吳婷婷，陳海龍，黃 俊，梁 毅，張 婷，李博文，賴怡帆，鄒玉瑩，車凡昊，吳 俊，劉金靈，2，3，劉雄倫，2，3

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.作物基因工程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410128；3.水稻油菜抗病育種湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410128；4.湖南雜交水稻研究中心，湖南 長沙 410125)

水稻(Oryzasativa)是人類賴以生存的重要糧食作物。由子囊真菌(Magnaportheoryzae)引起的稻瘟病(Rice blast)，是水稻生產(chǎn)中的主要病害，全球至少有80個(gè)國家報(bào)道了稻瘟病的發(fā)生[1]，近年來我國稻瘟病年發(fā)生面積約500萬hm2[2]。稻瘟病危害不僅減產(chǎn)，而且防治稻瘟病大量使用殺菌劑也增加了水稻的生產(chǎn)成本，同時(shí)破壞水土生態(tài)環(huán)境。因此，利用已鑒定的抗性基因培育推廣抗病水稻品種，是防控稻瘟病最經(jīng)濟(jì)有效和綠色環(huán)保的對策。廣譜持久抗稻瘟病基因Pi9來源于小粒野生稻(Oryzaminuta)，經(jīng)遠(yuǎn)緣雜交導(dǎo)入到秈稻品系75-1-127，之后被精細(xì)定位到水稻6號染色體的Pi2/9位點(diǎn)，并被成功克隆[3-4]。而分子標(biāo)記輔助選擇育種的選擇效率高、操作較簡單、相對成本較低，通過篩選還能獲得農(nóng)藝性狀、產(chǎn)量和品質(zhì)性狀都比較優(yōu)良的后代，因此，尤其備受育種家們青睞。目前，Pi9基因已被廣泛應(yīng)用于水稻稻瘟病抗性改良的育種實(shí)踐，如李永聰?shù)萚5]利用Pi9基因通過MAS回交育種改良水稻恢復(fù)系R389的稻瘟病抗性。本研究以75-1-127為Pi9基因供體，先后用三系保持系豐源B及其不育系豐源A為受體親本，利用Pi9基因內(nèi)特異功能標(biāo)記，通過分子標(biāo)記輔助選擇(MolecularMarker-assistedSelection，MAS)，定向改良豐源A及其保持系豐源B的稻瘟病抗性。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

水稻材料：秈稻品系75-1-127，Pi9基因供體；三系不育系豐源A及其保持系豐源B，Pi9基因受體；水稻品系CO39，稻瘟病感病對照。

稻瘟菌：33份來自國內(nèi)外的稻瘟菌菌株，用于抗菌譜分析。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 稻瘟病抗性表型鑒定與抗菌譜分析 稻瘟病室內(nèi)人工接種：分別用33份稻瘟菌菌株接種豐源B、豐源A、75-1-127和CO39，調(diào)查苗瘟抗性表型、分析抗菌譜。接種方法及抗性分級分類標(biāo)準(zhǔn)參考廖花等[6]的方法，用33份國內(nèi)外不同稻區(qū)的稻瘟菌菌株，人工氣候室內(nèi)接種豐源A、豐源B和75-1-127，并以CO39作感病對照。在人工氣候室內(nèi)用塑料育苗盤播種供試水稻材料，溫度控制在 26～28 ℃，待水稻苗長至3葉1心時(shí)期，用 0.025%的Tween20水溶液將稻瘟菌分生孢子配制成密度約為1×105個(gè)/mL的單菌株孢子懸浮液進(jìn)行噴霧接種。先在避光、保濕、26 ℃條件下培養(yǎng) 24 h；然后在12 h光照、高濕條件下誘導(dǎo)發(fā)病 5～6 d,調(diào)查發(fā)病情況。其中0～2級劃為抗病類型，3～5級劃為感病類型。

