王喜周，李凌云，周 武

（1.麗水學(xué)院職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江麗水 323000；2.麗水市人民醫(yī)院，浙江麗水 323000；3.嘉興學(xué)院醫(yī)學(xué)院，浙江嘉興 314001）

長鏈非編碼RNA（Long non-coding RNA,LncRNA）是指長度大于200 nt、缺少或無開放閱讀編碼框（opening reading frame，ORF）不表達(dá)蛋白質(zhì)的基因。與編碼蛋白質(zhì)的基因相比，這類基因物種間的保守序列低、具有更高的組織器官特異性并且不一定都帶多聚腺苷酸尾巴[1]。H19是一類特殊的長鏈非編碼RNA，是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的印跡基因。所謂印跡基因是指同源基因在表達(dá)時(shí)，只有一方的等位基因進(jìn)行表達(dá)，來自另外一個(gè)親本的等位基因不表達(dá)或者表達(dá)極弱[2]。人H19基因位于11號染色體p15.5位置，是母源性的印跡基因，只有mRNA的表達(dá)，不編碼蛋白質(zhì)。

可變剪接,也稱選擇性剪接(alternative splicing)，是基因轉(zhuǎn)錄為mRNA前體（pre-mRNA）之后，在mRNA加工成熟過程中出現(xiàn)的一種多樣性的剪接方式。一般情況下，前體mRNA的加工成熟是剪除所有內(nèi)含子，留下外顯子，外顯子再連接形成成熟的mRNA。在此過程中，如果出現(xiàn)不同的剪接方式，就會出現(xiàn)成熟mRNA的可變剪接體，這些剪接體稱為剪接異構(gòu)體[3-4]?？勺兗艚硬坏l(fā)生在編碼基因上，也發(fā)生在非編碼基因上。長鏈非編碼基因的可變剪接是長鏈非編碼基因進(jìn)行調(diào)控的重要手段，長鏈非編碼基因的異?？勺兗艚訒?dǎo)致多種疾病的發(fā)生，特別是癌癥[5]。

乳腺癌是女性中發(fā)病率最高的癌癥，是女性的“第一殺手”，嚴(yán)重威脅著女性的身體健康。盡管近年來乳腺癌的死亡率出現(xiàn)下降趨勢，但對乳腺癌的治療仍然面臨著巨大的挑戰(zhàn)。本研究利用幾株常用的乳腺癌細(xì)胞系細(xì)胞，對乳腺癌中長鏈非編碼RNA H19（H19LncRNA）的可變剪接情況進(jìn)行鑒定，為進(jìn)一步研究H19LncRNA的各剪接體介導(dǎo)乳腺癌中腫瘤發(fā)生發(fā)展各階段的作用提供理論依據(jù)，從而為乳腺癌的治療指明新的研究方向。

1 材料與方法

1.1 材料

ZR-75-30、T-47D、BT-474、MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，所有細(xì)胞培養(yǎng)于添加10%胎牛血清和雙抗的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液，置于5%CO2含量的37℃培養(yǎng)箱。

1.2 方法

1.2.1 套式PCR反應(yīng)

設(shè)計(jì)并合成針對H19的套式擴(kuò)增引物（#1 F：5’-AGTTAGAAAAAGCCCGGGC-3’，R:5’-GCAG GGTGAGGGAGGGGGTGGGAT-3’；#2 F：5’-CTTC AGCAGGAGCCCTGGACTCA-3’#2 R：5’-TGTGCC CCTCCCCACCAGGGCTTC-3’），以各細(xì)胞提取的DNA為模板，設(shè)定如下程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增（94℃2 min，98℃15 s-60℃30 s-68℃1.5 min 15 cycles,68℃5 min）。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后，參照OMEGA膠回收試劑盒說明書對目的條帶進(jìn)行回收。回收后條帶經(jīng)純化后送至上海生工公司測序。

1.2.2 5’RACE和3’RACE檢測

提取MCF細(xì)胞總RNA，以21 Nanodrop檢測RNA純度及濃度，普通瓊脂糖凝膠電泳（1.5%）分析RNA完整性之后，QIAGEN逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA合成，通過RACE引物（#3:5’-GTCCTAGCC CGGGCTTTTCTA-3’#4:5’-GTCCAGGGCTCCTGCT GAAG-3’）進(jìn)行RACE檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 RACE分析及引物設(shè)計(jì)

H19LncRNA的可變剪接與癌癥相關(guān)性的研究不多，乳腺癌中是否存在H19LncRNA的可變剪接體尚未見報(bào)道。我們根據(jù)H19LncRNA的UTR序列，通過設(shè)計(jì)巢式PCR引物（圖1），對H19全長cDNA序列進(jìn)行擴(kuò)增，以期發(fā)現(xiàn)新的H19剪接體。因?yàn)橐陨系某彩揭镂挥贖19mRNA的UTR區(qū)域，為了避免H19在5’端和3’端存在其他的轉(zhuǎn)錄起始和終止位點(diǎn)而漏檢，我們在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了5’端和3’端的RACE分析。在表達(dá)H19的乳腺癌細(xì)胞MEF7中，5’端（引物#3）和3’端（引物#4）的RACE分析結(jié)果顯示：它們的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物都是單一的條帶（圖2），說明在前體mRNA區(qū)域內(nèi)，H19不存在其他的轉(zhuǎn)錄起始或終止位點(diǎn)。

