易強，楊澤兵，譚家穎，侯憲斌，劉應紅，柏光曉，黃玉碧

(1.貴州大學 農(nóng)學院 玉米研究所，貴州 貴陽 550025；2.百色學院 農(nóng)業(yè)與食品工程學院，廣西 百色 533000；3.四川農(nóng)業(yè)大學 玉米研究所，四川 成都 611130；4.四川農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)學院，四川 成都 611130)

提高玉米(ZeamaysL.)耐密性是提高玉米單產(chǎn)的關(guān)鍵措施之一。單位面積玉米種植密度增加往往會導致玉米莖稈變細和倒伏率增加，從而導致產(chǎn)量降低[1-3]。種植密度和莖粗是影響玉米莖稈倒伏的主要因素之一；在高密度下，增加莖粗會降低莖稈倒伏的概率[4]。王鐵固等[5]基于2個玉米組合發(fā)現(xiàn)作為數(shù)量性狀的莖粗主要受到1對加性主基因+加性-顯性多基因模型或2對加性-顯性-上位性主基因+加性-顯性多基因混合遺傳模型的控制。目前，已有相關(guān)研究基于雙親的F2∶3[6]、重組自交系(RIL)[7]、BC6S6[8]、雙單倍體[9]、四交群體F2∶3家系[10]和關(guān)聯(lián)群體[11]等遺傳群體對玉米莖粗進行遺傳解析。徐蔚[6]利用來源掖478×R08的玉米F2∶3群體在四川省雅安市鑒定到1個2號染色體上的控制莖粗的主效數(shù)量性狀位點(QTL)。Hu等[7]以衍生于玉米組合B73×Ceo3005的RIL為試驗材料報道了一個位于bin5.03上同時控制寬和窄莖直徑的主效QTL。Mazaheri等[11]使用1個擴展版玉米關(guān)聯(lián)群體(942份自交系)進行莖粗全基因組關(guān)聯(lián)分析檢測到了8個與莖粗相關(guān)的候選基因，其中2個與花期相關(guān)候選基因(Zmm22和Fpa同源)的同源基因還影響擬南芥蓮座半徑。劉鵬飛[10]在高低密度下對1個玉米四交群體的莖粗及其系數(shù)進行QTL分析，發(fā)掘到2個影響莖粗系數(shù)的位點(bin3.01-3.02和bin10.03-10.04)，且后者增效基因來源于耐密型親本鄭58和PH6WC。此外，劉福鵬等[12]通過元分析方法得到20個與玉米莖粗相關(guān)的一致性QTL。盡管諸多研究對玉米莖粗進行了遺傳分析，但當前對莖粗響應密度的遺傳基礎報道仍較少。

現(xiàn)有關(guān)于玉米耐密性的QTL研究多集中于株型[13-19]、產(chǎn)量[20-23]和花期[13-14，24]等相關(guān)性狀。相較于玉米種植密度較高的我國中部和北部地區(qū)，作為我國第三大玉米產(chǎn)區(qū)的西南地區(qū)數(shù)十年來種植密度水平一直在低水平徘徊。特殊的地域環(huán)境使生產(chǎn)者偏好種植稀植大穗型玉米品種，且抗病和不耐密的熱帶種質(zhì)與PB種質(zhì)在該區(qū)域使用廣泛。因此，本研究利用來源于耐密型骨干自交系掖478和稀植型骨干系R08(或08-641，PB種質(zhì))的301個RIL在2014，2015年云南省景洪高低密度下測量莖粗，并在聯(lián)合環(huán)境下進行QTL定位、上位性分析、QTL與環(huán)境互作和QTL與密度互作，旨在為改良西南地區(qū)玉米耐密性和抗倒伏的遺傳基礎提供幫助。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

本研究采用的玉米RIL群體是通過來源于R08×掖478組合的單籽粒傳法構(gòu)建成的301個F8家系(RIL群體)[19-20]。玉米骨干親本掖 478株型緊湊、矮稈和穗位低，是典型的耐密和抗倒伏的自交系[10]。R08則為西南地區(qū)骨干自交系，具有配合力高、制種產(chǎn)量高和抗性較好等優(yōu)點。但R08株高較高，是西南地區(qū)典型稀植大穗型自交系。二者在多數(shù)株型和產(chǎn)量相關(guān)性狀上存在顯著差異[19-20]。

