葉發(fā)慧，曹 東，趙彩霞，沈吉成，劉瑞娟，劉德梅，陳文杰，張懷剛

(1.中國(guó)科學(xué)院 高原生物適應(yīng)與進(jìn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)科學(xué)院 西北高原生物研究所，中國(guó)科學(xué)院 種子創(chuàng)新研究院，青海 西寧 810008；2.青海省作物分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810008；3.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049)

小麥品質(zhì)主要包括3個(gè)方面，外觀品質(zhì)、營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)和加工品質(zhì)，由于小麥的最終用途不同，對(duì)它的品質(zhì)要求也不相同[1]。其中最重要的便是小麥的加工品質(zhì)，它主要與小麥面粉加工的面團(tuán)的彈性和延展性等物理特征相關(guān)[2]。影響小麥加工品質(zhì)的主要因素是小麥胚乳中的儲(chǔ)藏蛋白。儲(chǔ)藏蛋白主要由醇溶蛋白、谷蛋白和 Avenin-like蛋白組成。醇溶蛋白是決定小麥面團(tuán)延展性的重要因素[3]，它是通過(guò)氫鍵、分子內(nèi)二硫鍵以及疏水性形成的單鏈蛋白，且無(wú)半胱氨酸殘基，可分為α、β、γ、ω 4種類型[4]。谷蛋白是通過(guò)分子間二硫鍵結(jié)合形成的高分子量線性聚合物，主要影響小麥面團(tuán)的粘彈性[3-4]。Avenin-like蛋白是2006年在小麥胚乳中發(fā)現(xiàn)的一種新型儲(chǔ)藏蛋白，對(duì)小麥面粉的彈性有重要影響[5]，可以提高小麥面粉的加工品質(zhì)。根據(jù)結(jié)構(gòu)的不同，Avenin-like蛋白可分為 a型和 b 型，a 型蛋白比 b 型蛋白少1個(gè)含120個(gè)氨基酸的重復(fù)序列[5]。b 型蛋白編碼284個(gè)氨基酸，其中包含18或19個(gè)半胱氨酸殘基，在 N 端和 C 端重復(fù)區(qū)有很高的保守性[5]。

微量摻粉試驗(yàn)是通過(guò)體外表達(dá)并純化得到目的蛋白，利用化學(xué)試劑將目的蛋白整合至基礎(chǔ)面粉，最終測(cè)定該混合面粉的品質(zhì)參數(shù)來(lái)評(píng)價(jià)其對(duì)小麥品質(zhì)貢獻(xiàn)。該方法常用于小麥谷蛋白亞基作用的評(píng)價(jià)中[6-8]，同樣也適用于Avenin-like蛋白的品質(zhì)評(píng)價(jià)，魏慧等[9]將國(guó)內(nèi)主栽小麥品種中的Avenin-like蛋白通過(guò)體外原核表達(dá)、純化后，進(jìn)行微量摻粉試驗(yàn)，證實(shí)該蛋白能有效提高面粉的加工品質(zhì)；同時(shí)發(fā)現(xiàn)Avenin-like基因較為保守，在供試的國(guó)內(nèi)小麥主栽品種中呈現(xiàn)很低的多態(tài)性。

節(jié)節(jié)麥(AegilopstauschiiCosson，DD，2n=2x=14)是普通小麥野生近緣物種，是普通小麥 D 染色體組的二倍體供體物種[10]。它豐富的遺傳多樣性可通過(guò)遠(yuǎn)緣雜交導(dǎo)入到普通小麥中，從而改良普通小麥品種。中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所麥類作物分子育種學(xué)科組前期從108份節(jié)節(jié)麥中鑒定了13個(gè)Avenin-like b基因新的變異類型，從分子層面解析了它們的核苷酸和氨基酸變異情況[11]。但是這些新變異類型對(duì)面粉加工品質(zhì)的影響還不得而知。

