楊 麗，孫浩元，張俊環(huán)，閆愛玲，姜鳳超，張美玲，王玉柱

(1.北京市林業(yè)果樹科學(xué)研究院,北京 100093；2.北京市落葉果樹工程技術(shù)研究中心，北京 100093；3.國家林業(yè)和草原局杏工程技術(shù)研究中心，北京 100093)

杏是原產(chǎn)中國的古老果樹樹種，目前廣泛分布于世界各地，種質(zhì)資源十分豐富，據(jù)統(tǒng)計(jì)，世界上的杏約有10～12個(gè)種[1]，被用作鮮食、仁用、觀賞、砧木等多種用途。杏和李同為薔薇科(Rosaceae)李屬(PrunusL.)植物，親緣關(guān)系近，在長期生長、進(jìn)化和栽培利用過程中，二者之間形成了許多天然或人工雜交種質(zhì)。如紫杏(P.dasycarpaEhrh.)是以櫻桃李(P.cerasiferaEhrh.)為母本與普通杏(P.armeniacaL.)種間雜交天然形成[2]，杏李是李與普通杏多代雜交選育而來[3-5]。牟蘊(yùn)慧等[6]利用李杏遠(yuǎn)緣雜交育成杏新品種‘龍園甜杏’?，F(xiàn)有研究表明杏為二倍體[7-9]，而不同種的李則有倍性的差異，中國李(P.salicinaLindl.)、美洲李(P.americanaL.)、櫻桃李、烏蘇里李(P.ussuriensisKov.&kost)、杏李 (P.simoniiCarr.)(不同于遠(yuǎn)緣雜交杏李)為二倍體、黑刺李(P.spinosaL.)為四倍體、歐洲李(P.domesticaL.)為六倍體[10]。果樹多倍體具有生長旺盛、果實(shí)大且少籽或無籽、產(chǎn)量高、適應(yīng)性和抗性強(qiáng)等特點(diǎn)，且能夠利用無性繁殖的方式固定其優(yōu)良性狀，使之保持穩(wěn)定而不分離，在生產(chǎn)上長期利用，因此果樹多倍體的發(fā)掘、培育與利用是果樹育種的重要內(nèi)容[11]。果樹多倍體可以通過自然變異、人工誘導(dǎo)或有性雜交產(chǎn)生。蒲富慎等[7]和林盛華等[8]用染色體計(jì)數(shù)法對(duì)150個(gè)李品種和422個(gè)杏品種進(jìn)行倍性鑒定，發(fā)現(xiàn)來自高寒地區(qū)的2份中國李三倍體種質(zhì)資源和1份三倍體杏種質(zhì)資源‘泰安杏梅’；蘋果、梨、棗、山楂等果樹樹種中均有通過自然變異選育出的多倍體品種[11]。

多倍體砧木能夠誘導(dǎo)嫁接植株矮化，提高植株對(duì)干旱、低溫、缺鐵、鹽害及重金屬等非生物脅迫的耐受能力[12]。由于砧木對(duì)果樹生長、適應(yīng)性、抗性、果實(shí)品質(zhì)和產(chǎn)量等具有諸多重要影響[13]，在過去的30余年里，發(fā)達(dá)國家核果類果樹栽培從利用實(shí)生砧木向重視無性系砧木轉(zhuǎn)變[14]，加速了遠(yuǎn)緣雜交種和李屬其他種作為桃、杏、李、櫻桃等核果類果樹樹種砧木的應(yīng)用，一些易于無性繁殖且具有矮化作用的李、杏砧木得到廣泛應(yīng)用[15]。中國李、杏砧木研究起步較晚，與世界發(fā)達(dá)國家差距較大，生產(chǎn)上長期沿用普通杏、山杏、山桃和李等實(shí)生砧木，缺乏無性系砧木良種，生產(chǎn)的果品商品性不高，制約了產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[16]。為此，北京市林業(yè)果樹科學(xué)研究院從歐洲引進(jìn)了一批具有矮化、易無性繁殖、適應(yīng)性強(qiáng)等特性的李杏砧木。