1.2 田間試驗設計和性狀調(diào)查

本研究將掖478、R08、掖478×R08及301個RIL種植于2014，2015年云南省景洪2種密度下，并測定莖粗。試驗采用完全隨機區(qū)組設計，2個重復，每個小區(qū)一行，行長 3 m。低密度為 57 000 株/hm2，高密度為 114 000 株/hm2。環(huán)境、播種、行株距及管理細節(jié)詳見參考文獻[19-20]。本試驗在RIL群體自然散粉后15 d開始在田間測量莖粗。從每行隨機選擇5個的植株(除邊株外)用電子游標卡尺測量植株地上部第3節(jié)窄截面的莖稈直徑(mm)[10]。

1.3 田間數(shù)據(jù)分析

將每個環(huán)境每個密度下得到的5個重復數(shù)值計算平均值，隨后將其用于雙親性狀差異顯著性和群體表型分布分析。利用SAS 9.4[25]統(tǒng)計學軟件中的混合線性模型PROC MIXED程序進行聯(lián)合方差分析。其中基因型、基因型與環(huán)境互作、基因型與密度互作為隨機因子，密度與環(huán)境和重復互作、密度與環(huán)境互作、環(huán)境和密度均為固定因子[20]。高低密度下莖粗以及莖粗與株型和產(chǎn)量相關(guān)性狀[19-20]的皮爾森相關(guān)系數(shù)是采用 SAS 9.4[25]的 PROC CORR程序?qū)β?lián)合環(huán)境下均值估算的。2種密度下基于家系均值的遺傳力是利用SAS 9.4[25]基于Holland等[26]方法進行估算的。對于高低密度下的莖粗數(shù)據(jù)，采用如下混合線性模型估計其最佳線性無偏預測值(BLUP)：Ymik=μ+Gm+GEmi+Ei+Rk+εmik。其中，Ymik為第i環(huán)境下第k個重復基因型m的表型值；μ是平均值；Gm為基因型m的效應值；GEmi表示第i個環(huán)境和基因型m的互作效應值；Ei為第i個環(huán)境的效應值；Rk為第k個重復的效應值；εmik為殘差。上述所有因子均被視為隨機因子。每個密度下RIL的BLUP隨后被用于QTL定位分析。BLUP分析采用R語言進行計算[27-28]。

1.4 遺傳圖譜的構(gòu)建

本研究遺傳圖譜參照先前的研究[19-20]。即從每個RIL隨機選取10顆種子播于育苗盤內(nèi)。做遮光處理育苗，7 d后剪下其葉片參照Chen等[29]的方法提取其全基因組DNA?；贛aizeSNP 3K芯片完成基因型分型[30]。根據(jù)所得到的SNP分型數(shù)據(jù)剔除雜合率和缺失率大于 20%以及偏分離嚴重的標記以及雜合率過高的自交系。最后獲得了301個RIL和 683個高質(zhì)量的SNP標記。用MapDisto 1.7.5[31]構(gòu)建遺傳連鎖圖譜。用Kosambi作圖函數(shù)轉(zhuǎn)換重組率為遺傳距離[32]。總遺傳圖譜長為1 786.06 cM。

1.5 QTL定位、上位性、QTL與環(huán)境及密度互作分析

本研究結(jié)合RIL群體基因型和BLUP值并采用基于復合區(qū)間作圖法(ICIM)的QTL ICIMapping軟件[33]進行 QTL定位分析。標記變量殘差表型逐步回歸中的掃描步長及輸入變量的P值分別設定為 1 cM和 0.001。去除變量的最大P值被假定為2倍的PIN值。閾值(LOD)由QTL ICIMapping作圖軟件ICM使用1 000次假設檢驗和0.05的Ⅰ型錯誤決定的。經(jīng)檢驗閾值為3.1。本研究也采用基于混合模型復合區(qū)間作圖(MCIM)的QTLNetwork 2.1軟件[34]對聯(lián)合環(huán)境的表型數(shù)據(jù)來檢測上位性互作、QTL與環(huán)境的互作、QTL與密度互作(由于密度處理類似于環(huán)境，故將2個密度視為2個環(huán)境)。

1.6 QTL片段在關(guān)聯(lián)群體的分布與衍生分析

利用Yang等[35]和Liu等[36]公布的540份自交系的關(guān)聯(lián)群體的基因型和雜優(yōu)類群對本研究中在高密度下檢測到的QTL區(qū)段內(nèi)的標記進行有利等位基因來源(與掖478或R08基因型相同的標記被視為來源相同)和片段相似成分分析。具體數(shù)據(jù)分析參考易強[37]的方法。對于部分掖478相關(guān)系基于系譜關(guān)系進行QTL衍生和傳遞分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 RIL群體的莖粗表現(xiàn)、聯(lián)合方差、遺傳力和相關(guān)分析