本研究通過(guò)大腸桿菌的體外誘導(dǎo)表達(dá)并抽提表達(dá)蛋白進(jìn)行微量摻粉試驗(yàn)，評(píng)價(jià)這些源自節(jié)節(jié)麥的新型 Avenin-like b蛋白對(duì)面粉加工品質(zhì)的影響。旨在鑒定優(yōu)異等位變異類型，為挑選能用于小麥優(yōu)質(zhì)育種的節(jié)節(jié)麥親本提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

本學(xué)科組前期鑒定的13個(gè)源自節(jié)節(jié)麥的Avenin-likeb基因(TaALPb7D-A、TaALPb7D-B、TaALPb7D-C、TaALPb7D-D、TaALPb7D-E、TaALPb7D-F、TaALPb7D-G、TaALPb7D-H、TaALPb7D-I、TaALPb7D-J、TaALPb7D-K、TaALPb7D-L、TaALPb7D-M)[11](表1)和已成功構(gòu)建的重組表達(dá)載體質(zhì)粒 pET32a-Avenin-likeb。

表1 13個(gè)Avenin-like b 基因及其對(duì)應(yīng)NCBI登錄號(hào)Tab.1 13 Avenin-like b genes and their NCBI accession numbers

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 重組蛋白的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)和包涵體蛋白純化 將pET32a-Avenin-likeb質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，挑選陽(yáng)性單菌落至 3 mL LB 液體培養(yǎng)基(卡那霉素)中，37 ℃ 培養(yǎng)過(guò)夜。取菌液 100 μL 接種于 100 mL LB 液體培養(yǎng)基(卡那霉素)中振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，取 100 mL 菌液接種于 2 000 mL LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600約 0.6，降低培養(yǎng)溫度到 30 ℃。加入 IPTG 誘導(dǎo)劑至終濃度0.5 mmol/L，30 ℃ 繼續(xù)振蕩培養(yǎng) 3～4 h，8 000 r/min離心3 min收集菌體，重懸于50 mL預(yù)冷NTA-0緩沖液中，冰浴30 min。超聲破碎菌體，參數(shù)設(shè)置為功率200 W、工作3 s、暫停4 s、時(shí)間25～30 min，16 000 r/min 4 ℃離心50 min，收集上清以及沉淀。取少量上清及沉淀進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，剩余上清及沉淀置于4 ℃保存?zhèn)溆?。使用純化試劑盒進(jìn)行包涵體蛋白純化。

1.2.2 包涵體蛋白復(fù)性和復(fù)性蛋白純化 以2倍體積的 3 mol/L鹽酸胍稀釋蛋白溶液，在 4 ℃ 環(huán)境下以注射器逐滴加入 200 mL 復(fù)性液(pH值8.0)中，轉(zhuǎn)速調(diào)節(jié)至最大，攪拌 24 h，降低轉(zhuǎn)速，攪拌24 h。取蛋白溶液于透析袋中，用PEG 20000 濃縮體積至50～100 mL。4 ℃ 在 PBS 緩沖液透析過(guò)夜，取蛋白溶液，以 PEG 20000 濃縮體積至 2～4 mL，4 ℃ 以 PBS 緩沖液透析過(guò)夜。取蛋白溶液進(jìn)行 SDS-PAGE 檢測(cè)。使用純化試劑盒進(jìn)行復(fù)性蛋白純化。

1.2.3 重組蛋白的品質(zhì)評(píng)價(jià) 用 10 g 微量粉質(zhì)儀對(duì)重組蛋白的品質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)。選用青海省主栽小麥品種高原448(GY448)的面粉為基礎(chǔ)面粉，進(jìn)行摻粉試驗(yàn)，具體方法參考魏慧等[9]。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 采用Excel繪制圖表，用SPSS 19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。不同處理間的比較采用Duncan′s新復(fù)極差法(P<0.01)。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化

