tr相同的趨勢(shì)，且在同一時(shí)間點(diǎn)Tr隨CaCl2處理濃度的增加呈先升后降的趨勢(shì)(圖1-B)。脅迫至20 d，各處理Pn降至最低值，其中T4處理值最高(3.45 μmol/(m2·s))，T2處理值最低(3.14 μmol/(m2·s))，均顯著高于T1(3.02 μmol/(m2·s))，相對(duì)于T1，T2和T4處理Pn增幅分別為3.97%，14.24%。

由圖1-C可得，隨脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，葉片Ci呈持續(xù)上升趨勢(shì)，但各處理下的增幅不同。脅迫至10 d后，Ci隨CaCl2處理濃度的增加呈先降后升的趨勢(shì)。脅迫至20 d，各處理下Ci差異顯著，其中T4增幅最小，相對(duì)于CK，增幅為44.03%。

圖1-D可知，T337砧木葉片的Gs隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)呈持續(xù)下降趨勢(shì)，脅迫至20 d，各處理下的Gs降至最低值，均顯著低于CK，其中T2降幅最小，為CK的44.97%，以T2處理效果最佳。

2.2 鹽脅迫下外源CaCl2處理對(duì)T337葉片熒光特性和相對(duì)葉綠素含量的影響

由圖2-A、B、C可知，隨脅迫時(shí)間的持續(xù)，T337葉片的F0、Fv/Fm、ETR均呈持續(xù)下降的趨勢(shì)，且具有明顯的濃度效應(yīng)，即不同濃度的CaCl2均能夠有效降低脅迫對(duì)植株光合的影響，但不同濃度下其降幅不同。脅迫至20 d，各處理下的F0、Fv/Fm、ETR降至最低值且各處理之間差異顯著。與CK相比，F(xiàn)0在T4下降幅最小，為45.17%，F(xiàn)v/Fm在T5下降幅最小，為48.92%；與T1相比，ETR在T3下升幅最大，為8.51%。

隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，T337葉片的SPAD呈持續(xù)下降的趨勢(shì)，不同處理下SPAD的降幅不同(圖2-D)。脅迫5 d后，各處理下SPAD均顯著低于CK且差異顯著。脅迫至20 d，各處理下SPAD下降至最低值，分別為57.94(T2)，56.39(T3)，58.99(T4)，57.06(T5)，與T1相比，SPAD分別提高3.08%，1.80%，5.49%，2.03%，其中，以T4處理下效果最好。

2.3 鹽脅迫下外源CaCl2處理對(duì)T337葉片Pro、REC的影響

由圖3可知，隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，REC呈持續(xù)升高的趨勢(shì)，在脅迫至15 d各處理之間差異顯著。脅迫至20 d，CaCl2處理下REC達(dá)到最大值。相對(duì)于CK，T4處理下葉片REC上升了14.76百分點(diǎn)。

脅迫0～15 d，T2～T5處理下Pro含量隨CaCl2濃度的增加呈下降趨勢(shì)。脅迫至20 d，T1處理使Pro含量降至最低值，T3處理下Pro含量最高，與CK相比，T3處理下Pro含量上升了43.67%。

2.4 鹽脅迫下外源CaCl2處理對(duì)T337葉片MDA含量和抗氧化酶活性的影響

圖4-A顯示，各處理下的MDA含量隨鹽脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)呈持續(xù)上升的趨勢(shì)，且不同濃度下增幅不同。脅迫至20 d，葉片MDA含量達(dá)到峰值，各個(gè)處理下MDA含量均顯著高于CK(P<0.05)，分別為CK的2.19(T2)，2.05(T3)，1.88(T4)，2.11倍(T5)，其中以T4效果最佳。

隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，葉片的CAT活性呈先升后降趨勢(shì)(圖4-B)。脅迫至15 d，葉片CAT活性在各處理下達(dá)到峰值，分別為229.678(T2)，209.151(T3)，230.611(T4)，210.712(T5)。脅迫至20 d，CAT活性降至最低，各處理下CAT活性均顯著低于CK(P<0.05)，顯著高于T1，與T1(125.266 U/(g·min))相比，T2～T5處理升幅分別為14.26%，20.04%，11.15%，3.16%，以T3效果最為顯著。

由圖4-C、D可知，鹽脅迫下T337葉片的SOD和POD活性均呈先升后降的趨勢(shì)。各處理分別在脅迫10 d達(dá)到峰值后不斷下降，且隨CaCl2濃度的增加，其活性也表現(xiàn)出先升后降的趨勢(shì)。脅迫至20 d，SOD和POD活性在各處理下降至最低，均顯著高于T1(P<0.05)，與T1相比，T4處理升幅最大，升幅分別為37.30%(SOD)，36.05%(POD)。