流式細(xì)胞術(shù)(Flow cytometry, 簡稱FCM)是20世紀(jì)70年代發(fā)展起來的一種集激光技術(shù)、光電測量技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)、流體力學(xué)以及細(xì)胞免疫熒光化學(xué)技術(shù)為一體的細(xì)胞分析技術(shù)，目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)、生物化學(xué)等多個(gè)研究領(lǐng)域[17]。植物倍性鑒定是植物資源評(píng)價(jià)的重要內(nèi)容，對(duì)于植物資源的開發(fā)利用具有重要意義。在植物倍性鑒定研究中，流式細(xì)胞術(shù)與傳統(tǒng)染色體計(jì)數(shù)法、形態(tài)觀察法相比，具有操作技術(shù)簡單、用時(shí)短、效率高、鑒定結(jié)果準(zhǔn)確等特點(diǎn)，因此，自1987年Delaat等[18]首次報(bào)道使用流式細(xì)胞術(shù)鑒定植物倍性以來，該方法已成為鑒定植物倍性的常用方法[19]，中國許多學(xué)者利用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)不同樹種進(jìn)行了倍性鑒定研究。如韓莎等[20]對(duì)不同倍性桑樹品種及經(jīng)過秋水仙堿或60Co-γ射線誘導(dǎo)的桑樹誘變植株進(jìn)行倍性鑒定，并與染色體計(jì)數(shù)結(jié)果進(jìn)行比較；趙奉彬等[21]進(jìn)行11種楊屬植物的倍性鑒定，并確定了山楊天然三倍體；趙青等[22]確定5種木蘭科植物的DNA-C值及其倍性；此外，流式細(xì)胞術(shù)也被應(yīng)用于蘋果[23]、獼猴桃[24]、桃[25]、梨[26-27]和香蕉[28-29]等果樹樹種及櫻桃砧木[30]的倍性鑒定。

本研究以150份杏、7份李和9份引進(jìn)李杏砧木資源為試材，利用流式細(xì)胞術(shù)開展倍性鑒定，以明確其倍性水平，發(fā)掘多倍體資源，為進(jìn)一步開展相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以150份杏(編號(hào)1-150)、7份李(編號(hào)151-157)、9份引進(jìn)砧木(編號(hào)158-166)種質(zhì)資源幼嫩葉片為試材，采集生長季節(jié)新梢頂部初展葉片，分別用自來水和蒸餾水沖洗干凈，吸水紙吸干表面水分，備用。所有材料均采自北京市林業(yè)果樹科學(xué)研究院杏和李種質(zhì)資源圃，栽培管理水平一致。150份杏資源包括普通杏及其變種、西伯利亞杏及其變種、仁用杏、紫杏和遼杏等種質(zhì)類型；7份李資源包括杏李、黑刺李和歐洲李等種質(zhì)類型；9份砧木資源包括烏荊子李、遠(yuǎn)緣雜交種質(zhì)和未知類型種質(zhì)。

1.2 試驗(yàn)方法

2 結(jié)果與分析

2.1 流式細(xì)胞術(shù)鑒定150份杏樣品DNA相對(duì)含量與倍性水平

以二倍體‘巴斗’為外標(biāo)，利用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)150份杏種質(zhì)資源進(jìn)行倍性鑒定結(jié)果見表1。由表1可知，供試150份杏樣品CV值為1.80～ 5.10，數(shù)據(jù)質(zhì)量較好；G0/G1期熒光強(qiáng)度峰值 36.81～56.39，DNA相對(duì)含量77.07%～ 118.07%，樣品與對(duì)照G0/G1期熒光強(qiáng)度峰值比值均近似1，全部為二倍體。

表1 以二倍體‘巴斗’為參照的150份杏種質(zhì)資源的FCM分析Table 1 FCM analysis of 150 accessions of apricot germplasm resources with diploid ‘Badou’ as external reference

(續(xù)表1 Continued table 1)

(續(xù)表1 Continued table 1)