將重組表達(dá)載體pET32a-Avenin-likeb轉(zhuǎn)化至BL21大腸桿菌中，經(jīng)過(guò) IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)，最終在離心沉淀物的包涵體蛋白中獲得Avenin-like b 蛋白(圖1)，13個(gè)基因的蛋白表達(dá)產(chǎn)物分別命名TaALPb7D-A～M。His SUMO tag 為 16 ku，Avenin-likeb基因編碼蛋白分子量約為 32 ku，因此，重組蛋白質(zhì)分子量約 48 ku。經(jīng) SDS-PAGE 檢測(cè)，重組蛋白分子量大小符合預(yù)期，Avenin-like b 蛋白成功誘導(dǎo)表達(dá)。

純化后的包涵體蛋白經(jīng)過(guò)滴定法復(fù)性后進(jìn)行 SDS-PAGE 檢測(cè)，結(jié)果顯示只有一條帶，融合蛋白的大小正常、純度較高，可進(jìn)行后續(xù)復(fù)性蛋白純化(圖1-B)。大量表達(dá)獲得的重組蛋白包涵體經(jīng)復(fù)性及 Ni-NTA 純化技術(shù)獲得重組蛋白 125 mg，純度達(dá) 85%。

2.2 重組蛋白的品質(zhì)評(píng)價(jià)

由表2可知，在TaALPb7D-A～M 13個(gè)表達(dá)產(chǎn)物中，只有DTT+ KIO3處理下粉質(zhì)的形成時(shí)間降低7 s，減少5.98%，而穩(wěn)定時(shí)間增加8.11%， 斷裂時(shí)間增加3.23%。其他各處理下粉質(zhì)的形成時(shí)間均極顯著提高，提高了12.82%～38.46%。其中TaALPb7D-F處理下粉質(zhì)的形成時(shí)間達(dá)到162 s，較GY448提高38.46%，且較各處理差異均極顯著(P<0.01)。

表2 節(jié)節(jié)麥中純化 Avenin-like b 蛋白粉質(zhì)參數(shù)Tab.2 Effect of purified Avenin-like b protein on the farinograph parameters

不同處理下粉質(zhì)參數(shù)的穩(wěn)定時(shí)間變化為111～160 s，較GY448各處理下蛋白質(zhì)粉質(zhì)的穩(wěn)定時(shí)間均提高，提高了22.52%～44.14%。其中DTT+ KIO3處理下粉質(zhì)的穩(wěn)定時(shí)間提高9 s，較GY448差異不顯著(P<0.01)；其他各處理較GY448穩(wěn)定時(shí)間均極顯著提高，其中TaALPb7D-F處理下粉質(zhì)參數(shù)穩(wěn)定時(shí)間為160 s，與GY448相比，穩(wěn)定時(shí)間提高44.14%，二者差異極顯著(P<0.01)。

與GY448相比，各處理下粉質(zhì)斷裂時(shí)間較穩(wěn)定時(shí)間、形成時(shí)間顯著提高，提高了16.67%～20.97%。其為186～225 s，各處理下粉質(zhì)的斷裂時(shí)間均增加，與GY448相比，DTT+ KIO3處理下粉質(zhì)斷裂時(shí)間差異不顯著，加入TaALPb7D-A～M處理下差異均極顯著(P<0.01)。TaALPb7D-F處理下粉質(zhì)斷裂時(shí)間最長(zhǎng)為225 s，且較GY448，斷裂時(shí)間極顯著提高20.97%(P<0.01)。

由表3可知，各處理下粉質(zhì)的穩(wěn)定時(shí)間變異系數(shù)最高為8.30%，穩(wěn)定時(shí)間次之為7.72%，斷裂時(shí)間變異系數(shù)最低為5.00%，說(shuō)明在不同添粉處理下形成時(shí)間和穩(wěn)定時(shí)間離散度較大；而斷裂時(shí)間離散度相對(duì)較小，性狀相對(duì)穩(wěn)定。即相較于對(duì)面團(tuán)斷裂時(shí)間影響的差異，不同類型的節(jié)節(jié)麥Avenin-like b蛋白對(duì)面團(tuán)的形成時(shí)間和穩(wěn)定時(shí)間影響的差異會(huì)更大一些。