2.5 外源CaCl2對(duì)鹽脅迫下蘋(píng)果砧木T337葉片生理效應(yīng)的綜合評(píng)價(jià)

2.5.1 相關(guān)性分析 利用SPSS軟件對(duì)鹽脅迫后的14個(gè)指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析，獲得相關(guān)系數(shù)矩陣(表2)。結(jié)果表明，T337砧木的Pn與Tr、Gs、F0、Fv/Fm、ETR、SPAD呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，與MDA、Ci、REC呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)，與CAT呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。表明可以用Pn、Tr、Gs、F0、Fv/Fm、ETR、SPAD、MDA、Ci、REC等指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)外源CaCl2對(duì)T337在鹽脅迫下的緩解程度。

2.5.2 主成分分析 為綜合評(píng)價(jià)鹽脅迫下不同濃度外源CaCl2對(duì)蘋(píng)果砧木T337生理特性的影響，將脅迫后的14個(gè)耐鹽指標(biāo)進(jìn)行主成分分析，并提取特征值大于1的2個(gè)主成分(特征值分別為11.190，2.295)(表3)。第一、二主成分的方差貢獻(xiàn)率依次為79.930%，16.394%，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率達(dá)到96.324%，符合分析要求。第一主成分代表了SPAD、ETR、POD、CAT、Pn、Ci、Gs、Tr、F0和Fv/Fm等10個(gè)指標(biāo)，第二主成分綜合了REC、MDA、SOD和Pro等指標(biāo)，說(shuō)明鈣對(duì)鹽脅迫下植株的調(diào)節(jié)主要是通過(guò)提高葉綠素含量和增強(qiáng)葉片光合能力，其次是通過(guò)提高滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量來(lái)增強(qiáng)耐鹽性。

表3 主成分分析方差解釋Tab.3 Total variance explained

綜合得分(F)是每個(gè)主成分得分與對(duì)應(yīng)貢獻(xiàn)率的乘積之和，即：F=F1×79.930%+F2×16.394%。由表4可知，各處理下的綜合得分分別為1.516 57(CK)、-0.887 92(T1)、-0.314 76(T2)、-0.115 08(T3)、0.133 29(T4)、-0.332 11(T5)。因此，鹽脅迫下不同濃度外源CaCl2對(duì)蘋(píng)果砧木T337葉片生理特性的影響排名依次為：CK>T4>T3>T2>T5>T1。

表4 蘋(píng)果葉片在不同濃度CaCl2處理下的綜合得分及排名Tab.4 The comprehensive score and ranking of apple leaves treated with different concentrations of exogenous calcium chloride

3 討論與結(jié)論

葉綠素含量會(huì)直接影響植物耐鹽性[20]，鹽脅迫會(huì)破壞葉綠體結(jié)構(gòu)，直接或間接影響葉綠素含量[21]。本試驗(yàn)中，T337砧木葉片的葉綠素含量在鹽脅迫后顯著下降，可能是鹽脅迫破壞了葉綠體結(jié)構(gòu)，抑制了光合色素的生成[22]，這與李青云等[23]在草莓中的研究結(jié)論相一致；施加外源CaCl2后，其葉綠素含量降幅減緩，可能是CaCl2維持了良好的葉綠體片層結(jié)構(gòu)，保持其結(jié)構(gòu)完整性，這與劉藝平等[24]提出CaCl2可調(diào)節(jié)葉綠素合成觀點(diǎn)一致。

光合作用對(duì)保障植物正常生長(zhǎng)發(fā)育有重要意義[25]，研究發(fā)現(xiàn)，在植物遭受逆境時(shí)，氣孔限制或非氣孔限制都會(huì)引起植物光合速率的下降[26]。氣孔限制是由于CO2進(jìn)入葉片受阻所致，非氣孔限制則是由于光合細(xì)胞機(jī)構(gòu)和功能受損所致[27]；本研究發(fā)現(xiàn)，NaCl脅迫下T337砧木葉片的Pn和Gs均隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)呈下降的趨勢(shì)，Ci卻升高，說(shuō)明該光合速率的下降是由氣孔限制所致，這可能是鹽脅迫使葉片氣孔下腔到葉綠體羧化點(diǎn)CO2的路徑受損，導(dǎo)致葉片氣孔導(dǎo)度降低和葉片蒸騰速率下降[28]。