田間病圃苗瘟鑒定：參考廖花等[6]的方法，試驗(yàn)于2020年5月中旬，將供試水稻材料播種于湖南瀏陽大圍山稻瘟病病圃，6月13日調(diào)查苗瘟抗性，鑒定篩選優(yōu)異抗病純系。供試水稻材料包括親本、改良保持系和改良不育系，用CO39作誘發(fā)品種和感病對照。

1.2.2 標(biāo)記基因型分析 PCR模板DNA提?。河? mL滅菌離心管取候選水稻單株小分蘗葉片約0.2 g，液氮研磨后CTAB法提取總DNA[7]。具體操作步驟如下：將所取葉片用液氮速凍后研磨成粉，加入預(yù)熱至65 ℃左右的600 μL CTAB混合液，搖勻后65 ℃溫浴30 min。再加入600 μL氯仿，并放入離心機(jī)中以12 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，取上清液轉(zhuǎn)移至加有600 μL異丙醇的1.5 mL離心管中，隨后放到-20 ℃冰箱冷藏20 min，12 000 r/min轉(zhuǎn)速離心機(jī)中離心10 min后倒掉上清液，加入75%乙醇600 μL，離心洗滌2次。最后置于超凈臺(tái)上吹干或者靜置2～3 h風(fēng)干后，用100 μL蒸餾水溶解，藏于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

標(biāo)記基因型鑒定：用本團(tuán)隊(duì)開發(fā)的InDel共顯性專利標(biāo)記ClonDF1R1，鑒定各單株標(biāo)記基因型。PCR體系(10.0 μL)：模板DNA 1.0 μL，5 U/μLTaq酶0.1 μL，2.5 mmol/L dNTPs 0.2 μL，2 pmol/μL primer pairs 1.0 μL，10×Buffer 1.0 μL，ddH2O 6.7 μL。PCR熱循環(huán)參數(shù)：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物。

1.2.3 分子標(biāo)記輔助選擇育種實(shí)踐 用豐源B作母本及輪回親本，75-1-127作父本，2009-2015年在長沙和三亞兩地開展分子標(biāo)記輔助選擇連續(xù)回交育種，用ClonDF1R1(F：5′-ATCCACGAAACATCCACC

ATCC-3′；R：5′-GATTCGACAGATGGTGCAACA-3′)標(biāo)記基因型做Pi9基因前景選擇，用田間主要農(nóng)藝產(chǎn)量性狀代替單株基因組背景選擇，于2015年夏季獲得性狀整齊穩(wěn)定、高抗稻瘟病的BC6F4群體(株系)。2016年起，用豐源A作母本，用優(yōu)異改良豐源B保持系作父本及輪回親本，結(jié)合分子標(biāo)記輔助選擇，于2019年獲得穩(wěn)定的BC5F1群體，2020年經(jīng)稻瘟病抗性、田間農(nóng)藝產(chǎn)量性狀和不育特性鑒定分析，育成優(yōu)異改良抗病豐源A不育系。

1.2.4 不育系不育特性調(diào)查 參考田芳慧等[8]的方法，觀察調(diào)查豐源A和改良豐源A的不育特性：

柱頭外露率：不育系抽穗揚(yáng)花結(jié)束后，隨機(jī)選取30穗，調(diào)查總穎花數(shù)和柱頭外露穎花數(shù)(包括單邊外露和雙邊外露)，計(jì)算柱頭外露率。柱頭單邊外露率=柱頭單邊外露穎花數(shù)÷總穎花數(shù)×100%;柱頭雙邊外露率=柱頭雙邊外露穎花數(shù)÷總穎花數(shù)×100%；柱頭總外露率=柱頭單邊外露率+柱頭雙邊外露率。

自交結(jié)實(shí)率：不育系孕穗末期，隨機(jī)取10株用羊皮紙袋套袋，15 d后調(diào)查不育株率自交結(jié)實(shí)率。不育株率=不育株數(shù)÷30×100%；自交結(jié)實(shí)率=總結(jié)實(shí)粒數(shù)÷總穎花數(shù)×100%。