表3 不同處理下各參數(shù)變異情況分析Tab.3 Analysis of the variation of various parameters under different treatments

3 討論與結(jié)論

品質(zhì)基因不同變異類型的功能評(píng)價(jià)，經(jīng)典的方法有基因工程法(轉(zhuǎn)基因)和多代回交構(gòu)建近等基因系法。但是這2種方法在小麥中應(yīng)用都比較困難，一是因?yàn)槠胀ㄐ←湹霓D(zhuǎn)基因效率比較低，二是由于相比其他模式植物(如擬南芥)，普通小麥生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)(較短時(shí)間內(nèi)獲得近等基因系困難)。而且，常規(guī)的小麥面粉品質(zhì)評(píng)價(jià)，需要足夠多的小麥種子來(lái)提供大量的面粉。而對(duì)于源自節(jié)節(jié)麥的Avenin-likeb基因新變異類型的品質(zhì)評(píng)價(jià)，若選用上述常規(guī)方法，無(wú)疑難度還會(huì)進(jìn)一步增加(涉及遠(yuǎn)緣雜交、繁殖效率等困難)。而像本研究采用體外蛋白質(zhì)微量摻粉試驗(yàn)[9-12]，可在篩選到Avenin-likeb基因新變異類型之后，立刻對(duì)其進(jìn)行體外原核表達(dá)，獲得微量蛋白即可初步檢測(cè)其品質(zhì)特性，實(shí)現(xiàn)Avenin-likeb基因新變異類型的高通量品質(zhì)評(píng)價(jià)，為優(yōu)良變異類型的高效育種利用贏得時(shí)間。

類燕麥貯藏蛋白(Avenin-like)最大特點(diǎn)是它們都含有較多的半胱氨酸殘基(Cys)，已報(bào)道的 Avenin-like b 普遍含有 18 個(gè)半胱氨酸[13-15]，較之前報(bào)道的小麥和燕麥貯藏蛋白都要多(麥醇溶蛋白和麥谷蛋白各自均含有不超過(guò)10個(gè)半胱氨酸殘基)。半胱氨酸殘基(Cys)是構(gòu)成蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間二硫鍵的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，二硫鍵在小麥貯藏蛋白結(jié)構(gòu)連接中占有重要地位。高分子量麥谷蛋白中半胱氨酸殘基的數(shù)量和所處的位置直接影響著面粉的烘烤品質(zhì)，含有優(yōu)質(zhì)亞基 1Dx5 的面粉之所以比含有普通1Dx2亞基的面粉烘烤品質(zhì)優(yōu)良，就是因?yàn)樵?1Dx5 亞基的中央重復(fù)區(qū)前部比 1Dx2 亞基多了一個(gè)半胱氨酸殘基[16-19]。魏慧等[9]在基礎(chǔ)粉中加入 Avenin-like 蛋白表達(dá)純化物后，小麥面粉的形成時(shí)間顯著提高了38.46%，面團(tuán)彈性顯著提升，其穩(wěn)定時(shí)間和斷裂時(shí)間也得到顯著提升。Ma等[20]通過(guò)對(duì)Avenin-like蛋白轉(zhuǎn)基因株系品質(zhì)測(cè)定也得出同樣的結(jié)論。本研究結(jié)果顯示，這13個(gè)源自節(jié)節(jié)麥的 Avenin-like b 蛋白均極顯著提高小麥面粉的形成時(shí)間、穩(wěn)定時(shí)間和斷裂時(shí)間，這與前人研究結(jié)果一致[9-12]。或許正是由于 Avenin-like b 蛋白中這些多達(dá)18個(gè)的半胱氨酸殘基幫助了面粉加工品質(zhì)的提升。

綜上所述，與小麥基礎(chǔ)面粉相比節(jié)節(jié)麥中的Avenin-like b 蛋白能極顯著提高普通小麥面粉的加工品質(zhì)。