2.2 流式細(xì)胞術(shù)鑒定16份杏近緣植物種質(zhì)資源DNA相對(duì)含量與倍性水平

以‘巴斗’為外標(biāo)，利用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)16份杏近緣種質(zhì)資源進(jìn)行倍性鑒定，結(jié)果見表2。由表2可知，供試16份樣品CV值為1.80～4.65，數(shù)據(jù)質(zhì)量較好；G0/G1期熒光強(qiáng)度均值為36.38～162.83， DNA相對(duì)含量為76.17%～ 340.93%，其中杏李品種‘坤洛紅美’、雜交杏李品種‘味帝’‘味厚’‘風(fēng)味玫瑰’及李杏砧木品種‘HY-KL-A’‘KR.’‘PU.’‘ISHTRAR’‘L2’的G0/G1期熒光強(qiáng)度峰值與‘巴斗’相近，位于橫坐標(biāo)50左右位置，其倍性水平與‘巴斗’相同，為二倍體；李杏砧木品種‘JASPI’的G0/G1期熒光強(qiáng)度峰值位于橫坐標(biāo)100左右，其倍性水平是‘巴斗’的二倍，為四倍體；歐洲李品種‘VALOR’‘OULINSKA’、黑刺李及李杏砧木品種‘ FE.’‘GF655-2’和‘S2’的G0/G1期熒光強(qiáng)度峰值位于橫坐標(biāo)150左右，其倍性水平是‘巴斗’的三倍，為六倍體。

表2 以二倍體‘巴斗’為參照的16份杏近緣種的FCM分析Table 2 FCM analysis of 16 accessions from wild relatives of apricot with diploid ‘Badou’ as external reference

部分樣品熒光強(qiáng)度直方圖結(jié)果見圖1。圖1中直方圖每個(gè)通道的核數(shù)量，直觀地反應(yīng)了相對(duì)的熒光強(qiáng)度值，同時(shí)表示每個(gè)樣品的DNA相對(duì)含量。圖中橫坐標(biāo)代表DNA相對(duì)含量，縱坐標(biāo)代表細(xì)胞核數(shù)量。圖1-a為流式細(xì)胞術(shù)對(duì)二倍體杏品種‘巴斗’鑒定結(jié)果，可見其G0/G1期峰值位于橫坐標(biāo)50左右位置；圖1-b、1-c、1-d分別為‘味帝’‘坤洛紅美’和‘L2’流式細(xì)胞術(shù)鑒定結(jié)果， G0/G1期峰值在橫坐標(biāo)位置均與‘巴斗’相近，為二倍體；圖1-e為‘JASPI’流式細(xì)胞術(shù)鑒定結(jié)果， G0/G1期峰值在橫坐標(biāo)100左右位置，是對(duì)照‘巴斗’的二倍，為四倍體；圖1-f為‘S2’ 流式細(xì)胞術(shù)鑒定結(jié)果，G0/G1期峰值在橫坐標(biāo)150左右位置，是對(duì)照‘巴斗’的三倍，為六倍體。

3 討論與結(jié)論

3.1 對(duì)照樣品與試驗(yàn)材料選擇

應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)進(jìn)行常規(guī)的倍性鑒定分析時(shí)，多采用外標(biāo)(External reference/Separate standard)，即參照樣本獨(dú)立檢測，參照樣本一般應(yīng)滿足倍性已知、與目標(biāo)樣本染色體結(jié)構(gòu)相似兩個(gè)條件[32]。本研究選擇杏品種二倍體‘巴斗’為參照樣本，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)鑒定出150份杏及16份杏近緣植物種質(zhì)資源倍性。

關(guān)于試驗(yàn)材料，利用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行倍性鑒定多選擇分生能力強(qiáng)、雜質(zhì)含量相對(duì)較少、比較容易取得的植物器官，如組培苗、莖尖、休眠枝條水培獲得的嫩葉等。本研究選用田間自然生長的幼嫩葉片，材料供應(yīng)時(shí)間長、數(shù)量多、取材容易；因?yàn)閷?shí)驗(yàn)室距離采樣地點(diǎn)近，所有材料均是即采即清洗后即用，檢測時(shí)碎片峰少、熒光強(qiáng)度峰清晰，效果較好。若檢測樣本量大、采樣地點(diǎn)距離遙遠(yuǎn)，試驗(yàn)材料需要低溫保存，但保存時(shí)間不宜過長[9]。