花粉鏡檢：不育系開花盛期，隨機(jī)取10個(gè)稻穗的混合花粉，1%I2-KI染色后鏡檢，觀察花粉育性及敗育類型。無花粉粒的即為無花粉型；有花粉粒的每個(gè)鏡片觀測3～5個(gè)視野，觀測花粉粒300個(gè)以上，觀察分析花粉育性及花粉粒類型，并計(jì)算花粉敗育度。圓形藍(lán)黑色的為正?；ǚ哿?；圓形不染色的為圓敗花粉粒，形狀不規(guī)則且不染色的為典敗花粉粒，兩者均為敗育花粉粒。

1.2.5 農(nóng)藝產(chǎn)量性狀調(diào)查 調(diào)查豐源B、豐源A、改良豐源B和改良豐源A群體的播始?xì)v期；每材料隨機(jī)取10株，調(diào)查株高和有效穗數(shù)，以及主穗總穎花數(shù)、劍葉長和劍葉寬，計(jì)算相應(yīng)平均值，記載標(biāo)準(zhǔn)參考應(yīng)存山[9]：播始?xì)v期是計(jì)算水稻從播種到長出始穗的天數(shù)；株高是測量從泥面至上部最長葉尖的長度；有效穗數(shù)是計(jì)算每株的單穗實(shí)粒數(shù)不少于10粒的稻穗；主穗總穎花數(shù)是指計(jì)數(shù)每株主穗的穎花總數(shù)；劍葉長是測量劍葉從葉枕到葉尖的長度，而劍葉寬則是測量劍葉最寬處的寬度。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試親本材料的苗瘟抗性表型及抗菌譜

33份供試稻瘟菌菌株室內(nèi)接種親本材料的抗性表型及抗菌譜結(jié)果見表1。Pi9基因供體親本75-1-127對日本菌株KOH、韓國菌株ROR1、中國菌株95097AZC13和X2007A-7 表現(xiàn)感病，對其余29份菌株表現(xiàn)抗病，抗性頻率為87.9%。豐源B和豐源A對11份菌株表現(xiàn)抗病(CHL438、CHL440、CHL473、87-4、110-2、195-2-2、RB14、M2006123A1、CHNOS60-2-3、KOH、KJ105)，而對其余22份菌株表現(xiàn)感病，抗性頻率為33.3%。2個(gè)受體親本的抗性表型和抗菌譜非常吻合，說明這2個(gè)材料的稻瘟病抗性受細(xì)胞核基因控制、且兩者核背景一致。有趣的是，4份對75-1-127致病菌株中的3份(X2007A-7、95097AZC13和ROR1)，對豐源B和豐源A也是致病的，但KOH對后者不致病，即供體親本和受體親本間存在交叉抗菌譜。感病對照CO39對33份供試菌株都表現(xiàn)感病。另一方面，田間病圃苗瘟抗性鑒定結(jié)果表明，75-1-127 表現(xiàn)高度抗病，而豐源B 和豐源A均高度感病(圖1)。以上結(jié)果表明，Pi9基因的稻瘟病抗性水平高抗菌譜較廣，并且與2個(gè)受體親本間存在交叉抗譜，可望通過MAS育種實(shí)踐，培育出抗性更好的新不育系及其保持系。

表1 親本材料稻瘟病抗性及抗菌譜Tab.1 Resistance and resistance spectrum of parental materials to 33 tested M.oryzae isolates