圖1 H19LncRNA的結(jié)構(gòu)及引物設(shè)計(jì)

圖2 RACE分析

2.2 H19LncRNA剪接體在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)

通過以上設(shè)計(jì)的巢式引物，我們在幾種常用的乳腺癌細(xì)胞系細(xì)胞中對H19LncRNA的可變剪接情況進(jìn)行了檢測。如圖3所示，各乳腺癌細(xì)胞中的PCR產(chǎn)物表現(xiàn)為7種大小不一的片段。經(jīng)進(jìn)一步測序比對，這7條片段分別為H19的1條成熟mRNA（H19mRNA）和6種不同的可變剪接形式（圖4）。

圖3 H19在乳腺癌中的可變剪接

圖4 H19各剪接體示意圖

各剪接體的剪接位點(diǎn)和剪接產(chǎn)物具有一定的特征。與成熟的全長mRNA相比，剪接體H19-AS1、H19-AS2、H19-AS3、H19-AS4、H19-AS5的剪接方式表現(xiàn)為可選擇的5’剪接位點(diǎn)。其中，剪接體H19-AS1、H19-AS2、H19-AS3是在外顯子1上進(jìn)行的5’剪接位點(diǎn)的可變剪接，可變剪接位點(diǎn)分別是5867、5960和6649；剪接體H19-AS4則是在外顯子2上可變剪接位點(diǎn)7019處進(jìn)行的可變剪接；而剪接體H19-AS5則是在外顯子5上可變剪接位點(diǎn)7621處進(jìn)行的可變剪接。另外，與成熟的全長mRNA相比，剪接體H19-AS6則是在外顯子1上進(jìn)行的3’剪接位點(diǎn)的可變剪接，剪接位點(diǎn)為5861。

3 結(jié)論與討論

H19是人類最早發(fā)現(xiàn)的印跡基因。研究表明，H19在多種腫瘤中呈現(xiàn)高表達(dá)，H19LncRNA參與了腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中多個(gè)方面的調(diào)控，包括腫瘤細(xì)胞增殖、腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移、腫瘤細(xì)胞干性維持、腫瘤代謝、腫瘤耐藥、腫瘤血管生成以及腫瘤自噬調(diào)控等等[6]。然而，在不同癌癥中H19的作用機(jī)制有所差別。比如：H19可與miR-675形成復(fù)合物，通過調(diào)節(jié)Fas相關(guān)蛋白與死亡結(jié)構(gòu)域（FADD）的表達(dá)介導(dǎo)胃癌的發(fā)生[7]。H19也可通過“分子海綿”的作用吸附miR-138分子，從而增強(qiáng)結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力[8]。本研究中，我們在乳腺癌細(xì)胞中鑒定出H19的6種可變剪接體，提示乳腺癌與H19的可變剪接有關(guān)。

關(guān)于H19的可變剪接研究不多，已發(fā)現(xiàn)的H19可變剪接體主要包括外顯子4缺失[9]和外顯子1部分缺失[10]兩類。這兩類已報(bào)道的可變剪接體主要是在胚胎或者正常組織中的存在形式，而本研究則以乳腺癌細(xì)胞為研究對象，通過巢式引物的設(shè)計(jì)，PCR鑒定出H19的新剪接體。這些新的剪接體在各細(xì)胞中存在的類型各不相同。ZR-75-30細(xì)胞中有三種剪接體AS2、AS3和AS5，T-47D細(xì)胞中鑒定出AS1、AS4和AS6三種可變剪接體，BT-474和MCF-7細(xì)胞中存在AS1、AS4和AS5三種可變剪接體，而MDA-MB-231細(xì)胞中則只有AS2和AS6兩種可變剪接體，并且，ZR-75-30和BT-474細(xì)胞中沒有鑒定出全長的成熟H19mRNA（圖3）。

由于腫瘤存在異質(zhì)性的特征，不同的腫瘤細(xì)胞甚或是同一腫瘤的不同細(xì)胞，其侵襲轉(zhuǎn)移能力都存在一定差別。在對乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，相關(guān)基因的選擇性剪接及其選擇性剪接后的相應(yīng)產(chǎn)物，對乳腺癌的腫瘤轉(zhuǎn)移、侵襲具有重要的作用。這些基因包括原癌基因Mdm2、C-erbB-2，抑癌基因PTEN，雌激素受體β（ERβ），凋亡抑制蛋白Survivin等。乳腺癌相關(guān)基因的選擇性剪接作為乳腺癌發(fā)生發(fā)展的特征，新型選擇性剪接異構(gòu)體的發(fā)現(xiàn)和鑒定正成為乳腺癌診斷和治療的新策略。本研究結(jié)果提示不同的剪接體有可能介導(dǎo)不同的腫瘤發(fā)生發(fā)展過程，勢必有利于闡明選擇性剪接對腫瘤發(fā)生發(fā)展的調(diào)控機(jī)制，對乳腺癌和其他腫瘤的發(fā)病機(jī)理、診斷和治療提供更多更有利的參考。