許嘉豪,陳淑雯,謝珠良,徐鐵成,方建斌,朱卓麗,李雄娟△,黃煥森△

1廣州醫(yī)科大學(xué)第二臨床學(xué)院麻醉系(廣東廣州 510180)；2廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院麻醉科(廣東廣州 510260)

免疫球蛋白結(jié)合蛋白(binding immunoglobulin protein，Bip)廣泛表達(dá)在細(xì)胞內(nèi)[1-2]，是一種多功能的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶，作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中未折疊蛋白反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)蛋白，其最重要的功能是依賴ATP結(jié)合內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中新生多肽的疏水性口袋，組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)新生肽聚集，參與蛋白質(zhì)的正確折疊和轉(zhuǎn)運(yùn)[3]。目前相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，烏司他丁在缺血性腦損傷等器官保護(hù)中具有重要作用[4]。有研究表明，烏司他丁可降低百草枯中毒模型大鼠海馬中Bip的表達(dá)量[5]，表明烏司他丁與Bip之間可能存在相互作用。但是目前關(guān)于烏司他丁與Bip相互作用關(guān)系的研究甚少，且無相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道兩者之間分子對(duì)接的模擬情況。因此，2019年10月至2020年5月，本研究選用SD大鼠建立大腦中動(dòng)脈栓塞(MCAO)模型，采用酶標(biāo)儀測定大鼠血清、缺血腦組織中烏司他丁和Bip的濃度，通過烏司他丁與Bip分子的體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)，并使用PyMOL軟件及分子模擬軟件構(gòu)建烏司他丁與Bip分子對(duì)接情況進(jìn)行分析，探討烏司他丁與Bip的相互作用，為進(jìn)一步明確烏司他丁在臨床上的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 雄性SD大鼠36只，由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體重220～250 g。隨機(jī)分為正常組、實(shí)驗(yàn)組。正常組為18只大鼠，經(jīng)靜脈注射烏司他丁20萬IU/kg。實(shí)驗(yàn)組選取18只大鼠，建立大鼠MCAO模型后隨即靜脈注射烏司他丁20萬IU/kg。烏司他丁為廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)。

1.2 MCAO模型制備 稱量大鼠體重，采用腹腔注射10%水合氯醛300 mg/kg對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉，待大鼠完全麻醉后將其腹部朝上固定在手術(shù)臺(tái)上。剃毛器剃掉大鼠頸部毛發(fā)并消毒，在頸部正中縱向剪開一個(gè)長約25 mm的切口，鈍性分離肌肉和組織。之后鈍性分離出左側(cè)頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈。找到頸總動(dòng)脈并游離出距離頸內(nèi)動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈分叉口約10～15 mm的長度，結(jié)扎頸總動(dòng)脈近心端并穿線備用。結(jié)扎頸外動(dòng)脈。用動(dòng)脈夾夾住頸內(nèi)動(dòng)脈遠(yuǎn)心端，之后快速在距頸總動(dòng)脈結(jié)扎處3 mm處剪一斜切口。將事先做好的線栓自切口輕輕插入，松開血管夾，插入深度約為18～20 mm,稍遇阻力時(shí)停止。此時(shí)為缺血開始時(shí)間，記錄時(shí)間，同時(shí)經(jīng)靜脈注射烏司他丁20萬IU/kg。在斜向切口遠(yuǎn)心端結(jié)扎并固定線栓，將線栓多余的部分縫合在切口之間，最后縫合手術(shù)切口。在手術(shù)2 h后將線栓拔出。在大鼠麻醉狀態(tài)下，剪開手術(shù)切口縫線，鈍性分離組織，用鑷子夾取線栓輕輕拔出，再次結(jié)扎切口遠(yuǎn)心端并縫合手術(shù)切口。手術(shù)后將大鼠放置在溫暖、安靜、避強(qiáng)光的單獨(dú)鼠籠中飼養(yǎng)。

1.3 組織樣本采集 在給藥后0.5、3、24 h，兩組大鼠分別各隨機(jī)選取6只，麻醉后取頸靜脈血，血液樣品置于肝素化抽血管中，離心后取血清備用。取血后立即處死大鼠，端頭取腦，腦組織用生理鹽水沖凈表面血液和內(nèi)容物，濾紙吸干后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 大鼠血清與腦組織中烏司他丁濃度的測定 參考文獻(xiàn)[6]的方法，采用酶標(biāo)儀測定大鼠血清與腦組織中烏司他丁濃度。取用酶標(biāo)板，使用PBS按適當(dāng)比例將各組大鼠缺血側(cè)大腦皮層低溫物理快速勻漿，離心后取上清。按一定比例稀釋血清、腦組織上清液至180 μL后，加入結(jié)晶胰蛋白酶溶液20 μL。每孔終體積為200 μL?；靹蚝?7℃保溫5 min，每孔加入BAPNA溶液100 μL，搖勻后37℃孵育5 min，設(shè)定波長在405 nm處檢測吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測定樣品中烏司他丁濃度。采用三乙醇胺、生理鹽水作為空白對(duì)照。