2.2 ClonDF1R1標(biāo)記輔助選擇育成抗病不育系豐源A-Pi9-5

根據(jù)Pi9基因序列信息開發(fā)了1個(gè)共顯性InDel標(biāo)記ClonDF1R1。該標(biāo)記從75-1-127基因組中擴(kuò)增出一條320 bp的亮帶，而對豐源B和豐源A基因組的擴(kuò)增產(chǎn)物大小均為450 bp左右(圖2)。利用ClonDF1R1開展連續(xù)多年的MAS育種實(shí)踐，于2015年夏季獲得性狀整齊穩(wěn)定、高抗稻瘟病的豐源B改良BC6F4群體(株系)17個(gè)，綜合各改良株系的農(nóng)藝產(chǎn)量性狀，篩選出1個(gè)穩(wěn)定的優(yōu)異抗病系豐源B-Pi9-5(圖1，2)。在此基礎(chǔ)上，用豐源B-Pi9-5與豐源A雜交并連續(xù)回交，經(jīng)ClonDF1R1標(biāo)記基因型鑒定，于2019年夏季獲得農(nóng)藝和遺傳性狀穩(wěn)定的BC5F1群體(系)，2020年經(jīng)病圃苗瘟抗性鑒定和農(nóng)藝產(chǎn)量性狀及不育特性調(diào)查分析，育成豐源B-Pi9-5的改良抗病不育系豐源A-Pi9-5(圖1，2)。

2.3 豐源A-Pi9-5不育特性

本試驗(yàn)結(jié)果表明，豐源A-Pi9-5與對照豐源A的不育株率均為100%，套袋自交結(jié)實(shí)率均為0；豐源A-Pi9-5的柱頭外露率為65.6%，與對照豐源A非常相近(67.1%)；2個(gè)不育系的花藥大小顏色非常相似，短小呈淺白色；花粉鏡檢表明，2個(gè)不育系花粉粒少，且均以典敗為主，碘染率均為0。相應(yīng)地，2個(gè)保持系豐源B-Pi9-5和豐源B田間結(jié)實(shí)正常，花粉育性正常(圖3)?？梢?，改良抗病不育系豐源A-Pi9-5不育性穩(wěn)定徹底，異交習(xí)性好，為實(shí)現(xiàn)三系配套應(yīng)用打下了基礎(chǔ)。

2.4 改良抗病不育系及其保持系主要農(nóng)藝產(chǎn)量性狀

主要農(nóng)藝及產(chǎn)量性狀的調(diào)查結(jié)果見表2。豐源A-Pi9-5及其保持系豐源B-Pi9-5的播始?xì)v期為86 d，比受體不育系豐源A及其保持系豐源B長2～3 d。改良不育系及其保持系的株高比相應(yīng)對照略有降低，但還是有90 cm左右、稍微偏高。兩組材料的葉形整體相似，葉片上舉。此外，豐源A-Pi9-5和豐源B-Pi9-5的田間株形緊湊。產(chǎn)量性狀方面，兩組材料的單株有效穗數(shù)和主穗長都很接近；而改良不育系(保持系)的單穗穎花數(shù)，比受體不育系(保持系)增加較明顯?？梢?，經(jīng)過多年多代連續(xù)回交，兩組材料在主要農(nóng)藝性狀上整體一致，產(chǎn)量性狀更好，實(shí)現(xiàn)了定向改良稻瘟病抗性的育種目標(biāo)。

表2 不育系和保持系主要農(nóng)藝產(chǎn)量性狀Tab.2 Main agronomic and yield traits of sterile lines and maintainers