RIL群體的雙親掖478和R08的莖粗在同一密度下均未見顯著差異，但R08的莖粗隨著密度增加顯著變細(P<0.05，圖1-A)。這與稀植的R08對密度敏感的預期相符。高低密度下RIL群體的莖粗呈現(xiàn)出數(shù)量性狀的正態(tài)分布特征(圖1-B)。與R08響應密度趨勢類似，較低密度條件，高密度下RIL群體的莖粗變小，且其變異范圍縮小(高密度：13.4～16.1 mm vs 低密度：13.8～17.8 mm)。聯(lián)合方差分析結(jié)果顯示，所有因子包括基因型、基因型與環(huán)境、基因型與密度等均呈現(xiàn)極顯著水平(P<0.01，表1)。此外，高密度下莖粗遺傳力(48.01%)相較于低密度下(65.03%)有所降低。相關(guān)分析顯示，2種密度間RIL群體莖粗呈現(xiàn)出中等顯著相關(guān)(r=0.68***，P<0.000 1)。但不同密度下RIL群體莖粗與大多數(shù)農(nóng)藝性狀顯著相關(guān)(P<0.05，表2)。如高低密度下莖粗與株高、穗位高、單穗穗質(zhì)量呈極顯著正相關(guān)(0.29>r≥0.13，P<0.01)，而與空稈率、禿尖長相關(guān)性不顯著。這表明玉米耐密性是一個綜合性狀。

表2 2種密度下玉米RIL群體莖粗與其他農(nóng)藝性狀的皮爾森相關(guān)系數(shù)Tab.2 Pearson′s correlation coefficients between stem diameter and other agronomic traits under low and high planting densities in a maize RIL population

2.2 高低密度下RIL群體莖粗的QTL定位分析

本研究對高低密度下RIL群體莖粗分別進行聯(lián)合環(huán)境QTL定位分析，總計發(fā)現(xiàn)7個分布于1，3，4，6，7號染色體上的QTL(表3)。這些QTL的表型變異從3.81%～6.91%。其中，qSD1-1、qSD3-1和qSD4僅在高密度種植條件下被檢測到，證實這3個QTL均耐高種植密度。位于bin6.05上解釋表型變異達6%以上的qSD6同時在2種密度下被觀測到，且其增加莖粗的等位基因來源于R08。QTL與環(huán)境以及QTL與密度互作的結(jié)果未發(fā)現(xiàn)存在顯著的互作。此外，僅有1對位于1號和10號染色體上的位點顯示出加性與加性互作，且其貢獻率僅為0.89%(表4)。這些結(jié)果顯示，在高低密度下莖粗主要受到微效位點控制，而加性和加性互作等效應扮演著更次要的作用。

表2(續(xù))

表3 高低密度下RIL群體莖粗的QTL聯(lián)合環(huán)境定位分析Tab.3 QTL for stem diameter in the RIL population under low and high densities via joint analysis across two environments

表4 高密度下RIL群體莖粗上位性互作分析Tab.4 Analysis of epistatic interaction for SD in the RIL population under high planting density

2.3 高密度下QTL在關(guān)聯(lián)群體里面的分布和衍生情況

本研究聚焦于高密度下鑒定的qSD1-1、qSD3-1、qSD4和qSD6。除qSD4外，其余3個QTL的增效等位基因均來源于R08。因此，選取這4個QTL觀測其在前人報道的關(guān)聯(lián)群體[35-36]的分布情況(圖2)。從結(jié)果來看，掖478所在的混群(Mix)和R08所在非堅稈群(NSS)在含有利等位基因的QTL區(qū)段比例不存在差異，這顯示這些區(qū)段可能未受到選擇。但堅稈群(SS)在這些區(qū)段上可能受到一定選擇。本研究檢測到在7個QTL區(qū)段中至少3個QTL區(qū)段內(nèi)來源于掖478的片段衍生或傳遞率超過70%的自交系達到12個(表5)。除4019、BEM、XUN971和黃C外，其余自交系均為掖478相關(guān)系。如從U8112和沈5003聚衍至掖478，再傳遞至其他相關(guān)系。這進一步強調(diào)骨干自交系掖478重要區(qū)段衍生傳遞保持自身莖粗相關(guān)QTL的特點。

表5 莖粗相關(guān)QTL在掖478相關(guān)系間的傳遞率Tab.5 Transmission rate of QTL for stem diameter among Ye478-related lines