1.5 大鼠血清與腦組織Bip濃度的測定 取各組大鼠血清、缺血側(cè)大腦皮質(zhì)上清液樣品，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)，使用大鼠免疫球蛋白結(jié)合蛋白ELISA試劑盒(酶免，China)，按照試劑盒操作說明書操作，測定兩組大鼠血清及缺血側(cè)大腦皮質(zhì)Bip的濃度。

1.6 烏司他丁與Bip的體外結(jié)合實(shí)驗(yàn) 取烏司他丁標(biāo)準(zhǔn)品(1 000 IU/mL)及Bip標(biāo)準(zhǔn)品(80 pg/mL)各200 μL混合，使得溶液終濃度為：烏司他丁500 IU/mL + Bip 40 pg/mL。將此混合溶液再依次稀釋為：烏司他丁250 IU/mL + Bip 20 pg/mL、烏司他丁125 IU/mL+Bip 10 pg/mL、烏司他丁62.5 IU/mL+Bip 5 pg/mL、烏司他丁31.25 IU/mL+Bip 2.5 pg/mL。采用上述酶標(biāo)儀法、ELISA法分別測定混合液中烏司他丁、Bip濃度，根據(jù)測定結(jié)果計(jì)算兩者的結(jié)合率。

1.7 計(jì)算機(jī)分子模擬烏司他丁與Bip的結(jié)合 Bip三維結(jié)構(gòu)來自RCSB PDB數(shù)據(jù)庫(PDB ID:5e84)；烏司他丁三維結(jié)構(gòu)來自PubChem(CID:105102)，利用Open Babel GUI對(duì)烏司他丁進(jìn)行格式轉(zhuǎn)換。參照文獻(xiàn)[7]的方法，使用分子對(duì)接模擬軟件(Autodock4.2.6)對(duì)Bip進(jìn)行加氫，計(jì)算Gasteiger電荷，對(duì)烏司他丁進(jìn)行操作，完成后進(jìn)行分子半柔性對(duì)接，使用算法為Local Search Parameters，得出對(duì)接結(jié)果。并利用PyMOL軟件構(gòu)建對(duì)接結(jié)果。最后，從對(duì)接得到的結(jié)合構(gòu)象中取出結(jié)合能最小值的構(gòu)象用于之后的分析。并使用分子模擬軟件(DS BIOVIA Discovery Studio 2016 v16.1)，逐一點(diǎn)擊Tools/Receptor-Ligand Interacions/View Interaction Ligands，對(duì)其進(jìn)行對(duì)接，得出Bip與烏司他丁殘基二維相互作用情況。

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血清、缺血大腦皮質(zhì)的烏司他丁及Bip濃度變化 在血清樣品中，正常組、實(shí)驗(yàn)組烏司他丁的濃度均隨時(shí)間延長而降低，同時(shí)也觀察到實(shí)驗(yàn)組中烏司他丁濃度在0.5 h較正常組升高(P<0.05)。在缺血側(cè)大腦皮質(zhì)中，正常組、實(shí)驗(yàn)組烏司他丁濃度均在3 h較高，24 h后降低(P<0.05)，同時(shí)在0.5 h中觀察到實(shí)驗(yàn)組烏司他丁濃度較正常組降低(P<0.05)。血清中Bip濃度在正常組、實(shí)驗(yàn)組各個(gè)觀察時(shí)間點(diǎn)中均沒有明顯變化(P>0.05)；而在缺血側(cè)大腦皮質(zhì)中，可觀察到實(shí)驗(yàn)組缺血側(cè)大腦皮質(zhì)中Bip濃度在3 h中降低，24 h升高(P<0.05)，同時(shí)在3 h中觀察到實(shí)驗(yàn)組大腦皮質(zhì)中Bip濃度較正常組低(P<0.05)。見表1。

表1 兩組大鼠在0.5、3、24 h中血清、缺血大腦皮質(zhì)中烏司他丁及Bip濃度變化

2.2 烏司他丁與Bip結(jié)合率 在烏司他丁與Bip體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)中，已知混合液中烏司他丁濃度分別為：31.25、62.5、125、250、500 IU/mL，實(shí)際測定濃度分別為：(30.90±1.51)、(54.24±4.14)、(74.64±3.79)、(124.44±11.35)、(221.06±22.36)IU/mL。已知混合液中Bip濃度分別為：2.5、5、10、20、40 pg/mL，實(shí)際測定濃度分別為：(2.42±0.35)、(3.61±0.21)、(6.09±0.62)、(12.47±1.73)、(18.86±1.09)pg/mL。烏司他丁與Bip結(jié)合曲線下移，在一定濃度范圍內(nèi)，計(jì)算得出兩者結(jié)合率為44%～62%。見圖1。