施加外源CaCl2后，Gs和Pn降幅減小，Ci逐漸下降，說(shuō)明Ca2+可通過(guò)改善氣孔開(kāi)張程度來(lái)提高植株光合性能，這與Farquhar等[29]觀點(diǎn)相同。葉綠素?zé)晒鈪?shù)在一定程度上可反映環(huán)境對(duì)光合作用的影響，一般認(rèn)為，F(xiàn)0降低表明PS Ⅱ天線色素的熱耗散增加，而F0升高表明PS Ⅱ反應(yīng)中心受到傷害[30]。Fv/Fm的變化反映脅迫下PS Ⅱ的損傷程度，F(xiàn)v/Fm下降越多，表示PS Ⅱ損傷越大[31]。在本試驗(yàn)中，隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，T337葉片的F0、Fv/Fm和ETR均逐漸降低，說(shuō)明鹽脅迫破壞了PS Ⅱ反應(yīng)中心，電子傳遞效率下降。噴施CaCl2后，T337砧木光合性能得到有效改善，并具有明顯的濃度效應(yīng)，這與張士功等[32]在小麥上的研究結(jié)果一致，說(shuō)明外源CaCl2可緩解鹽脅迫對(duì)PS Ⅱ系統(tǒng)的損傷，維持PS Ⅱ光化學(xué)活性及光合電子傳遞的正常進(jìn)行，從而維持較高的光合效率。

MDA和REC是反映逆境脅迫對(duì)植物細(xì)胞膜脂過(guò)氧化傷害程度的重要指標(biāo)[33]。本研究中，鹽脅迫下T337葉片REC、MDA含量均顯著增加，表明脅迫下可能加劇了細(xì)胞膜脂過(guò)氧化程度，質(zhì)膜遭到破壞[34]。噴施外源CaCl2后，REC下降、MDA含量顯著降低，這可能是鈣與磷脂和蛋白質(zhì)結(jié)合影響膜的相變和流動(dòng)性，導(dǎo)致膜透性降低，同時(shí)鈣離子緩解細(xì)胞膜脂過(guò)氧化程度減緩了MDA生成，這與Yang等[35]在黃瓜幼苗中研究結(jié)論一致。研究表明，逆境脅迫會(huì)促進(jìn)植物積累大量脯氨酸來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外滲透壓，以維持細(xì)胞的動(dòng)態(tài)平衡[36-37]。本試驗(yàn)中，脯氨酸含量隨脅迫時(shí)間延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)，可能是鹽脅迫激活脯氨酸合成酶并抑制脯氨酸降解酶，使得脯氨酸大量積累[38]；在噴施外源CaCl2后，T337葉片的脯氨酸含量顯著高于未施CaCl2處理，這與黃健等[39]、周雙云等[40]在豌豆和巴西蕉研究結(jié)果一致，可能是Ca2+參與了脯氨酸的另一條合成路徑，促進(jìn)鳥(niǎo)氨酸和精氨酸的合成[41]，從而加速脯氨酸的積累。非生物脅迫下，植物自身會(huì)啟動(dòng)酶促和非酶促兩類保護(hù)系統(tǒng)來(lái)減輕或消除活性氧自由基的傷害[42-43]，SOD、POD活性通常表現(xiàn)出先升后降的趨勢(shì)[44]，本研究中，T337葉片在鹽脅迫下POD、SOD、CAT均呈先升后降趨勢(shì)，這可能是長(zhǎng)期鹽脅迫下過(guò)氧化程度加劇，質(zhì)膜受損所致[45]；噴施CaCl2后，T337砧木葉片的POD、SOD降幅減小，可能是Ca2+緩解了自由基對(duì)膜的破壞，從而維持細(xì)胞內(nèi)正常的活性氧水平，這與王策[46]在酸棗中的研究結(jié)果相似，說(shuō)明鈣對(duì)抗氧化酶的保護(hù)可能是Ca2+可以與鈣調(diào)蛋白結(jié)合增強(qiáng)過(guò)氧化酶的活性，相比之下，關(guān)于鈣在鹽脅迫下促進(jìn)脯氨酸積累的機(jī)制尚不明確，有待下一步深入研究。

植物耐鹽性的強(qiáng)弱取決于多種因素的共同作用，本試驗(yàn)對(duì)鹽脅迫后T337葉片的14個(gè)生理指標(biāo)進(jìn)行抗鹽性綜合評(píng)價(jià)，通過(guò)相關(guān)性和主成分分析得出外源CaCl2調(diào)節(jié)T337抗鹽性的主要生理指標(biāo)，同時(shí)可知，鹽脅迫下不同濃度外源CaCl2對(duì)T337生理特性的影響排名依次為：T4>T3>T2>T5。

鹽脅迫下，外源CaCl2可通過(guò)維持植物葉綠體片層結(jié)構(gòu)保持較強(qiáng)的光合效率，通過(guò)改善抗氧化酶活性和調(diào)節(jié)滲透物質(zhì)的積累，從而清除過(guò)量的活性氧，以提高生物膜的穩(wěn)定性來(lái)緩解鹽脅迫對(duì)植株的傷害，且具有濃度效應(yīng)。10 mmol/L CaCl2能有效改善蘋(píng)果砧木T337的耐鹽性。