3 結(jié)論與討論

本研究以高低密度下RIL群體莖粗為對象挖掘影響玉米莖粗的位點。研究表明，雙親和RIL的莖粗變異縮小及其遺傳力下降的趨勢符合預期，與早前報道的其他性狀[19-24]相類似。隨著群體密度增大，個體間光、熱、水和肥競爭壓力也隨之增大[38-39]。2種密度下RIL群體的莖粗與株高、穗位高和單穗穗質(zhì)量等極顯著相關(guān)，而與空稈率和禿尖長等不顯著，這與劉鵬飛[10]報道類似。盡管莖粗可能不是評價玉米耐密性的核心指標，但近來研究[11，40-43]顯示，玉米莖稈強度和莖粗等與玉米抗倒伏和抗蟲害等相關(guān)。因此，解析玉米莖稈性狀遺傳基礎對玉米抗逆性仍具有重要意義。

本研究挖掘到7個分布于bin1.01、1.07、3.04(2個)、4.05、6.05和7.02上的控制莖粗的QTL，其中部分QTL在前人研究中也有報道。由于劉福鵬等[12]已收集和整理來自17個不同作圖群體的玉米莖粗QTL信息并進行了元分析，因此，本研究未再做Meta分析。本研究低密度下在bin7.02上qSD7與上述研究[12]報道的MQTL13相重合。本研究結(jié)果中在2種密度均被觀測到的qSD6與徐蔚[6]利用相同來源R08×掖478的F2∶3群體在2個環(huán)境下檢測到的位點定位到同一區(qū)域，但多數(shù)QTL未發(fā)現(xiàn)有重疊。這證實了家系純合度、標記數(shù)目、定位群體大小和代數(shù)及環(huán)境數(shù)等對QTL定位會產(chǎn)生影響[44-45]。此外，在低密度下位于bin1.07的qSD1-2附近，Zhang等[41]基于關(guān)聯(lián)群體檢測到一個與莖粗顯著相關(guān)的PZE-101172517。在該bin上，劉鵬飛[10]用四交群體F2∶3家系報道了在一個單環(huán)境高密度下控制莖粗的qSD-E2-1。盡管眾多研究報道了低密度下大量莖粗QTL，但對于高密度下莖稈性狀相關(guān)報道較少。本研究僅發(fā)現(xiàn)一個密度不敏感的qSD6，預示著高低密度下莖粗存在不同遺傳調(diào)節(jié)。因此，提高高種植密度條件下玉米莖稈抗倒伏能力，未來仍需對高種植密度脅迫下遺傳來源廣泛的玉米自然群體的莖稈性狀進行遺傳解析。此外，本研究未檢測到顯著性的QTL與環(huán)境以及QTL與密度互作位點，這可能與莖粗遺傳力低(相同來源的F2∶3群體中僅略大于45%[6]；高低種植密度下RIL群體中分別為48.01%和65.03%)和受環(huán)境影響大有關(guān)。劉鵬飛[10]僅鑒定到一個環(huán)境穩(wěn)定QTL，而徐蔚[6]在4個環(huán)境下未能發(fā)現(xiàn)一致性莖粗QTL。本研究顯示，莖粗主要受多個微效單位點控制，同時部分受加性與加性互作效應影響，這與前人研究[7，10]略有不同；故全基因分析和選擇可能是較為有效選擇莖粗的分子輔助手段。

結(jié)合筆者之前的報道[19-20]，部分影響莖粗的位點也位于多效性QTL區(qū)域。在高種植密度下，qSD3-1影響籽粒寬和穗行數(shù)；在低密度下，qSD3-2控制容重和穗行數(shù)[20]。在bin4.05上，qSD3-2被囊括在影響雄穗分支(高低種植密度)、穗上葉高(高種植密度)和穗上葉長(低種植密度)的多效性區(qū)段上[19]。位于bin6.05上2種密度下都檢測到的qSD6影響穗上葉長(低種植密度)、節(jié)間長(高種植密度)、雄穗分支數(shù)(高種植密度)、出籽率(低種植密度)、單穗籽粒質(zhì)量(低種植密度)和百粒質(zhì)量(高低種植密度)[19-20]。低密度特異性qSD7包含在一個影響葉長、葉高、空稈率、出籽率和每行穗粒數(shù)的多效性位點中[19-20]。因此，通過選擇這些多效性位點可間接實現(xiàn)玉米耐密性遺傳改良。

盡管本研究多數(shù)QTL在廣泛遺傳背景下的遺傳效應未得到證實，但從片段比例選擇角度出發(fā)，這些區(qū)段并未受到選擇。這可能與抗倒伏相關(guān)性狀長期不是育種家的主要目標性狀有關(guān)。即便骨干親本掖478相關(guān)系中這些區(qū)段較為保守，這很可能是選擇其他主要農(nóng)藝性狀一因多效的結(jié)果。隨著生產(chǎn)中對玉米抗倒伏和抗蟲害等能力的重視，針對莖稈強度性狀的選育將逐漸成為育種家的目標之一。