3.2 利用流式細(xì)胞術(shù)鑒定植物倍性水平結(jié)果的判斷

目前，利用染色體計(jì)數(shù)法鑒定植物倍性水平最為直接、可靠，但是該方法對(duì)試驗(yàn)材料、操作技術(shù)都有較高要求，且過程繁瑣、效率較低；利用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行倍性鑒定，可以短時(shí)間內(nèi)完成較多樣本檢測，大大提高了工作效率，且通過前人對(duì)桑[20]、蘋果[23]、櫻桃砧木[30]等樹種應(yīng)用染色體計(jì)數(shù)法與流式細(xì)胞術(shù)倍性鑒定結(jié)果進(jìn)行比較，證明了后者的可靠性。

但是用于流式細(xì)胞術(shù)的試驗(yàn)材料多為生長、分裂旺盛的植物器官，如嫩葉，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行倍性檢測時(shí)，其G2/M期熒光強(qiáng)度峰值 G0/G1期2倍熒光強(qiáng)度峰值重疊，造成混倍體的假象，影響對(duì)樣本倍性的判斷。為此，本研究通過增加樣本檢測重復(fù)次數(shù)、增加每次檢測細(xì)胞數(shù)量以及與對(duì)照樣品峰值的比較等措施來判斷檢測樣本的倍性，提高了準(zhǔn)確性。

3.3 杏及其近緣植物倍性鑒定與多倍體砧木的發(fā)現(xiàn)

蒲富慎等[7]觀察普通杏和西伯利亞杏2個(gè)類型的18份杏種質(zhì)資源染色體數(shù)目，皆為二倍體；林盛華等[8]利用染色體計(jì)數(shù)法對(duì)中國5個(gè)種422份杏種質(zhì)資源進(jìn)行倍性鑒定，發(fā)現(xiàn)除‘泰安杏梅’為三倍體外，其他均為二倍體，而后續(xù)研究[10,33]證明‘泰安杏梅’為李與杏的雜交種質(zhì),且與李的親緣關(guān)系更近；李雯雯等[9]用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行新疆野杏兩個(gè)居群20份樣品的倍性鑒定，供試樣品均為二倍體。本研究用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)來自中國東北、華北、西北生態(tài)群及日本、美國和歐洲的150份杏種質(zhì)資源進(jìn)行倍性鑒定，供試樣品皆為二倍體，沒有發(fā)現(xiàn)多倍體或嵌合體資源。本研究與前人研究[7-10.33]相比，試驗(yàn)材料地理分布更廣泛、基因型更豐富。

蒲富慎等[7]觀察16份李種質(zhì)資源染色體數(shù)目，結(jié)果表明只有歐洲李品種‘晚黑’為六倍體，其余包括中國李、美洲李、櫻桃李、烏蘇里李和沙櫻李×歐洲李等5個(gè)類型的15份資源均為二倍體。本研究所用7份李資源中，2份歐洲李為六倍體，1份杏李為二倍體，與前人報(bào)道[2,10]一致；1份黑刺李資源為六倍體，與前人報(bào)道[2,10]不同，可能是供試材料個(gè)體差異導(dǎo)致，其原因有待進(jìn)一步明確；3份以李與普通杏多代人工雜交獲得的杏李資源均為二倍體，此前未見對(duì)該類型李資源倍性鑒定報(bào)道。據(jù)報(bào)道，3個(gè)杏李品種‘味厚’[3]‘味帝’[4]和‘風(fēng)味玫瑰’[5]都是歐洲李與普通杏的雜交后代，本研究結(jié)果證明這一觀點(diǎn)是錯(cuò)誤的：歐洲李為六倍體、普通杏為二倍體，其后代不應(yīng)為二倍體；歐洲李遺傳基礎(chǔ)狹窄，不易與其他李種雜交[10]，與杏雜交更困難，因此引進(jìn)杏李資源的親本有待進(jìn)一步明確。

本研究通過對(duì)9份引進(jìn)的李杏砧木資源的倍性鑒定，發(fā)現(xiàn)4份多倍體資源，未來經(jīng)過進(jìn)一步研究，比如觀察它們?cè)谥袊煌貐^(qū)的表現(xiàn)、適應(yīng)性、與栽培品種嫁接親和性及對(duì)生長結(jié)果的影響等，有望對(duì)中國李、杏矮化密植和抗逆栽培起到積極作用，進(jìn)而促進(jìn)產(chǎn)業(yè)發(fā)展。