3 討論與結(jié)論

水稻稻瘟病抗性是典型的質(zhì)量-數(shù)量性狀，抗病表型很大程度上受溫濕度、光照、病原菌等因素影響，因而通過表型選擇的傳統(tǒng)抗病育種效率低?；跇?biāo)記基因型鑒定的分子標(biāo)記輔助選擇(MAS)，能大大提高選擇準(zhǔn)確性和育種效率，近年來受到稻瘟病抗性育種者的青睞，如倪大虎等[10],利用分子標(biāo)記輔助選擇和田間/溫室抗性鑒定,將廣譜高抗白葉枯病的Xa21基因和高抗稻瘟病的Pi9(t)基因聚合到同一品系中,獲得雙基因純合且農(nóng)藝性狀穩(wěn)定的株系；殷所得等[11]利用Pi9基因結(jié)合田間農(nóng)藝性狀選擇和分子標(biāo)記輔助選擇,培育出抗稻瘟病性優(yōu)于親本的雜交組合；Jiang等[12]利用輔助選擇育種提高金23B的稻瘟病抗性；曹志等[13]以75-1-127(Pi9)、谷梅2號(Pi25)、谷梅4號(Pigm)、天津野生稻(Pi2-1和Pi51(t))、湘資3150(Pi47和Pi48)和魔王谷(Pi49)共6個(gè)廣譜抗稻瘟病水稻品種為供體親本，改良了水稻兩用核不育系C815S的稻瘟病抗性。此外，還有許多育種家通過MAS育種培育出了大量抗病水稻新品系或新種質(zhì)，如楊豐宇等[14]利用廣譜持久抗瘟基因Pigm定向改良早秈稻1701的稻瘟病抗性，育成一個(gè)遺傳背景與受體親本相似的抗瘟水稻新品系1701-Pigm；張禮霞等[15]通過雜交、回交并結(jié)合分子標(biāo)記輔助選擇，將Pigm基因?qū)胝?4B中以改良其稻瘟病抗性；Chen等[16]通過回交和基因聚合結(jié)合分子標(biāo)記輔助選擇(MAS)，將Pi49和Bph14、Bph15基因?qū)隤TGMS系C815S中，最后構(gòu)建了幾個(gè)改良的PTGMS系C815S；姜思達(dá)[17]利用Pi9基因的供體親本75-1-127與易感品種稻花香進(jìn)行雜交，使雜交后代攜帶Pi9基因以改良稻花香的稻瘟病抗性；劉樹芳等[18]采用回交的方法將2個(gè)廣譜抗稻瘟病的基因Piz-t和Pi9導(dǎo)入農(nóng)藝性狀優(yōu)良但稻瘟病抗性弱的云粳優(yōu)5號、云資粳41號和楚粳28號這3個(gè)品種中，以改良它們的抗稻瘟病特性；文紹山等[19]將廣譜高抗稻瘟病基因Pi-9(t)導(dǎo)入雜交水稻恢復(fù)系瀘恢17中，并選育出2個(gè)株葉型、抗稻瘟病及配合力較好，且農(nóng)業(yè)性狀已穩(wěn)定的株系WR1023和WR1056。豐源A是國內(nèi)早前由鄧應(yīng)德等[20]培育出的一個(gè)育性穩(wěn)定、配合力強(qiáng)、異交結(jié)實(shí)率高、米質(zhì)較優(yōu)、抗逆性較強(qiáng)的優(yōu)良秈型三系不育系，但由于稻瘟病抗性差等原因，沒有大面積推廣應(yīng)用。本研究利用已克隆的廣譜持久抗稻瘟病基因Pi-9的序列信息，開發(fā)了共顯性標(biāo)記ClonDF1R1，能高效區(qū)分純合體和雜合體。通過11a的連續(xù)回交MAS育種實(shí)踐,先后獲得高抗稻瘟病的新不育系豐源A-Pi9及其保持系豐源B-Pi9。通過田間不育系、異交習(xí)性和主要農(nóng)藝產(chǎn)量性狀分析，最終育成了綜合性狀優(yōu)良的抗病不育系豐源A-Pi9-5及其配套保持系豐源B-Pi9-5為三系配套利用雜種優(yōu)勢奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

接下來，將在本研究成果基礎(chǔ)上，利用獲得的改良不育系/保持系進(jìn)一步開展以下工作：使用更多的稻瘟菌菌株開展人工接種，進(jìn)一步明確改良不育系/保持系的抗菌譜；在不同生態(tài)稻區(qū)做稻瘟病抗性鑒定，尤其是穗瘟抗性鑒定，明確改良不育系/保持系及雜交種的適宜種植區(qū)域；利用改良不育系廣泛配組，盡快選配出抗病、優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、廣適性的強(qiáng)優(yōu)勢雜交組合應(yīng)用于生產(chǎn)，同時(shí)分析改良不育系與受體豐源A的恢復(fù)源是否發(fā)生變化。此外，筆者還將繼續(xù)利用Pi9基因改良其他骨干水稻親本的稻瘟病抗性，并開展多基因分子聚合育種實(shí)踐。