圖1 烏司他丁與Bip的結(jié)合曲線

2.3 計(jì)算機(jī)分子模擬烏司他丁與Bip的結(jié)合情況 烏司他丁與Bip中的殘基Asp-94、Thr-38、Thr-37、Gly-36、Ser-40、Thr-171、Ser-64、Ser-146、Pro-173、Phe-93、Phe-176、Val-172、Val-92、Ile-145、Thr-184、Val-66、Tyr-65、Pro-142有范德華力作用，與殘基Ala-95、Val-149、Lys-96、Ile-99、Leu-35產(chǎn)生共軛作用。見圖2。

3 討論

本研究參照文獻(xiàn)[7]的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)。我們的前期實(shí)驗(yàn)采用酶標(biāo)儀法測定烏司他丁濃度，根據(jù)線性關(guān)系實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其相關(guān)系數(shù)R2均≥0.98，證明線性關(guān)系良好，測定精密度和重復(fù)性較好。

本研究結(jié)果顯示，正常組、實(shí)驗(yàn)組血清中烏司他丁濃度隨時(shí)間延長而降低，符合烏司他丁的藥代動(dòng)力學(xué)改變。在0.5 h，實(shí)驗(yàn)組血清中烏司他丁的濃度較對(duì)照組高，但缺血側(cè)大腦皮質(zhì)烏司他丁濃度則較正常組降低(約降低50%)，表明實(shí)驗(yàn)組在腦缺血模型建立后使得血流動(dòng)力學(xué)改變，導(dǎo)致患側(cè)大腦皮層缺血，血流減少，使得腦組織中烏司他丁濃度降低。在缺血再灌注后，大腦皮層血液灌流得以部分恢復(fù)，可觀察到腦組織中烏司他丁濃度在3 h升高，24 h降低。有研究指出，缺血中風(fēng)性大鼠梗死灶腦血流在1 h后下降至對(duì)照組的45%[8]。也有研究表明，在局灶性腦缺血發(fā)生時(shí)，在血流降低最嚴(yán)重的腦組織血流量會(huì)銳減至正常腦血流量的20%或完全沒有血流，從而形成梗死核心區(qū)[9]。缺血半影區(qū)由于側(cè)支循環(huán)的存在依然能保持一定的血液供給[10]。因此，缺血后即給予烏司他丁靜脈注射，可通過血流作用于缺血半影區(qū)，對(duì)缺血性腦組織可能起到一定的保護(hù)作用。

注：A：烏司他丁殘基與Bip對(duì)接模型圖；B：烏司他丁殘基與Bip分子對(duì)接2D示意圖圖2 PyMOL軟件及分子模擬軟件構(gòu)建烏司他丁、Bip分子對(duì)接情況

本研究結(jié)果顯示，在0.5、3、24 h 3個(gè)觀察時(shí)間點(diǎn)，正常組、實(shí)驗(yàn)組大鼠血清Bip的濃度無變化，提示Bip作為一種廣泛表達(dá)在細(xì)胞內(nèi)的分子伴侶，主要作用于細(xì)胞內(nèi)，較少通過細(xì)胞膜及血腦屏障釋放至血液循環(huán)中。本實(shí)驗(yàn)觀察到，在缺血再灌注3 h，實(shí)驗(yàn)組缺血大腦皮質(zhì)Bip濃度較0.5 h下降，提示存在Bip的消耗或?yàn)跛舅⌒纬山Y(jié)合物，導(dǎo)致ELISA法無法測定結(jié)合狀態(tài)的Bip濃度。隨后觀察到Bip濃度在24 h升高，一方面可能是由于烏司他丁逐步代謝，與Bip解離，使游離狀態(tài)的Bip增多，另一方面可能是由于缺血缺氧后應(yīng)激反應(yīng)啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄和翻譯，使得缺血大腦皮質(zhì)Bip表達(dá)升高。有研究表明，缺血缺氧可引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，細(xì)胞調(diào)亡與Bip等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子表達(dá)量的改變有關(guān)[11-13]。因此，Bip的含量改變與腦缺血再灌注損傷有關(guān)。

本研究分子對(duì)接軟件模擬結(jié)果也顯示，烏司他丁與Bip中的殘基可形成范德華力及共軛作用，但烏司他丁未能與周圍殘基形成氫鍵，因此無法形成穩(wěn)定的復(fù)合物。有文獻(xiàn)指出，烏司他丁可提高腦缺血再灌注模型大鼠腦皮質(zhì)中Bip 的表達(dá)量[14]，提示兩者可能存在某種直接或間接作用。同時(shí)在實(shí)驗(yàn)中觀察到烏司他丁與Bip的結(jié)合率約為50%，表明兩者確實(shí)存在結(jié)合作用。

綜上所述，在缺血大腦皮質(zhì)中烏司他丁可與Bip形成不穩(wěn)定復(fù)合物，其可能通過影響B(tài)ip的表達(dá)而在腦缺血再灌注中發(fā)揮著一定作用。